Ne pas

Jun 17, 2023

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1290 (2022) Citer cet article

909 accès

1 Citations

3 Altmétrique

Détails des métriques

Les bactéries et Eucarya utilisent la voie non oxydante des pentoses phosphates pour diriger les fractions ribose des nucléosides vers le métabolisme central du carbone. De nombreuses archées ne possèdent pas cette voie, et à la place, les Thermococcales utilisent une voie de pentose bisphosphate impliquant la ribose-1,5-bisphosphate (R15P) isomérase et la ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP) carboxylase/oxygénase (Rubisco). Curieusement, plusieurs génomes d'archaea halophiles semblent n'héberger que l'isomérase R15P et n'hébergent pas Rubisco. Dans cette étude, nous identifions une voie de dégradation des nucléosides auparavant non reconnue dans les archées halophiles, composée de guanosine phosphorylase, de ribose-1-phosphate kinase ATP-dépendante, d'isomérase R15P, de RuBP phosphatase, de ribulose-1-phosphate aldolase et de glycolaldéhyde réductase. La voie convertit le fragment ribose de la guanosine en phosphate de dihydroxyacétone et en éthylène glycol. Bien que la voie métabolique de la guanosine au RuBP via R15P soit similaire à celle de la voie des pentoses bisphosphates chez les Thermococcales, la voie en aval n'utilise pas Rubisco et est unique aux archées halophiles.

Il est bien établi que les archées présentent des enzymes et des voies métaboliques uniques que l'on ne trouve pas chez les bactéries et les eucaries1,2,3. Un exemple représentatif est le métabolisme des pentoses. Les bactéries et les eucaryotes utilisent la voie des pentoses phosphates4 pour synthétiser ou dégrader les fractions pentoses des acides nucléiques. La voie oxydative des pentoses phosphates (voie OPP) synthétise les précurseurs d'acide nucléique ribulose 5-phosphate (Ru5P) et ribose 5-phosphate (R5P) à partir de glucose 6-phosphate et fournit des équivalents réducteurs sous forme de NADPH. La voie non oxydative des pentoses phosphates (voie NOPP) réalise l'interconversion entre les pentoses (Ru5P et R5P) et le fructose 6-phosphate et le glycéraldéhyde 3-phosphate et peut ainsi convertir les fractions ribose des nucléosides en intermédiaires du métabolisme central du carbone (Fig. .1a). Cependant, de nombreuses archées ne possèdent pas les voies OPP et NOPP. Ils utilisent à la place la voie du monophosphate de ribulose (RuMP) pour produire les pentoses nécessaires à la biosynthèse des acides nucléiques5,6,7, convertissant le fructose 6-phosphate en Ru5P et en formaldéhyde. À titre d'exception, la plupart des archées halophiles possèdent la voie OPP7,8,9,10, tandis qu'un certain nombre d'espèces d'archées, notamment des membres de Thermoplasmatota, Thaumarchaeota, Halorhabdus, Methanococcus et Methanocaldococcus, devraient abriter des homologues de gènes constituant la voie NOPP. Il convient toutefois de noter que bien que Methanocaldococcus jannaschii abrite à la fois la voie NOPP et la voie RuMP11, R5P semble être généré par la voie RuMP12.

En ce qui concerne la dégradation des nucléosides, l'archéon hyperthermophile Thermococcus kodakarensis utilise une voie des pentoses bisphosphates13,14,15 (Fig. 1a et Fig. 1b supplémentaire). Les métabolites de la voie diffèrent grandement de ceux de la voie des pentoses phosphates et un certain nombre d'enzymes uniques sont impliquées. Comme chez les bactéries et les eucaryotes, les nucléosides sont convertis en ribose-1-phosphates (R1P) et en nucléobases par trois nucléosides phosphorylases qui reconnaissent l'uridine, la guanosine et l'adénosine (TK1479, TK1482 et TK1895, respectivement). Alors que R1P est converti en R5P dans la voie des pentoses phosphates, R1P est phosphorylé par une ribose-1-phosphate kinase dépendante de l'ADP (ADP-R1PK; TK2029) chez T. kodakarensis, générant du ribose-1,5-bisphosphate (R15P). L'isomérase R15P (TK0185) convertit ensuite R15P en ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP), qui est ensuite converti en 3-phosphoglycérate (3-PGA) par l'activité carboxylase de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (Rubisco ; TK2290)16,17,18,19. T. kodakarensis abrite également une nucléoside-5'-monophosphate phosphorylase unique (NMP phosphorylase, précédemment désignée AMP phosphorylase ; TK0352) qui catalyse la phosphorolyse de l'AMP, du CMP et de l'UMP14,15. Cela permet la conversion directe des NMP en R15P, ainsi que la conversion des nucléosides en NMP via R1P et R15P (Fig. 1a et Fig. 1b supplémentaire). R15P agit ainsi comme un nœud qui relie le métabolisme des nucléosides et des nucléotides au métabolisme central du carbone13,20.

a La voie classique des pentoses bisphosphates identifiée chez Thermococcus devrait être impliquée dans la dégradation des nucléosides et/ou la conversion des nucléosides en NMP. Le shunt NMP, composé de NMP phosphorylase, d'isomérase R15P et de Rubisco, dégrade les NMP en 3-PGA. b La voie non carboxylante des pentoses bisphosphates proposée dans cette étude est illustrée. Les flèches rouges indiquent des réactions spécifiques à la voie identifiée dans cette étude et absentes de la voie classique des pentoses bisphosphates. Les étiquettes de locus codant pour les enzymes dont les protéines recombinantes ont été examinées dans cette étude sont présentées. Les étiquettes de locus entre parenthèses sont des gènes censés coder pour des enzymes dont les activités ont été détectées dans l'extrait acellulaire de H. salinarum. En ce qui concerne VNG_6270G, les enzymes natives et recombinantes ont été étudiées. NMP nucléoside-5'-monophosphate, R1P ribose-1-phosphate, R15P ribose-1,5-bisphosphate, RuBP ribulose-1,5-bisphosphate, 3-PGA 3-phosphoglycérate, Ru1P ribulose-1-phosphate, DHAP dihydroxyacétone phosphate .

Lorsque la distribution de la voie des pentoses bisphosphates est examinée, des homologues de la NMP phosphorylase, de l'isomérase R15P et de Rubisco se trouvent dans une large gamme d'archées; la plupart des membres des Archaeoglobales, Lokiarchaeota, Methanomicrobiales, Methanosarcinales et Thermococcales ainsi que certains membres des Desulfurococcales, Halobacteriales, Methanococcales et la plupart des espèces de Thermofilum des Thermoproteales. De plus, il a été récemment rapporté que l'analyse métagénomique suggérait la présence de ces gènes dans un certain nombre d'espèces bactériennes21. Cela soulève la possibilité que cette partie de la voie des pentoses bisphosphates, que nous appelons ici le "shunt NMP", fonctionne dans de nombreuses espèces archées et certaines espèces bactériennes. D'autre part, la distribution des homologues de l'ADP-R1PK semble être limitée aux membres des Thermococcales, qui comprennent les genres Palaeococcus, Pyrococcus et Thermococcus. Cependant, il est bien connu que les kinases dépendantes de l'ADP chez les Thermococcales ont des homologues dans d'autres archées qui dépendent de l'ATP en tant que donneur de phosphate. Celles-ci incluent les glucokinases22,23,24 et les phosphofructokinases25,26 dans la glycolyse, la sérine kinase dans le métabolisme des acides aminés27,28 et même la kinase R1P elle-même13,29. Ces kinases dépendantes de l'ATP et de l'ADP qui reconnaissent le même accepteur de phosphate ne présentent généralement pas de similitude entre elles. Par conséquent, il est difficile de conclure avec précision la distribution de l'activité de la kinase R1P basée uniquement sur les séquences du génome. Il existe un grand nombre de protéines dans les archées qui sont annotées comme des kinases de sucre dont les accepteurs de phosphate n'ont pas été identifiés, et celles-ci pourraient inclure des kinases R1P non identifiées.

Curieusement, nous avons constaté qu'un certain nombre d'archées halophiles hébergent des homologues de l'isomérase R15P, mais n'ont pas d'homologues pour la NMP phosphorylase et Rubisco. De plus, des homologues clairs de la kinase R1P ne sont présents dans aucun des génomes halophiles. Les séquences du génome suggèrent donc que dans ces halophiles, il n'y a pas d'enzymes qui fourniraient le substrat ou utiliseraient le produit de la R15P isomérase. Dans cette étude, nous avons recherché des enzymes liées à l'isomérase R15P apparemment autonome et avons identifié une voie métabolique jusque-là inconnue impliquant les pentoses bisphosphates R15P et RuBP dans les archées halophiles.

Cette étude a été lancée avant la découverte de l'ensemble de la voie des pentoses bisphosphates, alors que seule une voie des NMP au 3-PGA consistant en NMP phosphorylase, R15P isomérase et Rubisco était connue14,15 (Fig. 1a). Un certain nombre d'espèces d'archées abritaient des homologues des trois enzymes, mais curieusement, certaines archées halophiles n'abritaient que des homologues de l'isomérase R15P15. Ceux-ci incluent Halobacterium salinarum qui possède la protéine VNG_1853G, qui est identique à 48,1 % à l'isomérase R15P de T. kodakarensis (TK0185), mais n'héberge pas d'homologues de la NMP phosphorylase ni de Rubisco. Parmi les 63 archées halophiles présentées dans le tableau 1, de tels cas sont observés chez 19 espèces (tableau 1, rouge ou orange dans la colonne VNG_1853G). D'autre part, 14 archées halophiles abritent un ensemble complet d'homologues (en bleu dans les colonnes TK0352/VNG_1853G/TK2290), tandis que 11 espèces ne possèdent que des homologues de l'isomérase R15P et Rubisco (en vert dans les colonnes VNG_1853G/TK2290).

Nous avons examiné si les homologues de la R15P isomérase catalysent réellement la réaction de la ribose-1,5-bisphosphate isomérase. Les gènes correspondants de H. salinarum (VNG_1853G) et Haloterrigena turkmenica (Htur_0571) ont été surexprimés dans Escherichia coli. Seule la protéine Htur_0571 de H. turkmenica a pu être obtenue sous une forme soluble et a été purifiée jusqu'à homogénéité apparente (Fig. 2a supplémentaire). RuBP a été généré à partir de R15P en présence de protéine Htur_0571 purifiée (Fig. 2a), indiquant que la protéine présentait une activité isomérase R15P et était désignée isomérase Ht-R15P. Le résultat a suggéré la présence de voies inconnues impliquant R15P et RuBP dans les archées halophiles.

a En présence ou en l'absence de l'enzyme isomérase Ht-R15P, la génération de RuBP à partir de R15P a été étudiée. Les lignes noires, roses, bleues et vertes indiquent le produit de réaction sans l'enzyme, celui avec l'enzyme, le composé standard R15P 20 mM et le composé standard RuBP 10 mM, respectivement. b En présence ou en l'absence de la protéine Hx-RbsK, la génération de R15P à partir de R1P a été examinée. Les lignes noires, roses, bleues et vertes indiquent le produit de réaction sans l'enzyme, celui avec l'enzyme, le composé standard R1P 10 mM et le composé standard R15P 20 mM, respectivement. c La conversion de R1P avec les protéines isomérases Hx-RbsK et Ht-R15P a été examinée. Après la réaction kinase par Hx-RbsK, la réaction isomérase par Ht-R15P isomérase a été réalisée. Le produit de la réaction a été analysé par HPLC. Les lignes roses et noires indiquent les produits de réaction avec et sans isomérase Ht-R15P dans la deuxième réaction, respectivement. Les composés séparés avec une colonne ont été surveillés avec un détecteur à indice de réfraction différentiel.

Afin d'identifier les enzymes impliquées dans le métabolisme du R15P ou du RuBP, des gènes candidats ont été recherchés à partir des séquences du génome. Les archées halophiles avec l'homologue autonome de l'isomérase R15P comprennent H. salinarum30, Halopiger xanaduensis31, Halorubrum lacusprofundi32, H. turkmenica33, l'archéon halophile DL31, Natrinema pellirubrum, Natronobacterium gregoryi et Natronococcus occultus. Nous avons recherché des gènes formant un opéron avec l'homologue de l'isomérase R15P chez ces 8 espèces et avons constaté que les gènes annotés comme "sugar kinase, ribokinase"/"protéine du domaine PfkB" (rbsK) formaient des opérons avec les homologues de l'isomérase R15P dans les huit cas, tandis que Les gènes "uridine phosphorylase" (urdpase) ont formé des opérons dans six cas (Fig. 3). Parmi les 19 génomes qui hébergent un homologue de la R15P isomérase mais pas un homologue de la Rubisco et de la NMP phosphorylase, tous, à l'exception de Halorhabdus tiamatea, possèdent à la fois des homologues rbsK et urdpase (tableau 1, colonnes VNG_1851G/VNG_1850G). Cela suggère que les deux produits géniques sont métaboliquement liés à l'isomérase R15P.

Les codes couleur des gènes pertinents sont indiqués sur la figure. Les cases blanches et à flèches grises sont des gènes formant très probablement des opérons avec les cinq gènes ciblés. Dans les cases à flèches grises, la longueur du gène n'est pas reflétée sur la largeur de chaque case à flèches. Les flèches noires indiquent les opérons prédits.

Des protéines RbsK recombinantes de H. salinarum, H. turkmenica et H. xanaduensis (Hs-RbsK, Ht-RbsK et Hx-RbsK codées par VNG_1851G, Htur_0569 et Halxa_1682, respectivement) ont été produites dans E. coli. Hs-RbsK formait des corps d'inclusion et les niveaux d'expression du gène Ht-RbsK étaient faibles. Des quantités suffisantes de protéine Hx-RbsK soluble ont été obtenues et partiellement purifiées (Fig. 3a supplémentaire). Les activités kinase de la protéine Hx-RbsK partiellement purifiée ont été testées sur divers substrats accepteurs de phosphate (tableau supplémentaire 1) en utilisant de l'ATP ou un mélange de nucléosides triphosphates (NTP) comme donneur de phosphate (Fig. 4 supplémentaire). Nous avons examiné 85 substrats comprenant des nucléosides, des aldoses, des sucres aminés, des alcools, des cétoses, des nucléotides, des phosphates de sucre, des disaccharides, des alcools de sucre et des sucres désoxy. Une fois normalisée par le temps de réaction et la quantité d'enzyme, la production de nucléoside-5'-diphosphate (NDP) était la plus élevée avec le ribose-1-phosphate (R1P) (468 nmol ADP min-1 mg-1). Nous nous abstenons de désigner les valeurs de ces mesures comme des vitesses de réaction, car la vitesse de formation du produit n'est pas nécessairement constante tout au long de la période de réaction. La valeur suivante la plus élevée a été observée avec le xylulose (62 nmol NDP min−1 mg−1), suivi de la 2'-désoxyguanosine (57 nmol NDP min−1 mg−1) et du d-ribulose (49 nmol NDP min−1 mg− 1). La protéine recombinante Hx-RbsK a été purifiée pour d'autres analyses biochimiques (Fig. 2b supplémentaire). En utilisant R1P comme accepteur de phosphate, l'enzyme a préféré l'ATP parmi les NTP (Fig. 5a supplémentaire). L'analyse HPLC du produit de réaction Hx-RbsK a indiqué que R15P était généré à partir de R1P (Fig. 2b). De plus, le produit Hx-RbsK, R15P, a été isomérisé en RuBP par l'isomérase Ht-R15P (Fig. 2c). Hx-RbsK nécessitait du sel pour son activité kinase, et 2,0 M était la concentration optimale de KCl (Fig. 5b supplémentaire). En présence d'ATP 4 mM et de R1P 20 mM, nous avons observé une activité spécifique de 30,1 μmol min-1 mg-1. Les analyses sur la protéine Halxa_1682 ont indiqué que la protéine Hx-RbsK est une ribose-1-phosphate kinase dépendante de l'ATP (ATP-R1PK) générant le substrat de l'isomérase R15P.

Presque tous les génomes des archées halophiles abritent deux protéines annotées comme uridine phosphorylase (tableau 1, colonnes VNG_1850G/VNG_0893G). Les homologues de VNG_1850G forment un opéron avec les gènes de l'isomérase R15P et de l'ATP-R1PK chez certaines espèces, tandis que les positions des homologues de VNG_0893G ne sont pas liées à l'opéron. La première est désignée ici Urdpase1 et la seconde Urdpase2. Ils peuvent être distingués phylogénétiquement (Fig. 6 supplémentaire), suggérant que leurs fonctions et/ou propriétés enzymatiques sont distinctes. Dans cette étude, la protéine Urdpase1 a été étudiée. Bien que nous ayons supposé qu'Urdpase1 catalyse une réaction de nucléoside phosphorylase et génère R1P, le substrat de l'ATP-R1PK, il n'était pas clair quels nucléosides sont reconnus par l'enzyme.

Quatre protéines recombinantes Urdpase1 de H. salinarum, H. xanaduensis, H. lacusprofundi et H. turkmenica (Hs-, Hx-, Hl- et Ht-Urdpase1 codées par VNG_1850G, Halxa_1684, Hlac_2318 et Htur_0567, respectivement) ont été préparées en utilisant E. coli. Hl-Urdpase1 et Ht-Urdpase1 ont été obtenues sous forme de protéines solubles, tandis que les deux autres ont formé des corps d'inclusion. La protéine recombinante Hl-Urdpase1 a été purifiée jusqu'à homogénéité apparente (Fig. 2c supplémentaire). L'activité nucléoside phosphorylase de la Hl-Urdpase1 purifiée a été examinée vis-à-vis de six nucléosides, l'adénosine, l'inosine, la guanosine, la cytidine, l'uridine et la thymidine (Fig. 4a et Fig. 7 supplémentaire). Hl-Urdpase1 présentait une activité plus élevée envers la guanosine et pouvait reconnaître l'adénosine et l'inosine dans une moindre mesure. Étonnamment, l'activité était plus faible à des concentrations plus élevées de KCl (Fig. 8a supplémentaire). L'enzyme a cependant conservé une activité guanosine phosphorylase considérable même à 2–4 M de KCl. La température de réaction optimale et le pH de l'enzyme étaient respectivement de 30 ° C et de 7, 5 (Fig. 8b, c supplémentaires). Les analyses cinétiques vers la guanosine et le phosphate ont révélé que les paramètres cinétiques Vmax et Km étaient de 1,5 ± 0,1 μmol min−1 mg−1 et 56 ± 10 μM vers la guanosine (Fig. 9a supplémentaire) et 2,1 ± 0,1 μmol min−1 mg−1 et 4,8 ± 0,8 mM vers le phosphate (Fig. 9b supplémentaire), respectivement. Les résultats suggèrent que Hlac_2318 code pour une guanosine phosphorylase. L'identification de la guanosine phosphorylase, de l'ATP-R1PK et de l'isomérase R15P impliquait la présence d'une voie métabolique convertissant la guanosine, le phosphate et l'ATP en RuBP, guanine et ADP via R1P et R15P (Fig. 1b). Bien que le donneur de phosphate de la R1P kinase soit l'ATP, la voie métabolique de la guanosine au RuBP correspond à celle de la voie des pentoses bisphosphates identifiée chez Thermococcus13.

une activité nucléoside phosphorylase de Hl-Urdpase1 a été analysée vis-à-vis de six nucléosides en quantifiant les nucléobases libérées par HPLC. b L'activité phosphatase de l'hydrolase Hx-HAD a été étudiée vis-à-vis de onze phosphates de sucre et de pNPP en quantifiant le phosphate libéré avec du vert malachite. G1P glucose-1-phosphate, G6P glucose-6-phosphate, G16P glucose-1,6-bisphosphate, F1P fructose-1-phosphate, F6P fructose-6-phosphate, F16P fructose-1,6-bisphosphate, R5P ribose-5 -phosphate, Ru5P ribulose-5-phosphate, pNPP p-nitrophénylphosphate. c L'activité aldolase du DHAP condensant Hx-FucA et de six aldéhydes a été examinée en quantifiant le DHAP résiduel après des réactions avec une enzyme de couplage. Les activités ont été calculées à partir de n = 3 expériences indépendantes. Les barres d'erreur indiquent les écarts types.

Outre l'isomérase R15P, Rubisco est la seule enzyme connue pour utiliser le RuBP comme substrat. La présence d'une voie métabolique générant du RuBP dans les archées halophiles sans Rubisco a suggéré la présence d'enzymes non identifiées impliquées dans la conversion du RuBP. Nous avons adopté une approche de génomique comparative, ainsi qu'une analyse phylogénétique, pour identifier les enzymes qui pourraient être impliquées dans ce métabolisme. Nous avons découvert qu'un gène annoté comme fuculose-1-phosphate aldolase (fucA) est spécifiquement présent dans 17 des 19 archées halophiles qui abritent une isomérase R15P autonome. Les homologues de FucA sont largement distribués parmi les archées halophiles et une relation avec la présence de l'isomérase R15P n'est pas évidente. Cependant, une analyse phylogénétique (Fig. 10 supplémentaire) révèle un groupe d'homologues de FucA qui présente une co-occurrence avec des isomérases R15P autonomes (Tableau 1, VNG_1201G [septième colonne], désignée FucA) et peut être distinguée des autres (Tableau 1, VNG_1201G [onzième colonne], désignée FucA*). Il n'y avait que deux organismes (H. tiamatea et Halohasta litchfieldiae) qui abritaient une isomérase R15P autonome mais pas FucA. D'autre part, nous avons constaté qu'un autre gène, annoté en tant qu'hydrolase de la superfamille des haloacides déshalogénases (HAD) (HAD hydrolase, hadhlase), est également spécifiquement présent dans les 17 halophiles (tableau 1, colonne VNG_1202C). De plus, ces deux gènes forment un opéron (Fig. 3) dans les 17 archées halophiles. De plus, chez H. lacusprofundi, Halorubrum sp. PV6 et Halorubrum ezzemoulense, les quatre gènes codant pour l'ATP-R1PK, l'isomérase R15P, l'hydrolase HAD et FucA forment un opéron. Les deux gènes fucA et hadhlase présentent une cooccurrence frappante avec les trois gènes codant pour la guanosine phosphorylase, l'ATP-R1PK et l'isomérase R15P, ce qui augmente fortement les possibilités que ces cinq protéines soient métaboliquement liées.

Nous avons examiné la possibilité que les protéines annotées HAD hydrolase et FucA soient impliquées dans le métabolisme du RuBP. L'hydrolase de la superfamille HAD d'Arabidopsis thaliana est connue pour catalyser la réaction phosphatase du ribose 5-phosphate (R5P) en ribose (Fig. 11a supplémentaire)34. Sur la base de la similitude structurelle entre R5P et RuBP (Fig. 11a, b supplémentaires), nous avons émis l'hypothèse que l'enzyme catalyse une réaction RuBP phosphatase. Le gène codant pour l'hydrolase HAD de H. xanaduensis (Halxa_2271) a été surexprimé dans E. coli et la protéine recombinante (Hx-HAD hydrolase) a été purifiée jusqu'à homogénéité apparente (Fig. 2d supplémentaire). L'activité phosphatase a été mesurée vis-à-vis de 12 phosphates de sucre. Nous avons observé une production notable de phosphate uniquement lorsque le RuBP était utilisé comme substrat (Fig. 4b), ce qui suggère que l'enzyme était une phosphatase avec une spécificité de substrat stricte vis-à-vis du RuBP. La concentration optimale de KCl était supérieure à 2, 5 M (Fig. 12a supplémentaire), tandis que le pH optimal de la réaction était d'environ 6 (Fig. 12b supplémentaire). La spécificité cationique de l'enzyme était large, avec des niveaux d'activité similaires détectés en présence de 1 mM de Mg2+, Mn2+, Co2+ et Ni2+ (Fig. 12c supplémentaire). L'analyse cinétique vers RuBP (Fig. 13 supplémentaire) a révélé que Vmax et Km vers RuBP étaient de 31 ± 2 µmol min-1 mg-1 et 2,2 ± 0,5 mM, respectivement. Les résultats impliquaient que l'enzyme, qui avait été annotée HAD hydrolase (codée par Halxa_2271), est une enzyme qui catalyse une réaction biologique jusque-là inconnue, la déphosphorylation du RuBP. Nous appelons l'enzyme RuBP phosphatase.

La déphosphorylation du RuBP peut entraîner la génération de trois produits de réaction, le ribulose-1-phosphate (Ru1P), le ribulose-5-phosphate (Ru5P) et le ribulose. Nous avons donc effectué une analyse 1H-RMN du produit de réaction (Fig. 14 supplémentaire). Bien que des déplacements chimiques dérivés du RuBP aient également été détectés, les déplacements chimiques spécifiques à un Ru1P cyclisé présentés dans un rapport précédent 35 ont été confirmés dans le produit de réaction (Fig. 14b, c supplémentaires). Cela suggère que la RuBP phosphatase catalyse l'hydrolyse du groupe phosphate en position C5 de RuBP, générant Ru1P (Fig. 1b).

Le FucA classique est une enzyme catalysant la réaction aldolase du fuculose-1-phosphate (Fu1P). Fu1P est clivé en phosphate de dihydroxyacétone (DHAP) et en l-lactaldéhyde (Fig. 11c supplémentaire). Nous avons noté que les structures chimiques de Ru1P et Fu1P sont similaires et que la différence réside uniquement dans le groupe méthyle C6 (Fig. 11b, c supplémentaires). De plus, nous avons pris note du fait qu'alors qu'à seulement 10 % des niveaux d'activité vis-à-vis des substrats physiologiques DHAP et l-lactaldéhyde, la fuculose-1-phosphate aldolase d'E. coli, qui affiche 33,8 % d'identité avec FucA de H. xanaduensis (Hx-FucA), pourrait reconnaître le DHAP et le glycolaldéhyde36. Le Hx-FucA recombinant a ainsi été préparé à l'aide d'E. coli et purifié jusqu'à homogénéité apparente (Fig. 2e supplémentaire). Comme Ru1P n'est pas disponible dans le commerce, nous avons examiné si Hx-FucA peut catalyser la réaction d'aldolase condensant le DHAP et les aldéhydes en quantifiant le DHAP résiduel. Les aldéhydes testés étaient l'acétaldéhyde, le propionaldéhyde, l'isobutylaldéhyde, le dl-glycéraldéhyde, le dl-lactaldéhyde et le glycolaldéhyde (Fig. 15 supplémentaire). La protéine a présenté une activité aldolase vis-à-vis du DHAP et de tous les aldéhydes testés (Fig. 4c). Le résultat impliquait que bien que la spécificité de substrat de l'enzyme soit large, elle pouvait catalyser la réaction de l'aldolase clivant Ru1P en DHAP et en glycolaldéhyde. Avec HPLC, nous avons en outre confirmé que le produit de réaction de la réaction Hx-FucA avec le DHAP et le glycolaldéhyde présentait un temps d'élution identique à celui du produit de réaction RuBP phosphatase (Fig. 16a supplémentaire). Une augmentation de l'activité a été observée avec l'ajout de ZnCl2 au mélange réactionnel, tandis qu'une diminution a été observée avec l'ajout d'EDTA, suggérant que l'enzyme dépendait des cations de zinc (Fig. 17 supplémentaire). De plus, nous avons examiné si la phosphatase Hx-RuBP et la protéine Hx-FucA pouvaient générer ensemble du DHAP à partir de RuBP. Ce n'est que lorsque les deux protéines étaient présentes dans le mélange réactionnel que le DHAP a été produit à partir de RuBP (Fig. 16b supplémentaire). De plus, les analyses cinétiques de l'enzyme ont révélé que Vmax et Km vers le glycolaldéhyde étaient de 2,0 ± 0,0 µmol min−1 mg−1 et 3,4 ± 0,3 mM, respectivement (Fig. 18a supplémentaire), et ceux vers le DHAP étaient de 2,0 ± 0,0 µmol min− 1 mg-1 et 3,5 ± 0,3 mM, respectivement (Fig. 18b supplémentaire). Sur la base de ces résultats, nous concluons que la protéine qui avait été annotée comme FucA, codée par Halxa_2272, est une aldolase Ru1P reconnaissant le DHAP et divers aldéhydes dont le glycolaldéhyde.

Sur la base des résultats obtenus ici, nous proposons que l'isomérase R15P autonome soit un composant d'une voie métabolique nucléosidique non identifiée auparavant convertissant le fragment ribose de la guanosine en glycolaldéhyde et en DHAP (Fig. 1b). La voie n'impliquant pas Rubisco, nous désignons ici cette voie par la voie des pentoses bisphosphates non carboxylants.

Bien que le DHAP puisse être métabolisé par le métabolisme central des sucres, le sort du glycolaldéhyde n'était pas encore clair. Cependant, nous n'avons pas pu identifier une enzyme candidate basée sur les informations du génome qui métaboliserait le glycolaldéhyde. Lors de la mesure de l'activité enzymatique dans l'extrait acellulaire de H. salinarum qui pourrait potentiellement convertir le glycolaldéhyde, nous avons pu détecter une activité réductrice sur le glycolaldéhyde en utilisant le NADH comme donneur d'électrons.

À partir de l'extrait acellulaire de H. salinarum cultivé avec des nucléosides, nous avons purifié la protéine présentant une activité de glycolaldéhyde réductase jusqu'à une homogénéité apparente (Fig. 2f supplémentaire). Par analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS), la protéine purifiée s'est avérée être le produit du gène VNG_6270G, annoté sn-glycérol-1-phosphate déshydrogénase. L'analyse enzymatique a révélé que la concentration optimale de KCl était supérieure à 4 M, et que la température et le pH de réaction optimaux étaient respectivement de 40 ° C et d'environ 6 (Fig. 19 supplémentaire). L'analyse cinétique vis-à-vis du glycolaldéhyde (Fig. 20a supplémentaire) a montré que l'enzyme était soumise à une inhibition du substrat. Les valeurs Vmax, Ks1 et Ks2 étaient de 33 ± 4 μmol min-1 mg-1, 10 ± 2 mM et 35 ± 8 mM, respectivement. En tenant compte de l'annotation d'origine, nous avons ensuite examiné si la protéine catalyse ou non la réaction sn-glycérol-1-phosphate déshydrogénase (Fig. 20b supplémentaire). L'enzyme purifiée n'a pas montré de niveaux notables d'activité pour l'oxydation du glycérol-1-phosphate ni la réduction de DHAP. De plus, la protéine recombinante VNG_6270G a été préparée à l'aide d'E. coli et partiellement purifiée (Fig. 3b supplémentaire). Comme prévu, la protéine recombinante (Hs-GaR) a affiché des niveaux élevés d'activité glycolaldéhyde réductase (40,7 ± 0,4 μmol min-1 mg-1).

Comme la sn-glycérol-1-phosphate déshydrogénase est présumée contribuer à la biosynthèse des précurseurs lipidiques membranaires des archées en réduisant le DHAP en glycérol-1-phosphate, l'enzyme semble être essentielle chez toutes les archées. Cependant, nous avons trouvé un autre gène annoté comme sn-glycérol-1-phosphate déshydrogénase distribué dans toutes les archées halophiles, y compris H. salinarum (VNG_0406C) (tableau 1, colonne VNG_0406C). La glycérol-1-phosphate déshydrogénase archaéenne caractérisée de Methanothermobacter thermautotrophicus37,38,39 présente une similarité plus élevée avec la protéine VNG_0406C (identique à 50,7 %) qu'avec la protéine VNG_6270G (identique à 22,5 %). Cela suggère que le gène VNG_6270G code pour la glycolaldéhyde réductase et non pour la sn-glycérol-1-phosphate déshydrogénase (Fig. 1b), et que le gène codant pour la véritable sn-glycérol-1-phosphate déshydrogénase est très probablement VNG_0406C.

Concernant la distribution des homologues du gène VNG_6270G (Tableau 1, colonne VNG_6270G), leur distribution est limitée à seulement dix archées halophiles et l'homologue chez H. salinarum est codé sur un plasmide. Bien que la moitié possède un ensemble complet de gènes formant la voie des pentoses bisphosphates non carboxylants, l'autre moitié ne le possède pas. Bien que nous ne puissions pas exclure la possibilité qu'il existe des plasmides dont les séquences ont été négligées dans les analyses du génome, la contribution des homologues de VNG_6270G à la dégradation des nucléosides dans les archées halophiles peut être limitée et d'autres voies de métabolisme du glycolaldéhyde peuvent exister.

Les analyses biochimiques décrites ci-dessus impliquent des enzymes de différentes espèces d'archées halophiles. Afin de confirmer que la voie proposée est présente chez une seule espèce, nous avons examiné les activités enzymatiques dans l'extrait acellulaire de H. salinarum. Lorsque chaque substrat a été ajouté au mélange réactionnel, y compris les extraits acellulaires, les produits des réactions de la guanosine phosphorylase (R1P), de la kinase R1P dépendante de l'ATP (R15P), de la phosphatase RuBP (Ru1P) et de la glycolaldéhyde réductase (éthylène glycol) ont été détectés ( Supplémentaire Fig. 21a, b, d, f). D'autre part, lorsque R15P a été ajouté au mélange réactionnel, nous n'avons pas pu détecter RuBP, le produit de la R15P isomérase. Cependant, au lieu de RuBP, nous avons pu observer la génération de Ru1P (Fig. 21c supplémentaire). Ce résultat impliquait que le RuBP généré à partir de R15P par l'isomérase R15P était ensuite converti en Ru1P par la phosphatase RuBP. Pour confirmer l'activité Ru1P aldolase, comme Ru1P n'est pas disponible dans le commerce, une réaction de couplage catalysée par RuBP phosphatase et Ru1P aldolase a été examinée. En conséquence, le DHAP, qui est présumé être produit par l'aldolase Ru1P à partir de Ru1P, a été clairement détecté lorsque RuBP et ZnCl2 ont été ajoutés (Fig. 21e supplémentaire). Les activités prédites des enzymes codées par les six gènes étaient détectables chez H. salinarum, suggérant la présence de la voie non carboxylante des pentoses bisphosphates dans cet organisme.

Sur la base des résultats de cette étude, nous proposons une voie de dégradation des nucléosides jusque-là non reconnue, la voie des pentoses bisphosphates non carboxylants, dans les archées halophiles (Fig. 1b). Bien que le métabolisme de la guanosine en RuBP via R15P soit similaire à celui de la voie des pentoses bisphosphates chez les Thermococcales, la voie en aval est unique. Nous pouvons supposer que le rôle physiologique de la voie est de convertir la fraction ribose du ou des nucléosides en DHAP et en éthylène glycol. Le DHAP peut être utilisé dans divers métabolismes, y compris l'oxydation en pyruvate via le glycéraldéhyde 3-phosphate, la gluconéogenèse et la conversion en glycérol pour une utilisation dans la biosynthèse des lipides membranaires et la production d'osmolytes. D'autre part, le devenir métabolique de l'éthylène glycol n'est toujours pas clair et un examen plus approfondi sera nécessaire pour comprendre si et comment les cellules utilisent les deux carbones dérivés des pentoses.

Nos résultats et la distribution des homologues de gènes suggèrent la présence de multiples variations des voies de dégradation des nucléosides chez les archées halophiles, impliquant toutes les pentoses bisphosphates R15P et RuBP. Une caractéristique commune des voies de dégradation des nucléosides trouvées dans les archées halophiles est que l'ADP-R1PK trouvée dans les Thermococcales est remplacée par l'ATP-R1PK identifiée dans cette étude (Fig. 1 et 5). Comme le montre le tableau 1, parmi les 63 espèces d'archées halophiles dont les séquences génomiques ont été déterminées, 44 espèces hébergent des homologues de l'isomérase R15P sur leurs génomes, suggérant la présence d'un métabolisme impliquant les pentoses bisphosphates R15P et RuBP dans ces organismes. Parmi celles-ci, 25 espèces semblent utiliser Rubisco pour le métabolisme du RuBP. La voie non carboxylante des pentoses bisphosphates identifiée dans cette étude, utilisant la RuBP phosphatase et la Ru1P aldolase, se retrouve dans 17 espèces halophiles et est également largement distribuée. Les deux espèces restantes avec une isomérase R15P n'hébergent ni Rubisco ni RuBP phosphatase/Ru1P aldolase. Comme pour la NMP phosphorylase, les homologues ne se trouvent que chez les espèces avec un Rubisco. Parmi les 25 espèces avec Rubisco, 14 hébergent un homologue de la NMP phosphorylase, tandis que 11 n'en ont pas. Il semble donc qu'il existe trois variations majeures de la voie des pentoses bisphosphates chez les halophiles qui représentent 42 des 63 espèces présentées dans le tableau 1 ; (i) un avec Rubisco et NMP phosphorylase, comme on le voit chez les membres des Thermococcales (Fig. 5a), (ii) un avec Rubisco mais sans NMP phosphorylase (Fig. 5b), et (iii) la voie non carboxylante des pentoses bisphosphates identifiée dans cette étude (Figs. 1b et 5c). La distribution de ces variations parmi les archées halophiles n'est pas liée aux relations phylogénétiques de leurs organismes sources (Fig. 6). Fait intéressant, il existe encore 10 espèces qui hébergent un ensemble d'homologues correspondant à la nucléoside phosphorylase et à l'ATP-R1PK (tableau 1, jaune dans les colonnes VNG_1851G/VNG_1850G), qui convertiraient les fractions ribose des nucléosides en R15P. Cela soulève la possibilité qu'il puisse y avoir encore plus de variations des voies de dégradation des nucléosides dans les archées halophiles qui impliquent des pentoses bisphosphates.

Les résultats obtenus dans cette étude et la distribution des gènes pertinents impliquent l'apparition de trois types de voies de dégradation des nucléosides chez les archées halophiles. Les trois voies métaboliques sont avec NMP phosphorylase et Rubisco (a), avec Rubisco mais sans NMP phosphorylase (b), sans Rubisco ni NMP phosphorylase mais avec RuBP phosphatase et Ru1P aldolase (c).

L'arbre phylogénétique a été construit à l'aide de séquences de gènes d'ARNr 16S. Une séquence de Thermoplasma volcanium (tvo) a été utilisée comme exogroupe. Les couleurs des cercles correspondent à celles des voies métaboliques des nucléosides sur la Fig. 5. Les organismes représentés par des codes rouges et roses indiquent les archées halophiles représentées sur la Fig. 3. Les organismes en codes rouges indiquent ceux dont les protéines ont été réellement examinées dans cette étude. .

Comme indiqué ci-dessus, il existe 21 espèces halophiles dont les séquences génomiques suggèrent une absence des voies carboxylantes/non carboxylantes des pentoses bisphosphates. Parmi eux, Halorhabdus utahensis et Halorhabdus tiamatea abritent des homologues de la voie NOPP classique trouvée chez les bactéries et les eucaryotes, et la voie NOPP peut être responsable de la dégradation des nucléosides chez ces espèces. Cependant, il existe encore 19 archées halophiles dont les séquences génomiques ne fournissent aucun indice sur la manière dont elles procèdent à la dégradation des nucléosides. Bien que nous ne puissions pas exclure la possibilité que ces espèces n'utilisent pas de nucléosides, nous avons remarqué un homologue FucA * distinct de celui identifié comme l'aldolase Ru1P dans cette étude (tableau 1, dernière colonne). L'homologue a tendance à se produire dans ces halophiles, y compris 9 espèces dans Haloarcula, Haloplanus et Halohasta, et pourrait fournir des indices pour identifier des voies supplémentaires impliquées dans le métabolisme des nucléosides ou des pentoses.

L'analyse de la Hl-Urdpase1 recombinante a indiqué que l'enzyme préférait la guanosine comme substrat nucléosidique pour la réaction de la phosphorylase. Fait intéressant, l'enzyme (Hlac_2318) présente une similitude plus élevée avec l'uridine phosphorylase (TK1479) (identique à 40,2 %) plutôt qu'avec la guanosine phosphorylase (TK1482) (identique à 18,7 %) chez T. kodakarensis. En plus de la guanosine phosphorylase, presque toutes les archées halophiles abritent un deuxième homologue de l'uridine phosphorylase, Urdpase2. Bien que ces seconds homologues ne forment pas un opéron avec les gènes de la voie des pentoses bisphosphates, il existe une forte possibilité que les produits géniques génèrent également R1P via la phosphorolyse des nucléosides. L'analyse phylogénétique a clairement révélé que l'Urdpase1 et l'Urdpase2 sont distinctes (Fig. 6 supplémentaire), ce qui suggère que les caractéristiques enzymatiques des membres des deux sous-groupes diffèrent l'une de l'autre. L'identification du substrat nucléosidique de l'Urdpase2 contribuera à notre compréhension de la dégradation des nucléosides dans les archées halophiles. Il est intrigant qu'un seul des deux gènes de la nucléoside phosphorylase, le gène de la guanosine phosphorylase, forme un opéron avec les gènes de la voie non carboxylante des pentoses bisphosphates. Cela peut être lié aux teneurs élevées en GC dans les génomes des archées halophiles telles que H. salinarum (67,9%)30. Les nucléosides/nucléotides contenant de la guanine et de la cytosine pourraient être maintenus à une concentration plus élevée dans ces cellules.

Deux kinases R1P ont été identifiées dans des études antérieures ; une kinase R1P dépendante de l'ADP de l'archéon hyperthermophile T. kodakarensis (TK2029) et une kinase R1P dépendante de l'ATP de l'archéon hyperthermophile Pyrobaculum calidifontis (Pcal_0041). La kinase R1P dépendante de l'ATP identifiée dans cette étude (Halxa_1682) était identique à 25 % à la protéine TK2029 et à 36,8 % identique à la protéine Pcal_0041. En comparant les propriétés des trois enzymes, la kinase R1P de T. kodakarensis est dépendante de l'ADP, alors que les enzymes de P. calidifontis et H. xanaduensis/H. salinarum dépendent de l'ATP. D'autre part, les enzymes de T. kodakarensis et H. xanaduensis affichent une spécificité de substrat stricte envers R1P, tandis que la kinase R1P de P. calidifontis peut reconnaître la cytidine et l'uridine en plus de R1P29. Ni les homologues du gène de l'isomérase R15P ni de la NMP phosphorylase ne sont présents dans P. calidifontis , ressemblant au cas des dix archées halophiles avec uniquement les homologues de la nucléoside phosphorylase et de l'ATP-R1PK décrits ci-dessus. En revanche, la présence de R1P kinase dans E. coli a été suggérée40. Un examen des enzymes/gènes qui peuvent supprimer une délétion dans le gène de la 5-phospho-D-ribosyl-1-diphosphate (PRPP) synthase a conduit à une voie proposée avec la séquence de réaction R5P → R1P → R15P → PRPP. Une protéine codée par phnN a été identifiée qui affiche une activité kinase vis-à-vis de R15P, conduisant à la production de PRPP. Une protéine responsable de la deuxième réaction proposée, bien que non identifiée, serait une kinase R1P. E. coli possède plusieurs enzymes présentant une similitude avec les protéines archées qui présentent une activité kinase R1P. Comme il s'agit de protéines dont les fonctions n'ont pas été déterminées, l'une d'entre elles peut également être la kinase R1P. La kinase R1P et son produit, R15P, peuvent être distribués par les archées et les bactéries plus largement que prévu.

Sauf mention contraire, les réactifs chimiques ont été achetés auprès de Nacalai Tesque (Kyoto, Japon), FUJIFILM Wako Pure Chemicals (Osaka, Japon) ou Merck (Darmstadt, Allemagne). Les souches et les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 2. L'archéon halophile Halobacterium salinarum et son ADN génomique ont été fournis par le RIKEN BioResource Research Center par le biais du National BioResource Project of MEXT/AMED, Japon. H. salinarum a été cultivé à 40 °C dans un milieu contenant 250 g l−1 de chlorure de sodium, 20 g l−1 MgSO4 · 7H2O, 3 g l−1 de citrate trisodique, 2 g l−1 de chlorure de potassium, 5 g l−1 de tryptone et 3 g l−1 extrait de levure (défini comme milieu riche en sel dans cette étude). Si nécessaire, des nucléosides ont été ajoutés dans le milieu. La souche Escherichia coli DH5α utilisée pour la construction plasmidique et les souches E. coli BL21 CodonPlus(DE3)-RIL et Rosetta (DE3) utilisées pour l'expression génique ont été cultivées à 37 °C dans un milieu de bouillon de lysogénie (LB) contenant de l'ampicilline (100 mg l−1 ).

Des plasmides pour exprimer des gènes codant pour l'isomérase Hs-R15P et Hs-Urdpase1 ont été construits comme suit. Les régions codantes des gènes Hs-R15P isomérase et Hs-Urdpase1 ont été amplifiées par PCR en utilisant l'ADN génomique de H. salinarum comme matrice et expHs-R15Pi-F/-R et Hs-Urdpase1-F/-R comme ensembles d'amorces, respectivement. Les amorces ont été conçues de manière à ce que les sites de restriction NdeI et BamHI soient introduits aux extrémités 5' et 3' des fragments d'ADN amplifiés, respectivement. Les séquences de ces amorces sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 3. Après digestion avec NdeI et BamHI, les fragments d'ADN ont été ligaturés individuellement avec pET-21a(+) digéré avec les mêmes enzymes de restriction. Les plasmides d'expression résultants sont désignés pET-Hs-R15P isomérase et pET-Hs-Urdpase1 (tableau supplémentaire 2).

Plasmides d'expression pour les gènes codant pour l'isomérase Ht-R15P, Hs-RbsK, Ht-RbsK, Hx-RbsK, Ht-Urdpase1, Hx-Urdpase1, Hl-Urdpase1, Hx-HAD hydrolase, Hx-FucA et Hs-GaR (tableau supplémentaire 2) ont été préparés comme suit. Des gènes ont été conçus et synthétisés (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) pour diminuer leur teneur en GC et optimiser leurs codons pour améliorer l'expression des gènes dans E. coli. Les gènes conçus avec des sites NdeI et BamHI aux extrémités 5' et 3', respectivement, ont été digérés avec NdeI et BamHI et ligaturés avec pET-21a(+) digéré avec les mêmes enzymes de restriction. Pour les 10 plasmides d'expression résultants (tableau supplémentaire 2) avec les deux plasmides décrits ci-dessus, nous avons effectué une analyse de séquençage de l'ADN et confirmé l'absence de mutation involontaire. Les séquences conçues de chaque gène sont présentées dans la Fig. 22 supplémentaire.

Les plasmides d'expression construits ont été introduits dans E. coli Rosetta (DE3) (pour les gènes codant pour l'isomérase R15P, RbsK, HAD hydrolase et FucA) ou E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (pour les gènes codant pour Urdpase1 et GaR). Les transformants ont été cultivés à 37 ° C jusqu'à ce que leur DO660 atteigne 0, 4 à 0, 8 et l'expression génique a été induite par l'ajout d'isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0, 1 mM. Après une nouvelle culture à 37 ° C pendant 4 h, les cellules ont été récoltées.

Les cellules exprimant les protéines recombinantes Hs-GaR, Ht-R15P isomérase, Hx-RbsK et Hx-FucA ont été remises en suspension avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) et rompues par sonication. Après centrifugation (5000 x g, 15 min, 4 °C), le surnageant a été appliqué sur une colonne échangeuse d'anions (Resource Q, GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Les protéines ont été éluées avec un gradient linéaire de NaCl (0 à 1,0 M) dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Pour les trois protéines autres que GaR, les tampons des fractions pertinentes ont été changés en tampon phosphate de sodium avec 2 M de NaCl et appliqués à une colonne d'affinité en céramique d'hydroxyapatite (Bio-Scale CHT 10-1, Bio-Rad, Hercules, CA) équilibrée avec Phosphate de sodium 7 mM (pH 7,5) dont 2 M NaCl. Les protéines ont été éluées avec un gradient linéaire de phosphate de sodium (7 à 280 mM) dans du NaCl 2M. Les fractions pertinentes ont été collectées et purifiées davantage avec une colonne de filtration sur gel Superdex200 (GE Healthcare) équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) comprenant du NaCl 2 M. Le même tampon a été utilisé comme phase mobile. Pour Hs-GaR, les fractions pertinentes après chromatographie d'échange d'anions ont été appliquées à une colonne de filtration sur gel équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) comprenant du KCl 2 M.

Les protéines recombinantes Hl-Urdpase1 et Hx-HAD hydrolase ont été purifiées avec Bio-Scale CHT 10-1 et Superdex200. Les cellules produisant les protéines hydrolases Hl-Urdpase1 et Hx-HAD ont été remises en suspension dans du phosphate de sodium 5 mM et 7 mM (pH 7,5) avec du NaCl 2 M, respectivement, et rompues par sonication. Après centrifugation, les surnageants ont été appliqués sur Bio-Scale CHT 10-1 équilibré avec les mêmes tampons utilisés pour la suspension cellulaire. Hl-Urdpase1 et Hx-HAD hydrolase ont été éluées avec des gradients linéaires de phosphate de sodium (5 à 500 mM et 7 à 280 mM, respectivement) dans du NaCl 2 M. Hl-Urdpase1 et Hx-HAD hydrolase ont été purifiées avec une colonne Superdex200 équilibrée avec 50 mM de phosphate de sodium (pH 7,5) avec 2 M KCl et 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) avec 2 M KCl, respectivement, avec les tampons utilisés comme phases mobiles.

Les concentrations des enzymes purifiées ont été déterminées avec le Protein Assay System (Bio-Rad), en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) comme standard. L'homogénéité des protéines a été confirmée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE).

H. salinarum a été cultivé dans 200 ml de milieu riche en sel additionné de quatre nucléosides (adénosine, uridine, guanosine et cytidine : 0,5 mM chacun). Après que la densité cellulaire (OD660) ait atteint 0,7, les cellules ont été récoltées, remises en suspension avec 5 ml de phosphate de sodium 5 mM (pH 7,5) avec du KCl 2 M et rompues par sonication. Après centrifugation (5000 x g, 15 min, 4 °C), le surnageant a été appliqué sur une colonne Bio-Scale CHT 10-1 équilibrée avec 5 mM de phosphate de sodium (pH 7,5) avec 2 M de KCl. Les protéines ont été éluées avec un gradient linéaire de phosphate de sodium (5 à 500 mM) dans du KCl 2M. Les fractions présentant une activité glycolaldéhyde réductase ont été recueillies. Une purification supplémentaire a été effectuée avec une colonne Superdex200 équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) comprenant du NaCl 2 M. Le même tampon a été utilisé comme phase mobile. La concentration en protéines a été déterminée comme décrit ci-dessus.

La séquence d'acides aminés de la protéine purifiée présentant une activité glycolaldéhyde réductase a été identifiée par analyse LC-MS. Après séparation avec SDS-PAGE, les protéines ont été colorées avec une coloration à l'argent. La partie du gel contenant la protéine cible a été excisée et décolorée avec le kit Silver Stain MS. La protéine dans le gel a été réduite, alkylée, digérée avec de la trypsine et extraite à l'aide du kit de digestion trypsique In-Gel (Thermo Fisher Scientific). Les peptides digérés à la trypsine ont été analysés par chromatographie liquide en phase inverse à nano-flux suivie d'une SM en tandem, à l'aide d'un spectromètre de masse hybride LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific). Les échantillons ont été automatiquement injectés à l'aide du système PAL (CTC analytics, Zwingen, Suisse) dans une colonne OSD de peptide L-trap (5 µm; AMR, Tokyo, Japon) fixée à une valve d'injection pour le dessalement et la concentration des peptides. Après avoir lavé le piège avec de l'eau de qualité MS contenant 0,1 % d'acide TFA et 2 % d'acétonitrile (solvant C), les peptides ont été chargés dans une colonne capillaire nano HPLC (C18-garnie avec une taille de particules de gel de 3 µm, 0,1 × 150 mm ; Nikkyo Technos, Tokyo, Japon). Les éluants étaient : A, 100 % d'eau contenant 0,5 % d'acétate, et B, 80 % d'acétonitrile contenant 0,5 % d'acétate. Dans la colonne, le gradient de concentration d'acétonitrile a été augmenté : de 5 % de B à 45 % de B en 60 min, de 45 % de B à 95 % de B en 1 min, en maintenant 95 % de B pendant 19 min, de 95 % de B à 5 % de B en 1 min, et enfin rééquilibrage avec 5% de B pendant 9 min. Le débit a été accéléré de 200 à 500 nl min-1 avec un gradient de concentration d'acétonitrile. Le système Xcalibur 2.1 (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour analyser les spectres de peptides dans la plage de masse de m/z 350–1500 et analyser les spectres MS/MS dans l'acquisition de données dépendantes de l'information dans la plage de masse de m/z 150–2000. La fragmentation a été réalisée par dissociation induite par collision (CID). Plusieurs peptides chargés avec de bonnes caractéristiques de fragmentation ont été choisis pour les expériences MS/MS. Les spectres MS/MS ont été interprétés et des listes de pics ont été préparées avec Proteome Discoverer 1.4 et 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Les recherches génétiques ont été effectuées en utilisant le SEQUEST-HT (Thermo Fisher Scientific).

L'activité de l'isomérase R15P a été examinée en utilisant le ribose-1,5-bisphosphate (R15P) comme substrat et en détectant le produit RuBP avec HPLC. Le mélange réactionnel (100 μl) était composé de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM R15P (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japon), 10 mM MgCl2, 1,84 M KCl, et 2 ou 3 μg du recombinant purifié Protéine isomérase Ht-R15P. Le mélange réactionnel sans R15P a été pré-incubé à 47°C pendant 3 min. La réaction a été initiée par l'ajout de R15P, effectuée à 47 °C pendant 15 min, et arrêtée par refroidissement rapide sur glace et élimination de l'enzyme par ultrafiltration avec Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (MWCO : 10 K) (EMD Millipore , Billerica, MA). Le produit de la réaction a été analysé par HPLC en utilisant une colonne Asahipak NH2P-50 4E (Shodex, Tokyo, Japon) avec du phosphate de sodium 300 mM (pH 4,4) comme phase mobile. Les composés élués ont été contrôlés avec un détecteur à indice de réfraction différentiel. Les données de chromatogramme HPLC mesurées avec les systèmes LC-10A ou Nexera X2 (Shimadzu, Kyoto, Japon) ont été collectées à l'aide de LCsolution 1.22 SP1 ou LabSolutions 5.57.

L'activité kinase de Hx-RbsK a été mesurée en quantifiant la quantité de NDP produits à partir de NTP avec des enzymes de couplage, la pyruvate kinase et la lactate déshydrogénase (PK/LDH). PK convertit le phosphoénolpyruvate et les NDP en pyruvate et NTP. La LDH catalyse la conversion du pyruvate et du NADH en lactate et NAD+. Les NDP générés ont été calculés en mesurant la diminution de l'absorbance à 340 nm (A340) dérivée du NADH.

Pour mesurer l'activité de Hx-RbsK, la production de NDP a été examinée comme suit. Le mélange réactionnel de kinase (100 μl) contenait un mélange de 50 mM de Tris-HCl et 50 mM de Bicine-NaOH (pH 8,3 ou 8,4), 25 mM d'accepteurs de phosphate dont le ribose-1-phosphate (R1P) (Toronto Research Chemicals Inc., Toronto, Canada), NTP (4 mM ATP [LEVURE ORIENTALE, Tokyo, Japon], 4 mM ATP avec 2 mM chacun GTP/UTP/CTP, 2 mM chacun ATP/GTP/UTP/CTP/TTP, ou 4 mM ATP avec 1,5 mM de GTP/UTP/CTP/TTP), 20 mM de MgCl2, 1,8 M ou 4 M de NaCl et 2, 2,5 ou 4 μg de protéine Hx-RbsK partiellement purifiée. Quatre-vingt-cinq accepteurs de phosphate testés comme substrats et les conditions de réaction sont résumés dans le tableau supplémentaire 1. Le mélange réactionnel sans NTP a été incubé à 42 ou 47 ° C pendant 3 min et la réaction a été initiée par l'ajout de NTP et réalisée pendant 15, 30 ou 60 min. La réaction a été arrêtée par refroidissement rapide sur de la glace pendant 10 min et élimination de l'enzyme par ultrafiltration comme décrit ci-dessus. Le mélange réactionnel PK/LDH (100 μl) était composé de 15 ou 50 mM MES-NaOH (pH 6,5), 25–50 μl du mélange réactionnel kinase, 5 ou 20 mM phosphoénolpyruvate (PEP), 0,2 mM NADH (ORIENTAL YEAST ), 5 unités de PK et 7 unités de LDH. A340 du mélange réactionnel PK/LDH sans enzymes de couplage a été mesuré. Les enzymes de couplage ont été ajoutées et A340 a été contrôlé à température ambiante jusqu'à ce qu'une diminution ne soit plus observée. Sauf indication contraire, l'absorbance a été mesurée avec un spectrophotomètre, Ultrospec 3000 (GE Healthcare) ou Ultrospec 6300 pro (GE Healthcare). Le coefficient d'absorbance molaire appliqué du NADH était de ε340 nm = 6,22 × 103 M−1 cm−1. La réaction sans substrat accepteur de phosphate a été effectuée et la valeur a été soustraite des valeurs obtenues avec les substrats accepteurs. Les quantités de NDP produites ont été normalisées en divisant par le temps de réaction (min) et la quantité de protéines (mg).

Lorsque la spécificité du NTP a été examinée, la réaction a été effectuée à 42 ° C pendant 5 min en présence de R1P 25 mM, de NTP 4 mM, de NaCl 0, 8 M, de 1, 2 μg de protéine purifiée et d'autres composants décrits ci-dessus. Pour la détermination de l'activité spécifique envers R1P, la réaction a été effectuée à 47 ° C pendant 3, 4 et 5 min avec le mélange réactionnel comprenant 20 mM R1P, 4 mM ATP, 2 M KCl et d'autres composants décrits ci-dessus. Pour déterminer la dépendance au KCl, le NaCl a été remplacé par du KCl (0–3 M) et les activités spécifiques ont été mesurées à 47 ° C en présence de 15 mM de R1P, 4 mM d'ATP et d'autres composants décrits ci-dessus. Dans l'analyse du produit de réaction Hx-RbsK avec HPLC, 10 mM de R1P, 30 mM d'ATP, 2 M de KCl, 1 μg de protéine purifiée et d'autres composants décrits ci-dessus ont été inclus dans le mélange réactionnel de 100 μl. La réaction a été effectuée à 47°C pendant 15 min. Après un refroidissement rapide sur de la glace pendant 10 minutes et une ultrafiltration pour éliminer Hx-RbsK, le filtrat a été analysé par HPLC comme décrit ci-dessus. Pour la réaction couplée de Hx-RbsK et d'isomérase Ht-R15P, des aliquotes de 50 µl du filtrat ont été ajoutées dans un mélange réactionnel d'isomérase Ht-R15P avec 5 mM d'AMP et sans R15P. Après incubation à 47 °C pendant 3 min, la réaction a été initiée et réalisée pendant 15 min. La formation de RuBP a été détectée par HPLC comme décrit ci-dessus.

L'activité nucléoside phosphorylase de Hl-Urdpase1 a été mesurée en quantifiant la nucléobase libérée avec HPLC. Sauf indication contraire, le mélange réactionnel (100 μl) comprenait du phosphate de sodium 50 mM (pH 7,5), des nucléosides 2 mM (adénosine, inosine, guanosine, uridine, cytidine ou thymidine), du KCl 2 M et 1 μg d'enzyme purifiée. Après incubation du mélange réactionnel sans nucléosides à 37°C pendant 3 min, la réaction a été démarrée en ajoutant des nucléosides. Après incubation à 37 °C pendant diverses périodes de temps, la réaction a été arrêtée par refroidissement rapide sur de la glace pendant 20 minutes et élimination de l'enzyme par ultrafiltration comme décrit ci-dessus. Pour HPLC, un volume égal d'une solution de phosphate de sodium 20 mM (pH 7,5), 20 % de méthanol a été ajouté au filtrat. Les produits de réaction ont été analysés par HPLC en utilisant une colonne remplie COSMOSIL 5C18-PAQ (4,6 ID x 250 mm, Nacalai Tesque) équilibrée avec du phosphate de sodium 20 mM (pH 7,5) avec 10 % de méthanol à une température de 40 °C. Les nucléobases libérées ont été détectées par absorbance UV à 260 nm. L'adénosine, l'adénine, l'inosine, l'hypoxanthine, la guanosine, la guanine, l'uridine, l'uracile, la cytidine, la cytosine, la thymidine et la thymine ont été utilisées comme composés standard pour préparer des courbes standard.

Pour déterminer les propriétés enzymatiques générales, faire varier les concentrations de KCl (0–4 M), les températures de réaction (20–90 °C) et le pH de réaction (tampon phosphate de sodium pour pH 2,0–5,0, tampon MES-NaOH pour pH 5,5–7,0, HEPES - Tampon NaOH pour pH 7,0–8,0, tampon Bicine-NaOH pour pH 8,0–9,0) ont été testés. Pour l'analyse cinétique vis-à-vis de la guanosine, différentes concentrations de guanosine (0 à 1000 μM) ont été testées à 30 ° C en présence de phosphate de sodium 50 mM (pH 7, 5) et de KCl 2 M. L'analyse cinétique vis-à-vis du phosphate a été réalisée avec différentes concentrations de phosphate de sodium (0 à 32 mM) en présence de guanosine 1 mM à 30 ° C avec du KCl 2 M. Dans toutes les analyses cinétiques des enzymes, l'ajustement de la courbe et le calcul des valeurs Vmax et Km ont été effectués avec IGOR Pro version 6.03AJ.

L'activité phosphatase de l'hydrolase Hx-HAD a été déterminée en quantifiant le phosphate libéré avec un dosage au vert malachite. Le mélange réactionnel (100 μl) comprenait du Tris-HCl 50 mM (pH 7, 5), des phosphates de sucre 5 mM, du KCl 2 M, du MgCl2 5 mM et 1 μg de la protéine recombinante Hx-HAD hydrolase purifiée. Douze substrats, glucose-1-phosphate (G1P), glucose-6-phosphate (G6P), glucose-1,6-bisphosphate (G16P), fructose-1-phosphate (F1P), fructose-6-phosphate (F6P), fructose-1,6-bisphosphate (F16P), ribose-5-phosphate (R5P), ribose-1-phosphate (R1P), ribose-1,5-bisphosphate (R15P), ribulose-5-phosphate (Ru5P), ribulose -1,5-bisphosphate (RuBP) et p-nitrophénylphosphate (pNPP) ont été examinés. Après incubation du mélange réactionnel sans substrat pendant 5 min à 37°C, la réaction a été initiée par l'ajout du substrat. Après 10 minutes d'incubation, la réaction a été arrêtée par refroidissement rapide sur de la glace et élimination de l'enzyme par ultrafiltration comme décrit ci-dessus. Le phosphate libre libéré a été quantifié à l'aide de kits d'analyse de phosphate vert malachite (BioAssay Systems, Hayward, CA). Les produits de réaction ont été dilués de manière appropriée jusqu'à un volume final de 80 μl, puis mélangés avec 20 μl du réactif spécifié. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, l'absorbance à 660 nm a été mesurée avec un spectrophotomètre.

Pour déterminer les propriétés enzymatiques générales, la réaction a été effectuée dans un mélange réactionnel de 100 μl contenant du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) ou du MES 50 mM (pH 6,1), du RuBP 10 mM, du KCl 2,5 M, du MgCl2 5 mM et 0,5 µg de l'enzyme purifiée. Les effets des sels ont été examinés en faisant varier la concentration de KCl (1 à 3 M) ou en utilisant du NaCl (3 M). Les effets du pH ont été examinés avec 50 mM d'acide acétique (pH 4,4–5,9), MES (pH 6,1–7,4) ou PIPES (pH 7,5–8,5). Les effets des cations métalliques divalents ont été examinés avec 5 mM de MgCl2, CaCl2, MnCl2, CoCl2, NiCl2 ou EDTA. L'analyse cinétique vers RuBP a été effectuée dans un mélange réactionnel de 100 μl contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), diverses concentrations de RuBP (0–20 mM), 2 M KCl, 5 mM MgCl2 et 0,5 μg de l'enzyme purifiée . Après 5 min de pré-incubation, la réaction a été démarrée en ajoutant du RuBP. Les temps de réaction étaient de 1, 3 et 5 min pour les réactions avec 0, 1 à 0, 5 mM de RuBP et de 1, 4 et 7 min pour celles avec d'autres concentrations.

Les activités aldolase de Hx-FucA ont été mesurées avec du phosphate de dihydroxyacétone (DHAP) et divers aldéhydes comme substrats. Le DHAP résiduel après la réaction de condensation a été quantifié avec la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (GPDH) en mesurant la consommation de NADH. Le mélange réactionnel d'aldolase (100 μl) contenait 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de DHAP, 25 mM d'aldéhydes (acétaldéhyde, propionaldéhyde, isobutylaldéhyde, dl-glycéraldéhyde, dl-lactaldéhyde ou glycolaldéhyde), 2 M KCl, 1 mM ZnCl2, et 4 µg d'enzyme purifiée. Après incubation du mélange réactionnel sans aldéhydes à 47 ° C pendant 3 min, la réaction a été démarrée en ajoutant des aldéhydes individuels. Après une nouvelle incubation à 47 ° C (3 à 20 min), la réaction a été arrêtée par refroidissement rapide sur de la glace pendant 5 min et élimination de l'enzyme par ultrafiltration comme décrit ci-dessus. Le mélange réactionnel de couplage (100 ul) contenait 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 ul d'une aliquote diluée de manière appropriée du premier mélange réactionnel, 0,2 mM de NADH et 1,7 unités de GPDH. Après l'ajout de GPDH, A340 a été surveillé avec un Ultrospec 6300 pro jusqu'à ce qu'une diminution ne soit plus observée et le DHAP résiduel a été quantifié en fonction de la quantité de NADH consommée.

La réaction d'hydrolase Hx-HAD couplée à la réaction Hx-FucA a été examinée en détectant la production de DHAP à partir de RuBP. Le mélange réactionnel (100 μl) contenait 50 mM de Tris-HCl (pH 7, 5), 10 mM de RuBP, 5 mM de MgCl2, 2 M de KCl, 1 mM de ZnCl2, 1 μg de Hx-HAD hydrolase et Hx-FucA. Après incubation sans RuBP à 47°C pendant 3 min, la réaction a été démarrée en ajoutant du RuBP. Après 3 h d'incubation, la réaction a été stoppée par refroidissement rapide sur glace et élimination de l'enzyme par ultrafiltration. Le mélange réactionnel (100 ul) pour quantifier le DHAP contenait du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 40 ul du premier mélange réactionnel, du NADH 0,3 mM et 1,7 unités de GPDH. La production de DHAP a été quantifiée comme décrit ci-dessus.

Les paramètres cinétiques de la protéine Hx-FucA vis-à-vis du DHAP et du glycolaldéhyde ont été déterminés comme suit. Le mélange réactionnel (100 μl) comprenait du Tris-HCl 50 mM (pH 8, 0), les substrats glycolaldéhyde et DHAP, du KCl 2 M, du ZnCl2 1 mM et 2 μg de protéine Hx-FucA purifiée. Différentes concentrations de DHAP (1 à 20 mM) ou de glycolaldéhyde (1 à 30 mM) ont été testées avec une concentration constante de glycolaldéhyde (50 mM) ou de DHAP (20 mM), respectivement. Après incubation à 47 °C pendant 3 min, la réaction a été démarrée en ajoutant du DHAP ou du glycolaldéhyde. Après 12, 16 et 20 min d'incubation, la réaction a été arrêtée par refroidissement rapide sur glace pendant 5 min et élimination des protéines avec des colonnes d'ultrafiltration. Le Ru1P produit a été quantifié par HPLC en utilisant une colonne Asahipak NH2P-50 4E et un détecteur UV (200 nm). La colonne a été équilibrée avec un tampon phosphate de sodium 300 mM (pH 4,4) à 40 °C et le même tampon a été utilisé comme phase mobile.

Comme Ru1P n'est pas disponible dans le commerce, la protéine hydrolase Hx-HAD a été utilisée pour produire Ru1P afin de construire une courbe standard de Ru1P. La réaction a été effectuée comme suit. Le mélange réactionnel (100 μl) comprenait un tampon MES-NaOH 50 mM (pH 6, 0), RuBP 10 mM, KCl 2 M, MgCl2 5 mM et 1 μg de protéine hydrolase Hx-HAD. Après incubation à 37 °C pendant 5 min sans RuBP, la réaction a été démarrée en ajoutant du RuBP. Après incubation à 37 °C pendant 5 h, la réaction a été stoppée par refroidissement rapide sur glace pendant 5 min et élimination des protéines avec une colonne d'ultrafiltration. Après avoir confirmé la consommation complète de RuBP par HPLC, la concentration du Ru1P généré a été supposée être de 10 mM et utilisée pour construire une courbe standard pour Ru1P.

Les activités de réductase envers le glycolaldéhyde et le DHAP ont été mesurées en surveillant la consommation de NADH (A340) dans le mélange réactionnel avec un spectrophotomètre UV, UV-1800 (Shimadzu) et les données ont été recueillies avec UVProbe 2.52. Le mélange réactionnel (1 ml) comprenait du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) ou du MES-NaOH 50 mM/100 mM (pH 6,0), du glycolaldéhyde 7,5 ou 20 mM/DHAP 7,5 mM, du NADH 0,2 mM, du KCl 2 M et 0,2 ou 2 µg de glycolaldéhyde réductase purifiée. Après l'incubation du mélange réactionnel sans NADH ou protéine recombinante à 40 ° C pendant 1 min, la réaction a été démarrée en ajoutant du NADH ou de la protéine recombinante purifiée, respectivement. L'analyse des données a été réalisée avec le logiciel UVProbe 2.52.

Effets des concentrations de KCl (0–4 M) dans 50 mM MES-NaOH (pH 6,5) à 30 °C, températures de réaction (20–90 °C) avec 50 mM MES-NaOH (pH 6,5) et 4 M KCl, et Les valeurs de pH (MES-NaOH [pH 5,5–7,0], HEPES-NaOH [7,0–8,0], Bicine-NaOH [8,0–9,0] à 40 °C et en présence de KCl 4 M ont été testées. Paramètres cinétiques vis-à-vis du glycolaldéhyde à 40 °C ont été déterminées dans un mélange réactionnel (1 ml) contenant 50 mM de MES-NaOH (pH 6,0), diverses concentrations de glycolaldéhyde (0 à 70 mM), 0,2 mM de NADH, 3 M de KCl et 0,2 μg de la solution purifiée enzyme.

L'activité oxydase vis-à-vis du sn-glycérol-1-phosphate a été examinée comme suit. Le mélange réactionnel (1 ml) comprenait 50 mM de MES-NaOH (pH 6, 0), 7, 5 mM de sn-glycérol-1-phosphate, 0, 2 mM de NAD +, 2 M de KCl et 0, 2 μg de glycolaldéhyde réductase purifiée. Après avoir incubé le mélange réactionnel sans NAD + à 40 ° C pendant 1 min, la réaction a été démarrée en ajoutant NAD + et A340 dérivé de NADH a été mesuré avec un UV-1800 pour calculer la production de DHAP et les données ont été collectées avec UVProve 2.52.

Le produit de réaction de l'hydrolase Hx-HAD a été analysé par RMN. Le mélange réactionnel (300 ul) contenait de l'acétate d'ammonium 100 mM (pH 6,65), du RuBP 10 mM, du KCl 2 M, du MgCl2 5 mM et 1 ug de l'enzyme purifiée. Après incubation du mélange réactionnel sans RuBP pendant 5 min à 37°C, la réaction a été démarrée en ajoutant du RuBP. Après 10 minutes d'incubation, la réaction a été arrêtée en éliminant l'enzyme avec une colonne d'ultrafiltration comme décrit ci-dessus. Le produit de réaction a été concentré trois fois par séchage sous vide, dilué de manière appropriée avec D2O (D, 99,96 %) (Cambridge Isotope Laboratories Inc., Tewksbury, MA) et analysé avec 1H-RMN.

La mesure 1H-RMN a été effectuée à l'aide d'un spectromètre ECA-600 (JEOL, Tokyo, Japon) à 600 MHz et 5 ° C et les données ont été recueillies avec Delta 4. Les spectres 1H-RMN ont été acquis à l'aide d'une séquence d'impulsions incorporant la présaturation pour l'eau suppression. La puissance de présaturation était de 56 dB, ce qui est le minimum requis pour une suppression complète du pic d'eau. Les déplacements chimiques des spectres 1H-RMN ont été donnés en ppm par rapport aux signaux de solvants en utilisant des étalons externes de D2O à 4,62 ppm. Les données RMN obtenues ont été analysées avec Alice2 version 6.

H. salinarum a été cultivé dans un milieu riche en sel additionné d'adénosine 2 mM, d'uridine 100 mM, de guanosine 2 mM et de cytidine 100 mM. Lors de la mesure de l'activité de la guanosine phosphorylase, les cellules ont été cultivées sans nucléosides pour diminuer les signaux de fond provenant des nucléosides ajoutés. Des extraits acellulaires ont été préparés comme décrit pour la purification de GaR. Pour réduire les pics de fond, les petites molécules dans l'extrait cellulaire ont été réduites en diluant 8 fois avec un tampon phosphate 50 mM (pH 7,5) par ultrafiltration. Le mélange réactionnel (100 μl) contenait du phosphate de sodium 50 mM (pH 7,5), 1500 μg de l'extrait acellulaire et un substrat. Les substrats, leurs concentrations et les temps/températures de réaction étaient 1 mM de guanosine pour la guanosine phosphorylase (5 h/40 °C), 40 mM de R1P avec 20 mM d'ATP et 20 mM de MgCl2 pour la R1P kinase (17 h/47 °C), 40 mM R15P pour R15P isomérase (12 h/40 °C), 20 mM RuBP et 20 mM MgCl2 pour RuBP phosphatase (15 min/40 °C), 100 mM RuBP avec 20 mM MgCl2 et 1 mM ZnCl2 pour Ru1P aldolase (12 h /40 °C), 40 mM de glycolaldéhyde et 30 mM de NADH pour la glycolaldéhyde réductase (1 h/40 °C). L'incubation a été effectuée pendant 3 min avant d'ajouter des substrats ; guanosine, ATP, R15P, RuBP, RuBP et NADH, respectivement. Les réactions ont été stoppées par refroidissement rapide sur glace pendant 10 min et élimination des enzymes par ultrafiltration. Les produits de réaction ont été analysés par HPLC en utilisant une colonne garnie COSMOSIL 5C18-PAQ et une phase mobile de H2O à 40 °C pour la glycolaldéhyde réductase et une colonne Asahipak NH2P-50 4E et une phase mobile de 300 mM de phosphate de sodium (pH 4,4) à 40 °C. °C pour les autres protéines. Les produits (R1P, R15P, RuBP, Ru1P, DHAP et éthylène glycol) ont été surveillés par un détecteur à indice de réfraction différentiel. Les composés standard étaient disponibles dans le commerce R1P (10 mM), R15P (10 mM), DHAP (5 mM) et éthylène glycol (15 mM), ainsi que Ru1P préparé enzymatiquement à partir de RuBP (5 mM) (décrit ci-dessus).

Des recherches d'homologie de protéines ont été effectuées dans la base de données KEGG Genes à l'aide du programme de recherche BLAST (https://www.genome.jp/tools/blast/). Des séquences de gènes d'ARN ribosomique 16S d'halophiles ont été obtenues à partir de la base de données KEGG Genes. Lorsqu'il y avait plusieurs ARN ribosomiques 16S dans un organisme, une séquence a été sélectionnée au hasard. L'analyse phylogénétique a été réalisée à l'aide du programme ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), tandis que l'arbre phylogénétique a été construit à l'aide de la version 1.6.6 de TreeView.

La reproductibilité des données a été réalisée en réalisant n = 3 expériences indépendantes pour collecter des données et déterminer et fournir des moyennes et des écarts types.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Gene locus_tag et le code de l'organisme ont été adoptés à partir de ceux d'une base de données, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (https://www.genome.jp/kegg/). Images de gel non recadrées des images de gel présentées dans les Figs supplémentaires. 2 et 3 sont affichés dans la Fig. 23 supplémentaire. Toutes les données des graphiques à barres des Fig. 4a à c sont présentées dans les Données supplémentaires 1. Ht-Urdpase1, Hx-Urdpase1, Hl-Urdpase1, Hx-HAD hydrolase, Hx-FucA et Hs-GaR sont déposées dans GenBank avec les numéros d'accès LC735265, LC735266, LC735267, LC735268, LC735269, LC735270, LC735271, LC735272, LC735273 , et LC735274, respectivement.

Bräsen, C., Esser, D., Rauch, B. & Siebers, B. Métabolisme des glucides chez Archaea: aperçu actuel des enzymes et des voies inhabituelles et de leur régulation. Microbiol. Mol. Biol. Rév. 78, 89–175 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sato, T. & Atomi, H. Nouvelles voies métaboliques chez Archaea. Courant. Avis. Microbiol. 14, 307–314 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Verhees, CH et al. Les caractéristiques uniques des voies glycolytiques chez Archaea. Biochimie. J. 375, 231-246 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wamelink, MM, Struys, EA & Jakobs, C. La biochimie, le métabolisme et les défauts héréditaires de la voie des pentoses phosphates : une revue. J. Héritage. Métab. Dis. 31, 703–717 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kato, N., Yurimoto, H. & Thauer, RK Le rôle physiologique de la voie du monophosphate de ribulose chez les bactéries et les archées. Biosci. Biotechnol. Biochimie. 70, 10–21 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Orita, I. et al. La voie du ribulose monophosphate remplace la voie manquante du pentose phosphate chez l'archéon Thermococcus kodakaraensis. J. Bactériol. 188, 4698–4704 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soderberg, T. Biosynthèse du ribose-5-phosphate et de l'érythrose-4-phosphate chez les archées : une analyse phylogénétique des génomes des archées. Archaea 1, 347–352 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Aitken, DM & Brown, AD Cycles de citrate et de glyoxylate dans l'halophile Halobacterium salinarium. Biochim. Biophys. Acta 177, 351–354 (1969).

Article CAS PubMed Google Scholar

Falb, M. et al. Métabolisme des archées halophiles. Extrémophiles 12, 177–196 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pickl, A. & Schönheit, P. La voie oxydative des pentoses phosphates dans l'haloarchéon Haloferax volcanii implique un nouveau type de glucose-6-phosphate déshydrogénase, l'archée Zwischenferment. FEBS Lett. 589, 1105-1111 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bult, CJ et al. Séquence complète du génome de l'archéon méthanogène, Methanococcus jannaschii. Sciences 273, 1058-1073 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Grochowski, LL, Xu, H. & White, RH La biosynthèse du ribose-5-phosphate chez Methanocaldococcus jannaschii se produit en l'absence d'une voie pentose-phosphate. J. Bactériol. Rév. 187, 7382–7389 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aono, R., Sato, T., Imanaka, T. & Atomi, H. Une voie de pentose bisphosphate pour la dégradation des nucléosides chez Archaea. Nat. Chim. Biol. 11, 355–360 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Aono, R. et al. Caractérisation enzymatique de l'AMP phosphorylase et de la ribose-1,5-bisphosphate isomérase fonctionnant dans une voie métabolique archéenne de l'AMP. J. Bactériol. 194, 6847–6855 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sato, T., Atomi, H. & Imanaka, T. Fonction des RuBisCO archéens de type III dans une voie du métabolisme de l'AMP. Sciences 315, 1003-1006 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ezaki, S., Maeda, N., Kishimoto, T., Atomi, H. & Imanaka, T. Présence d'une ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygénase de type structurellement nouveau dans l'archéon hyperthermophile, Pyrococcus kodakaraensis KOD1. J. Biol. Chim. 274, 5078–5082 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kitano, K. et al. Structure cristalline d'un rubisco archéen de type roman à symétrie pentagonale. Structure 9, 473–481 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Maeda, N. et al. Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygénase de l'archéon hyperthermophile Pyrococcus kodakaraensis KOD1 est composé uniquement de grandes sous-unités et forme une structure pentagonale. J. Mol. Biol. 293, 57–66 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Watson, GM, Yu, JP & Tabita, FR Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase inhabituelle d'Archaea anoxique. J. Bactériol. Rév. 181, 1569–1575.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hove-Jensen, B., Brodersen, DE & Manav, MC Le composé prodigue : retour du ribosyl 1,5-bisphosphate en tant qu'acteur important du métabolisme. Microbiol. Mol. Biol. Rév. 83, e00040–18 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wrighton, KC et al. RubisCO d'une voie nucléosidique connue d' Archaea se trouve dans divers phylums non cultivés chez les bactéries. ISME J. 10, 2702–2714 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hansen, T., Reichstein, B., Schmid, R. et Schönheit, P. La première glucokinase archéenne dépendante de l'ATP, issue du crenarchaeon hyperthermophile Aeropyrum pernix, représente une glucokinase ROK monomère extrêmement thermophile avec une large spécificité d'hexose. J. Bactériol. 184, 5955–5965 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kengen, SW, Tuininga, JE, de Bok, FA, Stams, AJ & de Vos, WM Purification et caractérisation d'une nouvelle glucokinase ADP-dépendante de l'archéon hyperthermophile Pyrococcus furiosus. J. Biol. Chim. 270, 30453–30457 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sakuraba, H., Mitani, Y., Goda, S., Kawarabayasi, Y. & Ohshima, T. Clonage, expression et caractérisation de la première glucokinase archée dépendante de l'ATP de l'archéon hyperthermophile aérobie Aeropyrum pernix. J. Biochem. 133, 219-224 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hansen, T. & Schönheit, P. Purification et propriétés de la 6-phosphofructokinase archée, dépendante de l'ATP, identifiée pour la première fois, une enzyme non allostérique extrêmement thermophile, de l'hyperthermophile Desulfurococcus amylolyticus. Cambre. Microbiol. 173, 103–109 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tuininga, JE et al. Caractérisation moléculaire et biochimique de la phosphofructokinase ADP-dépendante de l'archéon hyperthermophile Pyrococcus furiosus. J. Biol. Chim. 274, 21023-21028 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Makino, Y. et al. Une sérine kinase archéenne ADP-dépendante impliquée dans la biosynthèse de la cystéine et le métabolisme de la sérine. Nat. Commun. 7, 13446 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mori, Y. et al. Identification et analyse enzymatique d'une sérine kinase archéenne dépendante de l'ATP de l'archéon hyperthermophile Staphylothermus marinus. J. Bactériol. 203, e0002521 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Aziz, I. et al. Un homologue de la phosphofructokinase de Pyrobaculum calidifontis présente une activité kinase vis-à-vis des nucléosides pyrimidiques et du ribose 1-phosphate. J. Bactériol. 200, e00284–18 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ng, WV et al. Séquence du génome de l'espèce Halobacterium NRC-1. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 97, 12176–12181 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anderson, I. et al. Séquence complète du génome de la souche de type Halopiger xanaduensis (SH-6T). Rester. Génome. Sci. 6, 31–42 (2012).

Article CAS Google Scholar

Anderson, IJ et al. Séquence complète du génome de la souche de type Antarctique Halorubrum lacusprofundi ACAM 34. Stand. Génome. Sci. 11, 70 (2016).

Article Google Scholar

Saunders, E. et al. Séquence complète du génome de la souche de type Haloterrigena turkmenica (4kT). Rester. Génome. Sci. 2, 107-116 (2010).

Article Google Scholar

Caparrós-Martín, JA, McCarthy-Suárez, I. & Culiáñez-Macià, FA Fonction hydrolase HAD dévoilée par criblage de substrat : caractérisation enzymatique de la sous-classe I d'Arabidopsis thaliana phosphosugar phosphatase AtSgpp. Plante 237, 943–954 (2013).

Article PubMed Google Scholar

Imker, HJ, Fedorov, AA, Fedorov, EV, Almo, SC & Gerlt, JA Diversité mécaniste dans la superfamille RuBisCO : "l'énolase" dans la voie de récupération de la méthionine chez Geobacillus kaustophilus. Biochimie 46, 4077–4089 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ghalambor, MA & Heath, EC Le métabolisme du l-fucose. II. Le clivage enzymatique du l-fuculose 1-phosphate. J. Biol. Chim. 237, 2427-2433 (1962).

Article CAS PubMed Google Scholar

Koga, Y., Kyuragi, T., Nishihara, M. et Sone, N. Les cellules archéennes et bactériennes sont-elles apparues indépendamment des précurseurs non cellulaires ? Une hypothèse selon laquelle l'avènement des phospholipides membranaires avec des squelettes glycérophosphates énantiomères a provoqué la séparation des deux lignées de descendance. J. Mol. Évol. 46, 54–63 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nishihara, M. & Koga, Y. sn-Glycerol-1-phosphate déshydrogénase chez Methanobacterium thermoautotrophicum : enzyme clé dans la biosynthèse du squelette glycérophosphate énantiomère des éther phospholipides des archaebactéries. J. Biochem. 117, 933–935 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nishihara, M. & Koga, Y. Purification et propriétés de la sn-glycérol-1-phosphate déshydrogénase de Methanobacterium thermoautotrophicum : caractérisation de l'enzyme biosynthétique pour le squelette glycérophosphate énantiomère des lipides polaires éther d'Archaea. J. Biochem. 122, 572-576 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hove-Jensen, B., Rosenkrantz, TJ, Haldimann, A. & Wanner, BL Escherichia coli phnN, codant pour l'activité ribose 1,5-bisphosphokinase (formation de phosphoribosyl diphosphate): double rôle dans la dégradation des phosphonates et les voies de biosynthèse du NAD. J. Bactériol. 185, 2793-2801 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Les auteurs sont reconnaissants à Mme Eriko Kusaka et M. Haruo Fujita pour l'analyse RMN. Nous remercions le professeur Itaru Hamachi d'avoir fourni l'appareil pour l'analyse LC-MS. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (Grant Number : 18K05411) et Noda Institute for Scientific Research to TS et par le programme CREST de l'Agence japonaise des sciences et technologies (Grant Number : 10104047), JSPS KAKENHI grant number 18H03934 et JP19H05679 (Post- Koch Ecology), JP19H05684 à HA

Département de chimie synthétique et de chimie biologique, École supérieure d'ingénierie, Université de Kyoto, Kyoto, Japon

Takaaki Sato, Sanae (Hodo) Utashima, Yuta Yoshii, Kosuke Hirata, Shuichiro Kanda, Yushi Onoda, Jian-qiang Jin, Suyi Xiao, Ryoko Minami, Hikaru Fukushima et Haruyuki Atomi

Centre de recherche intégré pour la science du carbone négatif, Université de Kyoto, Kyoto, Japon

Takaaki Sato et Haruyuki Atomi

Département de chimie, École supérieure des sciences, Université d'Osaka, Osaka, Japon

Ayako Noguchi, Yoshiyuki Manabe et Koichi Fukase

Forefront Research Center, Université d'Osaka, Osaka, Japon

Yoshiyuki Manabe et Koichi Fukase

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

HA et TS ont conçu le travail. SU a analysé l'isomérase R15P. SU, AN, YM, KF ont examiné la kinase R1P. YY, SU a étudié la RuBP phosphatase. YY, SU, JJ ont examiné l'aldolase Ru1P. SK, HF ont examiné la guanosine phosphorylase. KH, RM a étudié la glycolaldéhyde réductase native. SX a examiné la glycolaldéhyde réductase recombinante. YO a étudié les activités enzymatiques dans les cellules de H. salinarum. TS, SU, YY, KH, SK, YO, JJ, SX, HA ont écrit le manuscrit.

Correspondance à Haruyuki Atomi.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Bettina Siebers et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef principaux : Nishith Gupta et Karli Montague-Cardoso.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Sato, T., Utashima, S. (., Yoshii, Y. et al. Une voie non carboxylante de pentose bisphosphate dans les archées halophiles. Commun Biol 5, 1290 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003 -022-04247-2

Télécharger la citation

Reçu : 28 juillet 2022

Accepté : 10 novembre 2022

Publié: 24 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04247-2

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.