Dosage immunologique qualitatif pour la détermination des résidus d'antibiotique tétracycline dans des échantillons de lait suivi d'une HPLC quantitative améliorée

Jun 19, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 14502 (2022) Citer cet article

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Le contaminant environnemental est l'un des nombreux problèmes qui nuisent aux personnes et à la faune. Un exemple de contaminants émergents actuels sont les résidus d'antibiotiques qui peuvent être présents dans l'eau et les aliments. Bien que les antibiotiques soient destinés à traiter ou à prévenir les infections humaines et animales, les antibiotiques ont également été utilisés comme compléments alimentaires pour animaux pour leur capacité à favoriser la croissance et l'efficacité alimentaire. Cette surutilisation des antibactériens a entraîné l'accumulation de résidus d'antibiotiques dans les produits alimentaires qui sont finalement consommés par l'homme. L'exposition inutile et continue de l'homme aux antibiotiques par la rencontre directe des animaux ou le lait, ou indirectement par les plantes ou le sol, peut augmenter le risque d'émergence de bactéries multirésistantes et, par conséquent, nuire à la santé humaine. De nouvelles réglementations ont été imposées concernant l'utilisation des antibiotiques. En raison de la rareté des données concernant les conditions de résidus d'antibiotiques dans différents types d'aliments destinés à la consommation humaine en Arabie saoudite, cette étude a proposé une méthode chromatographique optimisée (HPLC-DAD) suivie d'une approche d'immunodosage pour détecter spécifiquement les antibiotiques tétracyclines dans les échantillons de lait animal. La méthode a été réalisée à l'aide d'une colonne RP-C18 avec une phase mobile constituée de 0,01 M KH2PO4 : acétonitrile : méthanol (70 : 20 : 10, v/v/v) ajusté à pH 4. Des améliorations ont été observées dans la méthode en termes de résolution et de sensibilité. La méthode de précipitation des protéines utilisée pour l'extraction a démontré des pourcentages de récupération élevés de 85 à 101 %. La méthode a été validée selon les directives de la Conférence internationale pour l'harmonisation (ICH). Il ressort clairement de ces conclusions que la présence de résidus d'antibiotiques tétracycline et oxytétracycline dans les produits laitiers du marché saoudien est inférieure aux limites résiduelles maximales (LMR).

La pollution de l'environnement est un défi auquel le monde est confronté au cours du siècle actuel. Ce problème est défini comme "la contamination des composants physiques et biologiques du système terre/atmosphère à un point tel que les processus environnementaux normaux sont affectés"1. Les substances ou l'énergie présentes au-dessus des niveaux naturels sont considérées comme des polluants1. Les résidus d'antibiotiques sont une forme de contaminant environnemental qui peut être présent dans les animaux, les plantes ou le sol et peut favoriser le développement de résistances microbiennes. La résistance microbienne résultant de l'utilisation et de l'exposition inutiles aux antibiotiques est définie comme des modifications des mécanismes de résistance bactérienne ou le développement de nouveaux mécanismes en réponse à des antibiotiques spécifiques, à une classe d'antibiotiques ou à plusieurs types d'antibiotiques contre ce que l'on appelle des agents pathogènes multirésistants ( MDR)2. Afin de préserver l'activité antimicrobienne, les autorités réglementaires ont restreint le processus de prescription des antibiotiques. Cependant, les antibiotiques sont également utilisés comme conservateurs alimentaires, pour favoriser la croissance et pour améliorer la productivité des bovins et de la volaille en plus de leur utilisation en médecine vétérinaire3,4,5. Des recherches antérieures ont démontré que l'utilisation de niveaux élevés d'antibiotiques pour augmenter la productivité animale est associée à la présence de résidus d'antibiotiques dans les aliments d'origine animale6,7,8. L'exposition continue de l'homme aux résidus d'antibiotiques peut être nocive pour l'homme, augmentant la possibilité de développer des réactions allergiques, de perturber la flore intestinale normale ou de transférer des bactéries résistantes aux antibiotiques (ARA) ou des gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) des animaux aux humains5.

La tétracycline (TTR), la chlortétracycline (CTC) et l'oxytétracycline (OXY) sont parmi les antibiotiques les plus couramment utilisés en élevage en raison de leur efficacité et de leur faible coût9,10. De nombreuses études ont démontré l'utilisation inappropriée de ces antibiotiques dans le monde et les conséquences d'une telle pratique6,11. Par exemple, il existe une utilisation incontrôlée d'antibiotiques dans l'alimentation mixte des animaux ou comme conservateurs dans l'industrie alimentaire12,13. De plus, les antibiotiques sont souvent administrés aux animaux directement avant l'abattage ou introduits dans l'artère carotide immédiatement après l'abattage pour augmenter la période de stockage de la viande fraîche12. À terme, les concentrations résiduelles d'antibiotiques peuvent dépasser les limites résiduelles maximales (LMR) autorisées par l'Union européenne (UE) et l'Organisation mondiale de la santé (OMS).

Les méthodes de détermination des antibiotiques tétracyclines (TC) ont été largement étudiées par de nombreuses méthodes analytiques dans différents échantillons de produits alimentaires ainsi que des échantillons environnementaux. Par exemple, Al-Ghamdi et al. ont confirmé l'utilisation abusive d'antibiotiques TC dans les produits à base de volaille dans la région orientale de l'Arabie saoudite en utilisant une méthode microbiologique14. De plus, deux autres études réalisées dans la région d'Al-Ahsa'a ont montré la présence de résidus d'antibiotiques chez les animaux. La première étude a utilisé la LC-MS/MS pour dépister neuf résidus d'antibiotiques (quinolones, fluoroquinolones, sulfamides et tétracyclines) dans les tissus des chameaux, des bovins et des ovins15. Le second, réalisé par Al-Nazawi et al., a utilisé le test Delvotest P Multi plate pour dépister principalement les TC, la streptomycine et la néomycine dans les produits laitiers16.

Une grande partie de la littérature actuelle utilise la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse LC-MS/MS comme méthode la plus appropriée pour la détection et la quantification des antibiotiques multiclasses dans les échantillons d'aliments et de lait17,18. D'autres techniques ont été rapportées pour la détermination des résidus d'antibiotiques TCs dans les échantillons de lait, notamment l'électrophorèse capillaire (CE-FL19 et CE-DAD20), une détection microbiologique21 et une méthode spectroscopique22. Les données de deux articles de synthèse récents ont révélé l'utilisation de kits immunologiques comme outil de surveillance des résidus d'antibiotiques tétracyclines dans le lait12,17. Le tableau 1 résume certaines méthodes chromatographiques signalées pour la détermination des résidus d'antibiotiques TC dans des échantillons de lait par HPLC-DAD. Ces articles de synthèse mettent en évidence un certain nombre de similitudes entre les méthodes publiées. La grande majorité des études ont utilisé une phase stationnaire C18 avec HPLC12 en phase inverse. De plus, il a été noté que les mélanges binaires eau-acétonitrile ou eau-méthanol avec différentes concentrations de composants organiques sont plus fréquemment utilisés que les mélanges tertiaires (eau-acétonitrile-méthanol). Les acides oxalique, formique, acétique et citrique sont parmi les produits chimiques les plus couramment utilisés dans la phase mobile12,23. Des systèmes d'élution par gradient ont été rapportés avec des échantillons complexes et des mélanges d'antibiotiques, permettant d'effectuer une séparation12.

L'objectif principal de l'étude était de déterminer les résidus d'antibiotiques tétracyclines dans des échantillons de lait du marché saoudien par HPLC couplée à la technique DAD.

Les matériaux de référence de l'oxytétracycline (98,07 % de pureté RMN), de la tétracycline (> 98,00 %), de la chlortétracycline (> 95,00 %) et de l'ornidazole standard interne (ORZ, > 99,00 %) ont été achetés auprès de Haoyuan ChemExpress Co., Ltd. (Shanghai, Chine ). L'orthophosphate dihydrogène de potassium anhydre (KH2PO4) a été obtenu auprès de Loba Chemie Pvt. Ltd. (Mumbai, Inde). Le sel disodique dihydraté de l'acide éthylènediaminetétraacétique (Na2EDTA) a été obtenu auprès de Sigma – Aldrich Chemie Gmbh (Steinheim, Allemagne). L'acide orthophosphorique (H3PO4) a été obtenu auprès d'Avonchem Ltd. (Cheshire, Royaume-Uni). Les solvants acétonitrile et méthanol dans la phase mobile étaient de qualité UHPLC et HPLC. De l'eau déminéralisée a été utilisée dans toutes les expériences. Des échantillons de lait ont été achetés sur plusieurs marchés locaux et fermes de la ville de Riyad. Les kits de test immunologique rapide de tétracycline ont été obtenus auprès de Meizheng Biotech Group, une société PerkinElmer (Pékin, Chine). Le système HPLC (Waters, Milford, MA, USA) consistait en une pompe HPLC binaire Waters 1525, un détecteur à réseau de photodiodes Waters 2998 et un échantillonneur automatique Waters 2707. Les données ont été acquises et traitées à l'aide du logiciel Waters Empower 3.

Les séparations chromatographiques ont été réalisées sur une colonne Reverse-Phase Macherey – Nagel C18 (250 × 4,5 mm id, granulométrie 5 μm). La phase mobile était un mélange de dihydrogénophosphate de potassium 10 mM : acétonitrile : méthanol dans un rapport de 70:20:10 (v/v/v), et le pH a été ajusté à 4 avec de l'acide orthophosphorique 0,01 M. La phase mobile a été filtrée à travers un papier filtre Whatman de 0,45 µm suivi d'un dégazage pendant 10 min, puis délivrée à un débit de 1 mL/min. L'analyse a été effectuée à 25 ° C et l'élution des composés a été contrôlée avec un détecteur à barrette de diodes (DAD) de 210 à 600 nm. Les chromatogrammes ont été enregistrés à 358 nm et le volume d'injection était de 50 µl.

Des solutions mères (1) à des concentrations de 1 mg/mL pour OXY, TTR, CTC et l'étalon interne ORZ ont été préparées dans du méthanol. Une dilution supplémentaire a été nécessaire pour préparer la solution mère mixte (2) à une concentration de 10 µg/mL pour chaque solution, et les concentrations de travail utilisées étaient de 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 et 1 µg/mL. La solution mère d'étalon interne (2) a été préparée séparément par la même procédure. Les solutions ont été conservées au congélateur (-20 ℃) ​​et à l'abri de la lumière pendant une durée d'un mois24,25.

Les échantillons de lait (n = 100) ont été classés principalement selon leur espèce en lait de vache, de chamelle et de chèvre. D'autres classifications comprenaient leur source (produit commercial local/produit commercial importé/fermes locales), la durée de vie (frais/longue conservation), la teneur en matières grasses (lait entier, faible en gras et écrémé) et l'alimentation (biologique/non biologique). Les informations sur les échantillons sont présentées dans le tableau 2. Le lait a été acheté sur les marchés et les fermes saoudiens locaux (ville de Riyad) au cours des mois d'octobre à novembre 2021 et de février 2022.

L'extraction d'un échantillon de lait consiste à ajouter un solvant organique pour précipiter la protéine et un agent chélateur. Cette technique est courante et a été utilisée dans de nombreuses études23. Les échantillons ont été préparés selon la procédure suivante. Le processus d'extraction a commencé en mélangeant 2 ml d'un échantillon de lait avec 0,4 ml de Na2EDTA 0,2 M et 0,6 ml de méthanol dans des tubes à centrifuger en polypropylène. Une fois qu'une solution homogène s'est formée, le tube a été centrifugé à 16 000 tr/min pendant 20 min, filtré à travers un filtre seringue Whatman de 0,22 µm dans un flacon HPLC pour analyse.

Le kit de test rapide de tétracycline est un test qualitatif qui détermine la présence de résidus d'antibiotiques tétracyclines dans le lait de vache et de chamelle. Les composants du kit doivent atteindre la température ambiante (20–25 ℃) avant utilisation. Des échantillons de lait ont été secoués et ajoutés aux micropuits (200 µL d'échantillons de lait de vache et 100 µL d'échantillons de lait de chamelle dilués avec 100 µL d'eau déminéralisée). La poudre de conjugué d'enrobage a été dissoute en pipetant le contenu de haut en bas 5 fois. Les mélanges d'échantillons ont été incubés pendant 2 min à température ambiante avant de placer la bandelette de test dans les micropuits. Les bandelettes de test ont été observées pour le développement de la couleur pendant 5 min, puis retirées, et les résultats ont été interprétés en 1 min.

Après avoir passé en revue la littérature, il a été noté que de nombreuses méthodes d'analyse des TC sont réalisées en utilisant l'acide oxalique comme solution d'acide organique dans la phase mobile, en plus de l'acétonitrile et du méthanol comme modificateurs organiques. Des expériences préliminaires sur ces conditions ont révélé les effets de chaque composant de phase mobile. Par exemple, l'augmentation du rapport d'acétonitrile au-dessus de 20 % a considérablement réduit la résolution. Pour optimiser la méthode sur des matériaux de référence, différentes concentrations d'acide oxalique avec différents ratios du modificateur organique ont été étudiées. Le rapport de phase mobile préliminaire était de 70:20:10 (v/v/v) solution d'acide oxalique 10 mM, acétonitrile et méthanol, respectivement. Conformément aux publications précédentes, nos résultats ont indiqué que l'acide oxalique 25 mM présentait une résolution optimale par rapport aux autres concentrations testées (0, 10, 40, 50 et 60 mM). Nos résultats ont également montré que des temps de rétention plus courts ont été observés avec de l'acide oxalique 10 mM.

En ce qui concerne les modificateurs organiques, une séparation des pics avec une résolution satisfaisante a été démontrée avec l'acétonitrile seul comme modificateur organique à un rapport de 20 %. Cependant, l'utilisation d'acétonitrile seul a augmenté le temps de rétention jusqu'à 30 min. qui a révélé que le méthanol et l'acétonitrile sont nécessaires pour des conditions optimales. L'augmentation des rapports supérieurs à 20 % et 10 % pour l'acétonitrile et le méthanol, respectivement, a entraîné une réduction significative de la résolution, tandis que la diminution de ces rapports a entraîné une durée d'exécution plus longue. Ces résultats appuient largement les travaux d'autres études dans le cas de l'analyse du matériau de référence standard, car cette méthode n'a pas réussi à fournir une résolution acceptable lorsqu'elle est appliquée aux matrices laitières. Étonnamment, une interférence maximale a été démontrée entre un composant de la matrice du lait et les pics des TC. Par conséquent, aucune résolution acceptable n'a été obtenue, ce qui suggère une optimisation supplémentaire de la méthode sur une matrice de lait dopée. Les figures 1 et 2 présentent un aperçu des chromatogrammes expérimentaux pour les effets de la modification de la concentration d'acide oxalique sur la matrice de lait enrichie en drogue. Contrairement aux attentes, ces essais n'ont pas pu aboutir à une résolution raisonnable ; les méthodes n'ont pas réussi à séparer le pic de matrice des pics de médicament, malgré les différents ratios et concentrations utilisés. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que la phase mobile à base d'acide oxalique n'est pas adaptée aux matrices laitières.

Effets de la modification de la concentration d'acide oxalique sur les médicaments enrichis en lait de vache. (a) Acide oxalique 5 mM:ACN:MeOH (70:20:10). (b) Acide oxalique 10 mM : ACN : MeOH (70 : 20 : 10). (c) Acide oxalique 15 mM:ACN:MeOH (70:20:10). Conditions chromatographiques : Volume d'injection : 30 µL, Température : 25 ℃, Débit : 1 mL/min, Longueur d'onde de détection : 358 nm.

Effets de la modification de la concentration d'acide oxalique sur les médicaments enrichis en lait de vache. (a) Acide oxalique 25 mM : ACN : MeOH (70:20:10). (b) Acide oxalique 30 mM : ACN : MeOH (70 : 20 : 10). (c) Acide oxalique 50 mM : ACN : MeOH (70 : 20 : 10). Conditions chromatographiques : Volume d'injection : 30 µL, Température : 25 ℃, Débit : 1 mL/min, Longueur d'onde de détection : 358 nm.

Des travaux antérieurs ont soulevé la possibilité de remplacer l'acide oxalique par du dihydrogénophosphate de potassium KH2PO4 comme sel inorganique dans la phase mobile avec les modificateurs organiques pour la détermination des antibiotiques TC. Par exemple, la détermination de l'OXY et du TTR dans des échantillons de lait a été réalisée en utilisant un système d'élution isocratique de dihydrogénophosphate de potassium 0,05 M (pH 2,8)/ACN (80:20, v/v)26. Le résultat de l'expérience pratique préliminaire était prometteur, encourageant de nouvelles recherches évaluant différentes concentrations de KH2PO4 avec différents ratios de modificateur organique.

Initialement, 0,025 M KH2PO4 avec ACN et MeOH dans différents rapports ont été testés. Cependant, la diminution de KH2PO4 à 0,01 M a montré une meilleure résolution. La figure 3 représente l'effet de la modification des ratios de compositions mobiles sur la matrice de lait dopé. La découverte la plus significative est peut-être qu'une bonne séparation est obtenue avec la phase mobile à un rapport de 70:20:10 de KH2PO4 : ACN : MeOH. Cependant, une réduction de la sensibilité a été notée, ce qui devait être dû à la perte du pharmacophore dans la structure chimique des TC et le pH de la phase mobile avait changé. Par conséquent, le pH de la phase mobile a été évalué pour augmenter la sensibilité.

Effet de la concentration de KH2PO4 sur le lait de vache dopé. (a) KH2PO4 25 mM : ACN : MeOH (70:20:10). (b) KH2PO4 10 mM : ACN : MeOH (70:20:10).

L'influence du pH a été évaluée en utilisant de l'acide orthophosphorique 0,1 M pour ajuster le mélange de phase mobile de 0,01 M KH2PO4:ACN:MeOH dans un rapport de 70:20:10 dans la plage de pH de 2 à 5,5. La modification du pH a été évaluée en termes d'effet sur la résolution et la sensibilité. Une augmentation de la résolution a été notée vers le pH de 5,5, tandis que dans cette région la sensibilité a été perdue. La diminution du pH à près de 2–3 a amélioré la sensibilité, mais la résolution a été diminuée. A pH 4, la phase mobile a montré une résolution satisfaisante et une sensibilité acceptable pour les besoins de l'étude, par conséquent, a été choisie pour l'évaluation des échantillons de lait. La figure 4 montre un chromatogramme pour la méthode proposée.

Le chromatogramme de la méthode proposée. Conditions chromatographiques : KH2PO4 10 mM : ACN : MeOH (70:20:10), Volume d'injection : 50 µL, Température : 25 ℃, Débit : 1 mL/min, Longueur d'onde de détection : 358 nm.

Bien que seules des traces de chlortétracycline (CTC) aient été détectées, l'ajustement du pH de la phase mobile à 4 a fourni une bonne résolution et sensibilité. Alternativement, augmenter le volume d'injection pour augmenter la détection et abaisser les limites de quantification pour le CTC. Une règle empirique consiste à maintenir le volume d'injection aussi bas que possible pour éviter la surcharge de la colonne et l'élargissement du pic27. Une augmentation progressive du volume d'injection a été examinée pour s'assurer que de faibles concentrations de CTC étaient détectées sans signes d'élargissement du pic. Le volume d'injection a été fixé à 50 µL, car il est dans la capacité de l'instrument, et aucun signe d'élargissement du pic n'a été observé (Fig. 4).

Les spectres d'absorption des trois médicaments, OXY, TTR et CTC, ont été étudiés avec un DAD dans la gamme de longueurs d'onde de 200 à 600 nm. Les spectres des trois médicaments ont révélé deux valeurs lambda max, 267 nm et 358 nm. La longueur d'onde de 358 nm a été choisie comme longueur d'onde de détection optimale car la matrice de l'échantillon est complexe et de nombreux pics interférents sont apparus à 267 nm. La figure 5 montre les spectres d'absorbance des analytes ciblés.

Spectres d'absorbance des analytes ciblés (a) oxytétracycline, (b) tétracycline, (c) chlortétracycline et (d) étalon interne.

La procédure d'extraction a été développée pour obtenir un bon pourcentage de récupération tout en maintenant un échantillon concentré. Les méthodes rapportées précédemment indiquaient que les matrices alimentaires avaient une teneur élevée en protéines, par conséquent, la précipitation des protéines est utilisée dans l'étape de prétraitement17. De plus, les molécules de TC ont une grande affinité pour former des chélates de complexes métalliques avec des cations métalliques polyvalents tels que le calcium et le magnésium (Ca+2 et Mg+2), cependant, cette formation complexe pourrait être empêchée en ajoutant un agent chélateur à l'échantillon12. L'acide éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA) et des solvants organiques tels que l'acétonitrile et le méthanol ont été largement utilisés dans le prétraitement des échantillons de lait23. Dans la procédure d'extraction proposée, trois facteurs clés pouvant affecter le pourcentage de récupération et la concentricité de l'échantillon ont été identifiés : (1) le volume du solvant organique, (2) la concentration de l'agent chélatant et (3) la temps et vitesse de centrifugation. Le volume de méthanol a été maintenu au minimum pour éviter la dilution de l'échantillon. L'EDTA de sodium (Na2-EDTA), qui est plus facilement soluble dans l'eau que l'EDTA, a été utilisé dans cette méthode comme agent chélatant sans autre ajustement du pH. Il a été démontré que l'augmentation du temps et de la vitesse de centrifugation et de la concentration de Na2-EDTA à 0,2 M a entraîné une augmentation significative de la transparence du surnageant et du pourcentage de récupération.

La validation de la méthode a été effectuée par analyse statistique conformément aux directives du Conseil international pour l'harmonisation ICH28. Les paramètres de validation ont été évalués sur le matériel de référence du médicament et sur les trois différentes matrices laitières (vache, chamelle et chèvre). La sélectivité et le pourcentage de récupération ont été étudiés sur des matrices de lait en plus de la linéarité, des limites de détection et de quantification, de la précision et de l'exactitude.

La réponse de linéarité de chaque médicament a été déterminée en traçant le rapport de la surface du pic du médicament sur la surface du pic de l'IS par rapport à la concentration du médicament, puis les équations de régression ont été établies. La courbe d'étalonnage était linéaire dans la plage de 0,09 à 1 µg/mL (90 à 1 000 ng/mL) pour chaque médicament. Les coefficients de corrélation étaient > 0,9998 pour chaque médicament, montrant que la méthode est linéaire dans la plage spécifiée. Les concentrations utilisées pour la courbe d'étalonnage étaient de 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 et 1 µg/mL.

Les limites de détection et de quantification ont été déterminées en fonction du rapport signal sur bruit. La limite de détection a été définie comme un rapport signal sur bruit de 3:1, tandis que la limite de quantification a été définie comme un rapport signal sur bruit de 10:1. Les limites de détection OXY et TTR étaient de 20 ng/mL (0,020 µg/mL), tandis que la limite de détection de CTC était de 80 ng/mL (0,080 µg/mL). La limite de quantification était de 50 ng/mL (0,050 µg/mL) pour OXY et TTR et de 90 ng/mL (0,090 µg/mL) pour CTC.

L'exactitude a été évaluée en préparant différentes concentrations de mélanges de médicaments dans la plage linéaire et une concentration fixe d'ornidazole comme IS (0,8 µg/mL), puis en calculant le % de récupération et l'erreur relative. Le tableau 3 montre un bon % de récupération (concentration théorique/concentration pratique %) et une petite erreur relative pour OXY, TTR et CTC. Pour la précision intrajournalière, les mêmes concentrations de médicament utilisées pour évaluer la précision ont été analysées trois fois le même jour, puis les deux jours suivants pour évaluer la précision interjournalière. Les valeurs de l'écart type relatif (RSD) ont été calculées pour chaque médicament et concentration dans le tableau 3. Des valeurs RSD faibles (< 2) indiquent un haut degré de précision.

La sélectivité de la méthode a été évaluée en examinant le chromatographe de l'échantillon de lait à blanc (exempt d'analytes testés par immunodosage et HPLC avant dopage) par rapport à un échantillon dopé de lait et d'eau. Les trois matrices de lait n'ont montré aucun pic interférant aux temps de rétention des analytes ; ainsi, la méthode s'est avérée spécifique pour les TC dans la matrice laitière. La figure 6 montre un exemple de la sélectivité de la méthode sur le lait de vache (l'échantillon de lait blanc versus l'échantillon de lait et d'eau dopé).

Sélectivité de la matrice lait de vache. phase mobile : KH2PO4 10 mM : ACN : MeOH (70 : 20 : 10), pH 4.

Les pourcentages de récupération ont été calculés comme le rapport de la réponse du lait dopé aux échantillons d'eau dopés à la même concentration. Les pourcentages de récupération d'OXY, de TTR et de CTC dans la matrice laitière se situaient dans la plage spécifiée (80 à 120 %). Les pourcentages moyens de récupération ± ET de l'OXY, du TTR et du CTC dans le lait de vache étaient de 94,45 % ± 4,00, 88,77 % ± 3,89 et 89,86 % ± 2,41, respectivement. Pour le lait de chamelle et de chèvre, ils étaient de 101,20 % ± 4,05, 98,43 % ± 2,28 et 89,33 % ± 11,03 et (96,45 % ± 2,10, 92,73 % ± 3,95 et 86,70 % ± 1,95 pour OXY, TTR et CTC, respectivement.

La réponse de linéarité de chaque médicament dans les trois matrices de lait a été déterminée en traçant le rapport de la surface du pic de médicament sur la surface du pic d'IS par rapport à la concentration de médicament dopée dans l'échantillon de lait vierge, puis les équations de régression ont été établies et présentées dans le tableau 4. Les courbes d'étalonnage étaient linéaires dans la plage de 0,09 à 1 µg/mL pour OXY et TTR, alors que la plage de CTC était de 0,200 à 1 µg/mL (200 à 1 000 ng/mL). Les coefficients de corrélation étaient ≥ 0,9997 pour chaque médicament, ce qui montre que la méthode est linéaire dans une plage spécifiée. Les concentrations utilisées pour la courbe d'étalonnage étaient de 0,09, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1 µg/mL.

Les limites de détection et de quantification ont été déterminées en fonction du rapport signal sur bruit. La limite de détection a été définie comme un rapport signal sur bruit de 3:1, tandis que la limite de quantification a été définie comme un rapport signal sur bruit de 10:1. Le tableau 4 montre les équations de régression et les valeurs r pour chaque médicament dans les matrices laitières en plus de la limite de détection (LOD) et de la limite de quantification (LOQ). Bien que la LMR de CTC dans le lait soit de 0,100 µg/mL, ici la concentration de CTC la plus fréquemment détectée dans la matrice du lait était de 0,180 µg/mL, et la capacité de quantification a commencé à seulement 0,200 µg/mL, ce qui est considéré comme un inconvénient de la méthode.

La précision et l'exactitude ont été étudiées dans des échantillons de lait dopés et analysées trois fois le même jour et les trois jours successifs. Le tableau 5 révèle que la méthode proposée a un degré élevé d'exactitude et de précision.

L'approche méthodologique adoptée dans cette étude est une combinaison d'analyse qualitative et quantitative. En employant une approche qualitative, il a été plus facile de mener cette étude exploratoire dans le but de balayer la taille d'échantillon la plus élevée possible. La technique d'immunodosage est utile pour identifier les échantillons positifs en peu de temps. Le kit de test rapide TCs utilisé est un test à flux latéral qui peut déterminer qualitativement les résidus de TCs dans le lait de vache et de chamelle (100 µg/kg). Une bandelette de test est composée d'un tampon absorbant à l'extrémité inférieure et de deux lignes sur une membrane de nitrocellulose (ligne T et ligne C). La ligne T est la ligne de test, qui lie les molécules de TC, tandis que la ligne C est la ligne de contrôle, qui lie les anticorps secondaires pour indiquer la validité de la bandelette de test. Le composant principal du test est les anticorps anti-tétracycline conjugués à l'or qui doivent être mélangés à l'échantillon avant d'insérer la bandelette réactive. Le kit est non sélectif pour chaque antibiotique TC, et ses valeurs de sensibilité (limites de détection) ont été fixées à 14 µg/kg pour le TTR et le CTC et à 10 µg/kg pour l'OXY et la Doxycycline.

La figure 7 montre la présentation visuelle des résultats de test pour les échantillons positifs et négatifs et les résultats invalides. L'interprétation du résultat est basée sur la visualisation et la comparaison des intensités de couleur pour déterminer si les résidus de TC dans l'échantillon sont supérieurs à la LMR (100 µg/kg) ou dans la limite, il existe donc une source de biais ou d'incertitude due à la nature autodéclarée du résultat en tant qu'étude observationnelle. Ainsi, pour minimiser l'interprétation faussement négative du résultat, ce kit a été utilisé pour détecter si des résidus d'antibiotiques TCs étaient présents dans un échantillon, quel que soit le niveau, de sorte que l'échantillon qui montre un degré proche ou égal de similitude de couleur entre la ligne T et la ligne C est considérée comme un échantillon positif et donc classée avec les échantillons positifs (uniquement la ligne C visible ou la ligne T faible) pour une détermination ultérieure par analyse HPLC-DAD.

Échantillon négatif (-) : l'échantillon est exempt de résidus de tétracyclines si l'intensité de la raie T est supérieure à la raie C, et il est inférieur à la limite si leurs intensités sont similaires. Échantillon positif (+) : les résidus d'antibiotiques TC sont égaux à la limite si l'intensité de la raie T est plus faible que la raie C, et ils sont supérieurs à la limite si seule la raie C est visible. Résultat invalide : si la ligne C est invisible.

Pour le contrôle qualité, un contrôle positif (tétracycline : 14 ppm = 14 ng/mL) et un échantillon de contrôle négatif ont été préparés selon les instructions et testés à chaque utilisation du kit, en plus d'un échantillon de lait dopé à 100 ng/mL TC . Cette procédure garantit la sensibilité et la validité du kit pendant la durée de stockage. De plus, un échantillon aléatoire de chacun des cinq échantillons négatifs a été analysé par HPLC-DAD pour confirmer le résultat de l'immunodosage.

Des échantillons de lait de vache et de chamelle ont d'abord été scannés pour les résidus d'antibiotiques TC par le kit d'immunodosage. Seuls les échantillons qui présentaient une ligne T foncée par rapport à la ligne C avec des résidus d'antibiotiques TC par le kit d'immunodosage ont été considérés comme un échantillon négatif et exclus de l'analyse HPLC-DAD. Les échantillons montrant une ligne C uniquement ou une ligne T faible ou similaire à la ligne C en intensité ont été déterminés pour les résidus d'antibiotiques TC par HPLC-DAD, ainsi que les échantillons de lait de chèvre. Le jour de l'analyse, des échantillons d'eau et de lait enrichis ont été préparés et injectés pour s'assurer de l'adéquation du système chromatographique. Des échantillons de lait ont ensuite été préparés et injectés dans le système HPLC-DAD. Les temps de rétention de ces pics ont été comparés aux temps de rétention des échantillons de lait enrichis et aux spectres UV. L'étape suivante consistait à ajouter à ces échantillons une concentration connue de médicaments, puis à les injecter deux fois et à examiner leur pureté maximale pour exclure toute interférence de la matrice. Le niveau de résidus d'antibiotiques TC a été déterminé en calculant leur concentration par rapport au lait dopé avec une concentration connue des médicaments. Le flux de travail est représenté sur la Fig. 8.

Diagramme schématique du flux de travail.

Pour le test qualitatif sur le lait de vache et de chamelle (il y avait 18 échantillons positifs dans deux types de lait ; 17 échantillons étaient du lait de vache et 1 échantillon était du lait de chamelle). Ces échantillons positifs ont ensuite été analysés par la méthode proposée pour déterminer les niveaux de résidus d'antibiotiques TC.

Comme le montre le tableau 6, la présence de résidus de TC dans les produits laitiers (taille de l'échantillon = 100) était inférieure à la LMR (0,1 µg/ml). Les principaux antibiotiques détectés étaient OXY et TTR avec des niveaux inférieurs à la LMR dans la plupart des échantillons positifs. Concernant les résidus totaux d'antibiotiques TC, seuls 9 échantillons (11,54%) dépassaient la LMR. Le CTC n'a été détecté dans aucun des échantillons, ce qui est peut-être dû à la limite de détection de cette méthode (0,180 µg/mL) qui était supérieure à la LMR. Cependant, ce fait n'est pas étayé car les échantillons positifs contiennent d'autres antibiotiques TC et que l'utilisation de CTC est restreinte.

Les TC sont couramment utilisés en médecine vétérinaire comme antibiotiques ou promoteurs de croissance. L'utilisation inappropriée ou l'absence de protocoles d'utilisation clairs peut entraîner la présence de leurs résidus dans les produits d'élevage. Notre méthode HPLC-DAD montre une amélioration des paramètres de résolution et de sensibilité qui a été validée selon les directives de l'ICH. Les pourcentages de récupération sont élevés (85 à 100 %) avec des effets de matrice minimaux. Notre découverte indique que dans la majorité des échantillons de lait obtenus sur le marché saoudien, les résidus de TC sont inférieurs aux LMR pour le TTR et l'OXY. Les seules exceptions étaient avec 7,5% des échantillons qui dépassent la LMR de TTR, et 11,5% des échantillons qui dépassent la LMR pour la somme de TTR et OXY, mais pas OXY seul. Nos données reflètent la bonne pratique clinique de ces deux CT en termes d'utilisation dans l'alimentation et le traitement des animaux en Arabie Saoudite. Notre méthode n'était pas adaptée à la détermination du CTC dans les échantillons de lait, car sa limite de quantification est le double de la LMR. Ainsi, une optimisation supplémentaire de la sensibilité est nécessaire pour que la méthode puisse déterminer les résidus de CTC dans les échantillons de lait. Nous recommandons l'utilisation simultanée d'autres techniques analytiques telles que l'immunodosage dans la surveillance de routine des TC ainsi que l'extension des échantillons utilisés pour inclure le lait des fermes individuelles et non commerciales pour une enquête plus approfondie sur la pratique des temps d'attente et des protocoles de traitement.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Muralikrishna, IV & Manickam, V. Introduction. Dans Gestion environnementale 1–4 (Elsevier, 2017).

Google Scholar

Save, N. & Deshpande, S. Tendances à venir pour lutter contre la résistance aux antibiotiques. Drogues indiennes 55, 7–19 (2018).

Article Google Scholar

Van Boeckel, TP et al. Tendances mondiales de l'utilisation des antimicrobiens chez les animaux destinés à l'alimentation. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 112, 5649–5654 (2015).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Capita, R. & Alonso-Calleja, C. Bactéries résistantes aux antibiotiques : un défi pour l'industrie alimentaire. Crit. Rev Food Sci. Nutr. 53, 11-48 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kirchhelle, C. Pharming animaux : une histoire mondiale des antibiotiques dans la production alimentaire (1935-2017). Palgrave Commun. 4, 1–13 (2018).

Article Google Scholar

Darwich, WS et al. Résidus d'antibiotiques dans les aliments : le scénario africain. Jpn. J. Vétérinaire. Rés. 61, S13-22 (2013).

Google Scholar PubMed

Kumar, A., Panda, AK et Sharma, N. Détermination des résidus d'antibiotiques dans le lait de vache par HPLC-DAD et évaluation des risques pour la santé humaine dans la région nord-ouest de l'Himalaya. Inde. J. Food Sci. Technol. 59, 95-104 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sharma, A., Kumar, A. & Sharma, N. Présence de résidus d'antibiotiques dans le lait : détection et problèmes de santé publique. J. Animal Feed Sci. Technol. 10, 23-29 (2022).

Google Scholar

Landers, TF, Cohen, B., Wittum, TE et Larson, EL Un examen de l'utilisation des antibiotiques chez les animaux destinés à l'alimentation : perspective, politique et potentiel. Public Health Rep. 127, 4–22 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mund, MD, Khan, UH, Tahir, U., Mustafa, B.-E. & Fayyaz, A. Résidus de médicaments antimicrobiens dans les produits à base de volaille et implications sur la santé publique : un examen. Int. J. Food Prop. 20, 1433–1446 (2017).

Article CAS Google Scholar

Liu, X., Steele, JC et Meng, X.-Z. Utilisation, résidus et risque pour la santé humaine des antibiotiques dans l'aquaculture chinoise : un examen. Environ. Pollution. 223, 161-169 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Udalova, AYu., Dmitrienko, SG & Apyari, VV Méthodes de séparation, de préconcentration et de détermination des antibiotiques tétracyclines. J.Anal. Chim. 70, 661–676 (2015).

Article CAS Google Scholar

Kumar, A., Patyal, A. & Panda, AK Utilisation sous-thérapeutique des antibiotiques dans l'alimentation animale et leur impact potentiel sur la santé environnementale et humaine : une revue complète. J. Animal Feed Sci. Technol. 6, 15-25 (2018).

Google Scholar

Al-Ghamdi, MS et al. Résidus de composés de tétracycline dans les produits à base de volaille dans la province orientale de l'Arabie saoudite. Santé publique 114, 300–304 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

El-Ghareeb, WR, Mulla, ZS, Meligy, AMA, Darwish, WS & Edris, AM Niveaux de résidus d'antibiotiques dans les tissus de chameaux, de bovins et de moutons à l'aide de la méthode LC-MS/MS. Le J. Anim. Usine Sci. 29, 943–952 (2019).

CAS Google Scholar

Al-Nazawi, M. Résistance et résidus d'antibactériens dans la ferme laitière et la production laitière dans la région d'Al-Hassa en Arabie saoudite. J. Med. Sci. 6, 198–202 (2006).

Article Google Scholar

Chen, J., Ying, G.-G. & Deng, W.-J. Résidus d'antibiotiques dans les aliments : Extraction, analyse et problèmes de santé humaine. J. Agric. Chimie alimentaire. 67, 7569–7586 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Önal, A. Vue d'ensemble sur l'analyse par chromatographie liquide des résidus de tétracycline dans les matrices alimentaires. Chimie alimentaire. 127, 197-203 (2011).

Article Google Scholar

Ma, T.-Y., Vickroy, TW, Shien, J.-H. & Chou, C.-C. Électrophorèse capillaire non aqueuse améliorée pour les tétracyclines au niveau des sous-parties par milliard : CE et CEC. Électrophorèse 33, 1679–1682 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Ibarra, IS, Rodriguez, JA, Miranda, JM, Vega, M. & Barrado, E. Extraction magnétique en phase solide à base d'adsorbant phényl-silice pour la détermination des tétracyclines dans des échantillons de lait par électrophorèse capillaire. J. Chromatogr. A 1218, 2196-2202 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nagel, OG, Molina, MP & Althaus, RL Optimisation du dosage biologique pour la détection de la tétracycline dans le lait au moyen de techniques chimiométriques : dosage biologique pour la détection de la tétracycline dans le lait. Lett. Appl. Microbiol. 52, 245-252 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Divya, MP, Rajput, YS & Sharma, R. Synthèse et application du polymère imprimé à la tétracycline. Anal. Lett. 43, 919-928 (2010).

Article CAS Google Scholar

Sabbya, S., Ferdous, J., Sikder, MH et Azizul Karim Hussani, SM Résidus d'antibiotiques dans le lait : passé, présent et futur. J. Adv. Vétérinaire. Anim. Rés. 6, 315–332 (2019).

Article Google Scholar

Podhorniak, LV, Leake, S. & Schenck, FJ Stabilité des antibiotiques tétracyclines dans le lait cru dans des conditions de stockage en laboratoire. J. Aliment Prot. 62, 547-548 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wang, W. et al. (2018) Études de stabilité de l'oxytétracycline dans une solution de méthanol. Dans : IOP Conference Series Earth Environmental Science, vol 113 p. 012110.

Saleh, H., Elhenawee, M., Hussien, EM, Ahmed, N. & Ibrahim, AE Validation de la méthode multi-résidus HPLC-UV pour la détermination simultanée de la tétracycline, de l'oxytétracycline, de la spiramycine et de la néospiramycine dans le lait cru. Nourriture anale. Méthodes 14, 36–43 (2020).

Article Google Scholar

Fornstedt, T., Forssén, P. & Westerlund, D. Théorie HPLC de base et définitions : rétention, thermodynamique, sélectivité, étalement de zone, cinétique et résolution. Dans Analytical Separation Science 1–24 (John Wiley & Sons, 2015).

Google Scholar

Conférence internationale sur l'harmonisation des exigences techniques pour l'enregistrement des produits pharmaceutiques à usage humain. Directive tripartite harmonisée ICH : Validation des procédures analytiques : Texte et méthodologie Q2 (R1). https://database.ich.org/sites/default/files/Q2_R1__Guideline.pdf (2005).

Saridal, K. & Ulusoy, HI Une méthodologie simple basée sur l'extraction du point de trouble avant l'analyse HPLC-PDA pour les résidus de tétracycline dans les échantillons alimentaires. Microchem. J.150, 104170 (2019).

Article CAS Google Scholar

Sun, X., He, X., Zhang, Y. & Chen, L. Détermination des tétracyclines dans des échantillons alimentaires par couplage de colonne monolithique à empreinte moléculaire avec chromatographie liquide à haute performance. Talante 79, 926–934 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fritz, J. & Zuo, Y. Détermination simultanée de la tétracycline, de l'oxytétracycline et de la 4-épitétracycline dans le lait par chromatographie liquide à haute performance. Chimie alimentaire. 105, 1297-1301 (2007).

Article CAS Google Scholar

Tsai, W.-H., Huang, T.-C., Huang, J.-J., Hsue, Y.-H. & Chuang, H.-Y. Méthode de microextraction en phase solide dispersive pour l'extraction d'échantillons dans l'analyse de quatre tétracyclines dans des échantillons d'eau et de lait par chromatographie liquide à haute performance avec détection par barrette de diodes. J. Chromatogr. A 1216, 2263–2269 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Karageorgou, E., Armeni, M., Moschou, I. & Samanidou, V. Extraction dispersive assistée par ultrasons pour la détermination par chromatographie liquide à haute pression des résidus de tétracyclines dans le lait avec détection par réseau de diodes. Chimie alimentaire. 150, 328–334 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

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Département de chimie pharmaceutique, Faculté de pharmacie, Université King Saud, Riyad, Arabie saoudite

Moneera N. Alnassrallah, Nourah Z. Alzoman & Aliyah Almomen

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NZA et MNA : méthodologie. MNA et NZA : validation. MNA et NZA : enquête. MNA, AA et NZA : ressources. NZA : conservation des données. NZA : écriture—préparation du brouillon original. MNA, NZA, AA : rédaction—révision et AA : édition. NZA et AA : surveillance. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Nourah Z. Alzoman.

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Réimpressions et autorisations

Alnassrallah, MN, Alzoman, NZ et Almomen, A. Immunoessai qualitatif pour la détermination des résidus d'antibiotique tétracycline dans les échantillons de lait, suivi d'une méthode HPLC-DAD améliorée quantitative. Sci Rep 12, 14502 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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Reçu : 26 avril 2022

Accepté : 22 août 2022

Publié: 25 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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