Une méthode pour le marquage parallèle des protéines à l'échelle microscopique et un contrôle précis du degré moyen de marquage (aDoL)

Mar 22, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8961 (2023) Citer cet article

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Une approche largement utilisée pour la conjugaison des protéines consiste à faire réagir les résidus de lysine avec le NHS ou d'autres esters actifs. Cependant, c'est un défi de contrôler avec précision le degré de marquage (DoL) en raison de l'instabilité de l'ester actif et de la variabilité des efficacités de réaction. Ici, nous fournissons un protocole pour un meilleur contrôle de l'aDoL en utilisant les réactifs de chimie de clic sans cuivre existants. Il s'agit d'une réaction en deux étapes avec une purification entre les deux. En bref, les protéines d'intérêt ont d'abord été activées avec l'azide-NHS. Après avoir retiré l'azide-NHS n'ayant pas réagi, la protéine-N3 est ensuite mise à réagir avec une quantité limitée de click tag complémentaire. Nos études ont montré que le click tag réagit pleinement avec la protéine-N3 après 24 h' d'incubation, et ne nécessite donc pas d'étapes de purification supplémentaires. En tant que tel, l'aDoL est égal au rapport molaire d'entrée du click tag et de la protéine. De plus, cette approche offre un moyen beaucoup plus simple et plus économique d'effectuer un marquage parallèle à l'échelle microscopique. Une fois qu'une protéine est pré-activée avec N3-NHS, tout fluorophore ou molécule avec le click tag complémentaire peut être attaché à la protéine en mélangeant les deux ingrédients. Les quantités de la protéine utilisée dans la réaction de clic peuvent être à n'importe quelle quantité souhaitée. Dans un exemple, nous avons marqué un anticorps en parallèle avec 9 fluorophores différents en utilisant un total de 0,5 mg d'anticorps. Dans un autre exemple, nous avons marqué Ab avec une valeur aDoL ciblée de 2 à 8. Dans une étude de comparaison de stabilité, nous avons trouvé que le fluorophore conjugué utilisant le protocole de clic suggéré restait attaché à la protéine plus longtemps qu'avec le marquage NHS-fluorophore standard.

Les protéines jouent un rôle central en biologie et les rendre visibles ou détectables est essentiel pour que les chercheurs étudient leurs fonctions et leurs interactions. En 2001, Sharpless a publié un article historique décrivant une stratégie simple pour coupler deux molécules ensemble par "clic"1. Plus tard, Meldal et Bertozzi ont développé la chimie et l'ont rendue disponible pour une large application2,3, pour laquelle 20 ans plus tard, leurs travaux ont été reconnus et récompensés par le prix Nobel de chimie. La chimie bioorthogonale ou chimie du clic a démontré de grands avantages pour cibler, avec une grande spécificité, des protéines individuelles modifiées avec des sondes ou des étiquettes dans des systèmes complexes4,5,6,7,8,9,10. Il y a également eu d'autres avancées significatives dans les méthodes de marquage chimio- et régiosélectif pour obtenir une seule étiquette attachée aux protéines natives11,12. Pour des revues complètes et des livres sur la bioconjugaison des protéines, veuillez consulter13,14,15. Il convient également de mentionner que le résidu cystéine est une autre cible populaire pour la conjugaison de protéines spécifiques au site. La plupart des protéines ne contiennent pas de thiols libres natifs qui peuvent être ciblés, et la réduction des liaisons disulfure peut avoir des effets délétères sur la structure, ainsi l'introduction d'un seul résidu de cystéine via une mutation ponctuelle est une approche préférée pour avoir une seule étiquette attachée à un emplacement précis de la protéine . Indépendamment des approches mentionnées ci-dessus, l'ester classique de N-hydroxysuccinimide (NHS) et d'autres esters actifs restent le groupe fonctionnel préféré pour attacher le fluorophore, le chromophore, la biotine et l'ADN à une protéine via un résidu de lysine16,17. L'abondance de résidus de lysine dans la plupart des protéines facilite le marquage, et il s'agit d'une réaction en une étape plus une purification en une étape. Néanmoins, en raison de l'instabilité (hydrolyse) de l'ester actif, de l'incohérence des efficacités de réaction et des préoccupations de sur-étiquetage affectant la fonction de la protéine18, cela reste une tâche ardue.

Ici, nous décrivons une méthode d'étiquetage qui garantit aDoL ciblé en utilisant des réactifs de chimie de clic sans cuivre facilement disponibles. Les sites de fixation sont stochastiquement ciblés sur les résidus de lysine à la surface de la protéine, et l'aDoL est le nombre moyen d'étiquettes (fluorophores) conjuguées à chaque protéine. Il s'agit d'une réaction en deux étapes avec une étape de purification entre les deux (illustrée à la Fig. 1). Dans un premier temps, la protéine a été activée avec du N3-NHS et l'excès de N3-NHS a été éliminé après la réaction. Dans la deuxième étape, la protéine-N3 a été mélangée avec le fluorophore-DBCO à un rapport molaire équivalent à l'aDoL souhaité. Après une incubation de 24h, la protéine marquée est prête à l'emploi.

Schéma d'étiquetage des clics avec aDoL ciblé. Le nombre entre parenthèses représente le rapport molaire dans la réaction. L'utilisation d'un excès molaire de 15X de N3-NHS donnera généralement ~ 5 N3- par protéine à condition que la protéine ait suffisamment de résidus de lysine. Le degré moyen de marquage (aDoL) peut être contrôlé avec le rapport molaire d'entrée des réactifs dans la deuxième étape de réaction. L'étiquette peut être DBCO, ou d'autres cyclooctynes ​​complémentaires de N3-.

Le succès du protocole de marquage proposé repose sur deux conditions : (1) Dans l'étape d'activation, le nombre moyen de N3 attaché à la protéine doit être supérieur à l'aDoL souhaité, (2) le fluorophore-DBCO ajouté doit être entièrement consommé dans la deuxième étape, rendant ainsi inutile une purification supplémentaire. Le protocole a été testé sur deux systèmes protéiques, une petite protéine : l'apomyoglobine (apoMb, 17 kDa) et un anticorps (150 kDa). Ils ont tous deux été marqués avec AZ488-DBCO, atteignant un aDoL de 2–4 pour l'apoMb et un aDoL de 2–8 pour l'anticorps. La chromatographie et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) ont été utilisées pour surveiller la réaction de marquage, détecter les fluorophores n'ayant pas réagi et caractériser la luminosité des conjugués.

FCS mesure la fluctuation du signal des molécules fluorescentes lorsqu'elles diffusent librement à travers un volume d'éclairage bien défini (~ 1 fL). Cette technique élégante a été introduite il y a plus de 30 ans19, mais n'a pas été fréquemment utilisée jusqu'au milieu des années 90, lorsque des ordinateurs plus rapides et des instruments avancés sont devenus disponibles. Un aperçu complet des principes de base et des applications du FCS peut être trouvé ailleurs20. La courbe d'autocorrélation calculée renseigne sur la vitesse de diffusion des molécules fluorescentes. Une molécule plus petite (par exemple, un fluorophore libre) a un taux de diffusion plus rapide par rapport à une protéine marquée par fluorescence et donc reflétée dans une courbe d'autocorrélation décalée vers la droite pendant la réaction de marquage.

L'ester NHS d'acide azidoacétique (N3-NHS) et tous les fluorophores-DBCO ont été achetés auprès de Click Chemistry Tool (Scottsdale, AZ). Les colonnes de dessalement AlexaFluor 488-SDP (AF488-SDP) et Zeba ont été achetées auprès de Thermo-Fisher Scientific (Waltham, WA). Les Cy5-NHS ont été achetés auprès de GE Healthcare (Buckinghamshire, Royaume-Uni). La NGAL, les anticorps anti-NGAL et les anticorps anti-biotine utilisés dans l'étude ont été produits en interne par le laboratoire Abbott21 (Abbott Park, IL). L'apomyoglobine a été achetée chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L'anticorps de chèvre anti-souris - Dylight 649 a été acheté auprès de Jackson ImmunoResearch Inc (Westgrove, PA). La biotine Chromlink a été achetée auprès de Vector Laboratories (Newark, CA).

L'anti-NGAL Ab1 à 2 mg/mL dans du tampon PBS a été mélangé avec un excès molaire huit fois d'ester AF488-SDP. La réaction a été effectuée à 2-8 ° C pendant la nuit. L'excès d'AF488-SDP a été éliminé en faisant passer l'échantillon deux fois à travers des colonnes de dessalage centrifuge Zeba.

1 à 2 mg de N3-NHS ont été dissous dans du DMSO jusqu'à une concentration finale de 10 mg/mL. La concentration de N3-NHS a été déterminée en pesant ou en mesurant avec précision le produit hydrolysé, NHS, ε260 nm = 9700/M/cm22. Les deux méthodes ont été utilisées pour déterminer la concentration de N3-NHS. Les différences étaient inférieures à 5 %. Dans l'étape de pré-activation, une large gamme d'excès molaire de N3-NHS (excès de quatre à cinq fois) a été mélangée avec 2 mg/mL d'anticorps ou 1,2 mg/mL d'apomyoglobine pour obtenir divers IR Après une incubation de deux heures à la pièce température, le N3-NHS n'ayant pas réagi a été éliminé en faisant passer les échantillons deux fois à travers des colonnes de dessalage centrifuge Zeba. L'attachement d'un groupe azido à la protéine n'affecte pas le spectre d'absorption de la protéine, ainsi la concentration de l'Ab-N3 ou de l'apoMb-N3 est déterminée avec le coefficient d'extinction de l'Ab ou de l'apoMb (Ab : ε280 = 217 500/M/cm, apoMb : ε280 = 15 900/M/cm).

Nous avons adopté deux méthodes pour déterminer le rapport d'incorporation (IR) du N3- à la protéine. L'Ab-N3 a d'abord réagi avec un excès molaire de Cy5-DBCO (chaque étiquette N3 doit avoir un Cy5-DBCO attaché), l'échantillon a été injecté sur HPLC analytique pour analyse après 24 h d'incubation, le spectre d'absorption à 8,8 min a été utilisé pour déterminer l'IR L'équation suivante a été utilisée pour calculer aDoL de Cy5 à Ab ([Cy5] = A663/255 000/M/cm ; [Ab] = (A280 − 0,05 × A663)/217 500/M/cm ; aDoL = [Cy5] /[Ab]), ce qui serait une bonne estimation de l'IR de Ab-N3. Les ApoMb marquées ont été analysées par un spectromètre de masse TripleTOF® 5600 (Sciex, Framingham, MA) couplé à un HPLC Eksigent MicroLC 200 (Sciex, Framingham, MA). La distribution des états chargés multiples des échantillons de protéines a été déconvoluée à l'aide de la fonction de reconstruction disponible dans le logiciel Peakview d'AB Sciex. L'IR moyen est calculé à l'aide de la formule : ∑(nombre de N3 attachés à la protéine x intensité maximale)/∑(intensité maximale).

Tous les stocks de fluorophore-DBCO ont été dissous dans du DMSO à une concentration finale de 10 mg/mL, puis dilués dans du tampon PBS à ~ 100 μM. Le 2 mg/mL Ab-N3 (IR 7) a été divisé en petits aliquots (50 μL), chacun mis à réagir avec 2 × équivalent molaire de AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO, AZ594-DBCO ou Cy5-DBCO. Les produits ont été analysés par HPLC pour déterminer les efficacités de réaction.

La cinétique de réaction de la protéine-N3 et de l'AZ488-DBCO a été surveillée par chromatographie analytique à l'aide de la Chemstation Agilent. 50 μL du mélange ont été injectés sur le SRT-C SEC 300 analytique (colonne HPLC, Sepax) à différents moments (5 min à 24 h). Les changements dans le profil d'élution reflètent la progression de la réaction. Dans l'expérience, où 2 mg/mL d'Ab-N3 ont été mis à réagir avec neuf fluorophores-DBCO différents, les mélanges réactionnels ont été injectés sur la même colonne après une incubation de 24 ± 1,5 h. Il y avait 3 h de différence entre la première et la dernière injection d'échantillon. Le détecteur a été réglé au maximum d'absorption du fluorophore correspondant. Les profils d'élution ont été utilisés pour détecter le fluorophore-DBCO n'ayant pas réagi.

Les expériences FCS ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre de corrélation de fluorescence (ALBA, ISS, Champaign, IL) intégré à un microscope à fluorescence inversé Nikon Eclipse TE300 (Nikon InsTech Co., Ltd., Kanagawa, Japon) et un laser Spectra-Physics Mai Tai Ti-Sapphire23 . Le système est calibré avec 20 nM AlexaFluor 488 préparé analytiquement avant chaque utilisation. Tous les échantillons ont été dilués à 50–100 nM dans un tampon HEPES 10 mM (pH 7,4, contenant 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA et 0,005 % de surfactant P20) et chargés dans une plaque à fond en verre à 384 puits pour la mesure du FCS.

Les anticorps utilisés dans l'étude sont des anticorps anti-NGAL et des anticorps anti-biotine. Deux protocoles indépendants ont été utilisés pour comparer l'activité de liaison de l'anticorps. Dans une approche, des titrages en série ont été effectués sur des Ac 1 anti-NGAL avec trois IR différents (IR 7, 15 et 24) et des Ac 1 non marqués. Les Abs ont été dilués à 100 pM dans du tampon HEPES 10 mM. Chaque Ac a été titré avec une série de solution de NGAL-Cy5 diluée 2x. Après une nuit d'incubation, l'anticorps ou le complexe anticorps-NGAL-Cy5 a été capturé par des microparticules recouvertes d'anticorps secondaires (Ac IgG de chèvre anti-souris), les Ac anti-NGAL utilisés dans l'étude sont des anticorps de souris. Le signal de fluorescence de NGAL-Cy5 capturé sur les microparticules a été utilisé pour comparer les activités de liaison de trois Ab-N3 à des Ab non marqués.

Dans la deuxième approche, quatre anticorps anti-NGAL différents et un anticorps anti-biotine ont été marqués avec N3-NHS avec différents IR allant de 2 à 6. Tous les anticorps marqués et leurs anticorps intacts correspondants ont été dilués à 100 pM dans du tampon HEPES 10 mM. . 100 μL de chaque échantillon ont d'abord réagi avec 5 μL de microparticules enrobées de NGAL solide à 0,1 % pendant 30 min, puis 15 min de 50 μL d'anticorps de chèvre anti-souris F(ab')2-Dylight649 de 30 nM. Les microparticules ont été lavées après chaque étape de réaction de liaison, puis imagées sur un microscope à épifluorescence Olympus (la configuration de l'instrument et l'analyse d'image ont été décrites précédemment 24,25). Les microparticules revêtues de biotine-NGAL ont été préparées en mélangeant 10 μL de 15 μM de biotine-NGAL à 1 mL de microparticules solides de streptavidine à 0, 1%. La biotine-NGAL non liée a été lavée de la solution de microparticules avant chaque expérience à l'aide d'un laveur de plaques. Les microparticules revêtues de streptavidine ont été préparées en couplant 0,1 mg/mL de streptavidine à des particules de carboxyle paramagnétiques de 5 μm (Polymer Lab, Palo Alto, CA) maintenues à 1 % (p/p) de solides en présence de 0,15 mg/mL d'EDAC (1-éthyl -3-(3-iméthylaminpropyl) carbodiimide, chlorhydrate Des microparticules de streptavidine sans le revêtement de biotine-NGAL ont été utilisées comme contrôle négatif pour s'assurer que les signaux mesurés étaient une liaison spécifique entre l'anticorps et son antigène correspondant.

Plusieurs conditions de marquage et produits de marquage ont été décrits dans cette étude, les nomenclatures suivantes ont été utilisées pour plus de clarté : protéine-15×-N3-2×-AZ488, indiquant que la protéine réagit d'abord avec 15× équivalent molaire de N3-NHS, puis 2 × équivalent molaire de AZ488-DBCO. Le nombre de N3 attachés à la protéine est appelé rapport d'incorporation (RI). Le nombre de fluorophores finaux attachés à la protéine est appelé degré moyen de marquage (aDoL). Le produit intermédiaire est appelé protéine-N3, le produit final avec des fluorophores sera appelé conjugué.

Dans le premier exemple, l'anticorps a été activé avec un excès molaire de 16 x de N3-NHS, atteignant un IR de 5,6. Ensuite, un rapport molaire de 2: 1 d'AZ488-DBCO et d'Ab-16 × -N3 a été mélangé pour obtenir un aDoL de 2. Le mélange réactionnel (Ab-16 × -N3, AZ488-DBCO) a été injecté sur la colonne HPLC analytique à plusieurs fois pour surveiller la progression de la réaction et le produit Ab-AZ488 a été recueilli pour une analyse plus approfondie. La figure 2a montre des exemples de chromatogrammes surveillés à 493 nm au fil du temps. Le conjugué Ab-16x-N3-2x-AZ488 élue à 8,8 min, tandis que l'AZ488-DBCO libre élue à 16,5 min. Au début de la réaction (5 min), il n'y avait qu'une quantité infime du conjugué, et la plupart des fluorophores étaient sous la forme d'AZ488-DBCO libre. À 55 min, plus de 50 % des fluorophores étaient attachés à l'anticorps, et à 267 min, il n'y avait qu'une trace de AZ488-DBCO libre. En 24 h, aucun AZ488-DBCO libre n'a été élué de la colonne, indiquant que tous les AZ488-DBCO étaient liés à Ab-N3, ce qui permet de supposer en toute sécurité que nous avons atteint l'aDoL ciblé de 2. La figure 2b montre la trace cinétique du réaction extraite de la valeur du pic d'élution à 8,8 min. La trace cinétique a ensuite été ajustée à l'aide de l'équation. (2) dérivé de l'équation de vitesse intégrée pour la réaction du second ordre (Eq. 1).

où [A]0 et [B]0 sont les concentrations initiales de N3-DBCO et AZ488-DBCO, respectivement ; t est le temps de réaction en secondes, x est la concentration d'AZ488-DBCO attaché à la protéine et K est la constante de vitesse de réaction. Le K ajusté est de 4,31 ± 0,13/M/s.

( a ) Chromatogrammes d'Ab-16 × -N3 réagissant avec 2 × AZ488-DBCO en fonction du temps, surveillés à 493 nm. Le conjugué Ab-16 × -N3-2 × -AZ488 élue à 8,8 min, l'AZ488-DBCO libre élue à 16,5 min. ( b ) Courbes cinétiques de réaction extraites des chromatogrammes avec une valeur K ajustée de 4, 31 / M / s. ( c ) Spectres d'absorption des conjugués à partir de divers temps de réaction mesurés par le PDA sur l'instrument HPLC. La légende indique le temps de réaction. ( d ) Courbes d'autocorrélation de AZ488-DBCO réagissant avec Ab-N3 en fonction du temps. Les courbes se déplacent vers la droite à mesure que davantage d'AZ488-DBCO sont liés de manière covalente à Ab-N3.

Nous avons théoriquement et expérimentalement confirmé que la réaction de clic était complète à 100 % après 24 h d'incubation à condition que le DBCO-tag et le N3-tag soient à une concentration minimale de 10 μM et 25 μM, respectivement. Cependant, nous avons observé des changements de la vitesse de réaction constante ou de la réaction incomplète lors de la deuxième étape en fonction de la taille de la charge utile et du DoL ciblé, ce qui pourrait nécessiter une incubation plus longue ou une cible à un aDoL inférieur (voir la section supplémentaire).

La figure 2c montre les spectres d'absorption des conjugués (de différentes longueurs d'incubation) au point d'élution de 8,8 min. L'augmentation du pic à 495 nm indique que plus d'AZ488 se fixaient à l'anticorps au fil du temps. Le tableau en médaillon répertorie l'aDoL calculé à partir de chaque spectre d'absorption à l'aide de l'équation décrite ci-dessous. Après 24 h d'incubation, le conjugué atteint un aDoL de 1,8, ce qui est proche de la valeur cible de 2.

En parallèle, des mesures de FCS ont également été utilisées pour suivre l'évolution de la réaction. Les mélanges réactionnels ont été mesurés au microscope sans aucune étape de purification. La figure 2d montre les courbes d'autocorrélation du mélange réactionnel à différents temps de réaction. Les courbes d'autocorrélation décalées vers la droite indiquent que plus d'AZ488-DBCO sont attachés à la protéine au fil du temps. A 24 h, la courbe d'autocorrélation du mélange réactionnel non purifié est superposée à celle du conjugué purifié par HPLC, indiquant que tout AZ488-DBCO avait réagi avec Ab-N3. Ainsi, nous avons utilisé deux méthodes indépendantes pour confirmer l'achèvement à 100 % de la réaction de marquage.

0,5 mg d'Ab-17×-N3 a été divisé en 9 aliquots et chacun a réagi avec 2× équivalents molaires d'AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO, AZ594-DBCO et Cy5-DBCO . Tous les produits ont été chargés sur la colonne HPLC analytique après environ 24 h d'incubation et ont été contrôlés à la longueur d'onde d'absorption maximale de chaque fluorophore correspondant. Des résidus n'ayant pas réagi ont été trouvés uniquement dans les échantillons AZ532-DBCO et AZ647-DBCO. Le reste a complètement réagi avec la protéine (Fig. 3). Nous n'étions pas sûrs de la cause de la réaction incomplète pour AZ532-DBCO et AZ647-DBCO, mais ces deux composés doivent être évités. Le but de cette expérience était de démontrer qu'après l'étape d'activation, la protéine-N3 peut être conjuguée avec des fluorophores, de la biotine ou d'autres petites charges utiles avec étiquette DBCO en parallèle à l'échelle microscopique sans besoin de purification supplémentaire, mais il faudrait confirmer 100% de réactivité du réactif DBCO avec l'étiquette N3 lors du test initial.

( a ) Profil d'élution HPLC (normalisé) des conjugués (Ab-17X-N3-fluorophore) après ~ incubation de 24 h, chacun surveillé à la longueur d'onde correspondante du fluorophore. ( b ) Spectres d'absorption des conjugués à 8, 8 min de point d'élution.

Auparavant, lors du marquage des protéines avec AF488-SDP ou AF488-NHS, des fluorophores libres étaient toujours détectés dans la solution de conjugué après un stockage de quelques jours seulement. Il a été suggéré que les fluorophores étaient attachés de manière non covalente à la protéine pendant la réaction de marquage, puis se dissocieraient lentement de la protéine au fil du temps, entraînant un fluorophore libre présent dans le conjugué protéique purifié. Nous pensons que le N3-NHS devrait poser moins de problèmes à cet égard. L'Ab-AF488 conjugué (attaché directement par le groupe fonctionnel ester SDP) et l'Ab-17 × -N3-2 × -AZ488 ont été préparés le même jour et mesurés le jour 1 et le jour 100 à l'aide de l'instrument FCS. Après 100 jours à 2–8 ° C, 15% d'AF488 libre ont été détectés dans le conjugué Ab-SDP-AF488, tandis que le conjugué marqué via la réaction SPAAC n'avait détecté aucun fluorophore libre (voir S Fig. 5). Cette expérience de comparaison directe a indiqué que notre approche de marquage par clic peut produire un conjugué plus stable, ce qui peut s'expliquer par le fait que le fluorophore-DBCO lié de manière non covalente (le cas échéant) peut toujours réagir avec la protéine-N3 au fil du temps).

L'anticorps a d'abord été mis à réagir avec un excès molaire de 17 ×, 34 × et 51 × de N3-NHS et a atteint un IR de 7, 15 et 24 respectivement. La protéine-N3 a ensuite été mise à réagir avec AZ488-DBCO à des rapports molaires de 2, 4, 6 et 8. Après 24 h d'incubation, les échantillons ont été dilués pour des mesures de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) sans purification. Comme prévu, AZ488-DBCO a réagi à 100 % avec Ab-17×-N3 (IR 7) à la cible aDoL de 2 et 4, mais des traces d'AZ488-DBCO ont été détectées pour Ab-17×-N3 (IR 7) à aDoL cible de 6 et 8. D'autre part, Ab-34 × -N3 (IR 15) pourrait accueillir jusqu'à 6 AZ488 par molécule, et Ab-51 × -N3 (IR 24) pourrait accueillir jusqu'à 8 AZ488 par molécule ( voir S Fig. 4). Un protocole de réaction similaire a été réalisé sur apoMb et a atteint l'aDoL ciblé comme prévu (voir S Fig. 3). Cette étude suggère que l'IR de la protéine-N3 devrait être le double de l'aDoL ciblé pour assurer l'achèvement de la réaction de clic. Cependant, on sait que la luminosité de la fluorescence de la protéine marquée n'est pas toujours linéairement proportionnelle au nombre de fluorophores qui lui sont attachés en raison de l'auto-extinction, ou parfois appelée extinction de la concentration26,27. Nous avons observé les phénomènes d'auto-extinction attendus de la protéine marquée avec les mesures de FCS. La figure 4 montre à aDoL de 2, la luminosité du conjugué est le double de celle d'un seul fluorophore AZ488-DBCO. Il y a des augmentations incrémentielles de luminosité avec un aDoL plus élevé, mais cela ne suit pas la tendance linéaire. À aDoL de 8, la luminosité du conjugué est simplement 3 fois la luminosité du fluorophore AZ488. Compte tenu de l'impact potentiellement négatif d'un marquage étendu sur la structure et la fonction de la protéine, et du gain minimal de luminosité avec un aDoL28 plus élevé, il est important de souligner que l'aDoL doit être maintenu bas. En supposant que le nombre de fluorophores par anticorps suit une distribution de Poisson18,29, même à aDoL de ~ 2, il y aura ~ 18 % de la protéine avec 3 étiquettes et ~ 15 % de la protéine avec 4 étiquettes et plus.

Luminosité de fluorescence des conjugués calculée à partir des mesures FCS. À aDoL de 2, la luminosité du conjugué est le double du fluorophore unique AZ488-DBCO, il y a une augmentation progressive de la luminosité avec un aDoL plus élevé, mais ne suit pas la tendance linéaire.

L'étiquette fonctionnelle, N3- n'absorbe pas à 260 nm ni à 280 nm, ainsi la fixation de N3- à la protéine ne peut pas être confirmée par le spectre d'absorption. Les protéines avec différents IR ont des spectres d'absorption très similaires (voir S Fig. 1). Nous avons adopté deux méthodes pour déterminer le rapport d'incorporation du N3- à la protéine. Dans une approche, la protéine-N3 réagit avec un excès molaire de Cy5-DBCO, lorsque chaque étiquette N3 a un Cy5-DBCO attaché, l'aDoL de Cy5 à la protéine-N3 devrait refléter l'IR de Ab-N3 et l'aDoL peut être déterminé par les spectres d'absorption. Cette approche est plus adaptée aux protéines plus grosses (par exemple, Ab), qui ont un coefficient d'extinction plus élevé et un espace suffisant pour accueillir les fluorophores. Le tableau supplémentaire 1 répertorie la valeur maximale et calcule l'aDoL de Ab-N3-DBCO-Cy5. Une approche alternative consiste à utiliser ESI-MS et à résoudre directement le nombre de N3- par l'augmentation de masse de la protéine. Ceci est plus adapté pour les protéines de plus petite taille sans glycosylation (par exemple, ApoMb). Les spectres ESI – MS d'apoMb-N3 sont inclus dans la section supplémentaire (S Fig. 2). Le tableau 1 répertorie l'IR d'Ab-N3 et d'apoMb-N3, les deux méthodes montrent que l'efficacité de la réaction se situe dans la plage de 25 à 47 %. En excluant les cas surétiquetés, les efficacités de réaction sont à ~ 30 % avec des niveaux d'IR inférieurs à 5.

Deux protocoles indépendants ont été utilisés pour comparer l'activité de liaison de l'anticorps lors de la modification -N3. Dans la première approche, des courbes de titrage de liaison ont été réalisées sur l'anti-NGAL Ab1 à des IR de 0, 7, 15 et 24. Chaque courbe de liaison a 10 points de données. Toutes les courbes de liaison sont superposables, indiquant l'absence d'impact de la modification de N3 sur la fonction de l'anticorps (Fig. 5a). Dans la deuxième approche, nous avons adopté une méthode plus simple pour évaluer plus d'anticorps avec différents IR (voir la section "Matériels et méthodes"). Toutes les concentrations de réactifs (microparticules enrobées de NGAL, chèvre anti-souris Ab-Dylight 649) et les conditions de réaction sont restées identiques. La figure 5b montre le signal de fluorescence des anticorps originaux et marqués au N3 lors de la liaison à leur antigène correspondant. Les cinq anticorps ont une affinité différente inhérente envers son antigène ciblé, qui se reflète dans les niveaux de signal variés pour chaque anticorps. Cependant, la variation du signal du même anticorps marqué avec différents IR reflète l'impact de la modification de l'étiquetage. La figure 5c montre le signal normalisé de l'Ab marqué à l'Ab intact. Les anti-NGAL Ab1 et Ab4 ont montré que la fixation de N3 n'avait aucun impact négatif sur la fonction des protéines, tandis que les anti-NGAL Ab2, Ab3 et anti-biotine Ab ont montré jusqu'à 30% de perte d'activité de liaison à des IR plus élevés. Et il y a une tendance à l'augmentation de la perte fonctionnelle avec une augmentation de l'IR. L'expérience de contrôle négatif (microparticules revêtues de streptavidine) a indiqué que tous les anticorps se lient spécifiquement à la NGAL ou à la biotine, le signal de liaison non spécifique à un niveau d'Ab de 100 pM est négligeable.

( a ) Titrage de liaison de Ab1-N3 et de son antigène, NGAL-Cy5. Ab1 et Ab1-N3 non marqués ont été maintenus à 100 pM, tandis que la concentration de NGAL-Cy5 variait de 10 pM à 5,5 nM. Les trois Ab-N3 ont une activité de liaison similaire à celle de l'Ab natif, indiquant un impact minimal de la fixation de N3 sur l'Ab. (b) Signal de fluorescence de l'anticorps capturé par l'antigène correspondant. ( c ) Activité d'anticorps relative des anticorps marqués au N3 par rapport à son anticorps intact correspondant.

La technique d'étiquetage présentée ici est simple et précise. Nous ne connaissons aucune méthode d'étiquetage existante qui présente les mêmes caractéristiques sans effectuer de chimio ou d'étiquetage sélectif de site. Comme mentionné dans l'introduction, l'inconvénient majeur de l'utilisation d'ester-fluorophore actif pour la conjugaison de protéines est l'incapacité de contrôler précisément aDoL en raison de l'instabilité de l'ester-fluorophore actif et de l'efficacité de la réaction imprévisible. Toutes les balises ester actives ne sont pas créées égales. Les colorants fortement sulfonés, tels que les colorants Alexa Fluor®, DyLight® et IRDye® sont particulièrement hygroscopiques, aggravant encore l'hydrolyse des esters actifs. Dans un cas, nous avons détecté 37 % d'Alexa Fluor® 488-NHS hydrolysé dans un flacon fraîchement ouvert par LC-MS (voir S Fig. 5). Le manuel de fabrication a également reconnu que le % de réactif actif est généralement > 50 %, mais peut être aussi faible que 30 à 40 %. Avec un niveau d'hydrolyse inconnu et la taille volumineuse des fluorophores, il est difficile de prédire l'efficacité de la réaction. D'après notre expérience, l'efficacité du marquage de l'AF488-NHS ou de l'AF488-SDP sur les protéines peut varier de 5 à 50 %. Alors que le N3-NHS est petit, le N3-NHS intact et le N3-NHS hydrolysé ont des spectres d'absorption différents, qui pourraient être utilisés pour vérifier l'intégrité du réactif de marquage22. Nous avons testé divers rapports d'étiquetage de N3-NHS sur apoMb et anticorps, les efficacités de réaction étaient d'environ 30 % pour les deux protéines avec un IR inférieur à 5. Nous ne nous attendons pas à une efficacité de réaction de 30 % pour chaque protéine et chaque lot de N3-NHS , mais il fait preuve de cohérence et de reproductibilité. De plus, dans un cas de sur-marquage, chaque attachement N3 supplémentaire n'est que de 83 Dalton, il aurait moins d'impact sur la fonction de la protéine par rapport à un fluorophore volumineux.

L'utilité de cette méthode a été démontrée en outre par le marquage parallèle de 9 fluorophores différents à la même protéine-N3 dans une approche en mode batch. Après l'étape d'activation, la protéine-N3 peut être conjuguée avec des fluorophores, de la biotine ou d'autres petites charges utiles avec étiquette DBCO en parallèle à l'échelle microscopique sans besoin de purification supplémentaire. Dans un article récemment publié30, l'auteur a tenté d'évaluer l'effet de la biotinylation des anticorps sur un dosage immunologique en utilisant diverses longueurs de lieur et divers aDoL sur trois anticorps. Au total, 150 conditions de marquage ont été réalisées, ce qui nécessite 150 purifications indépendantes. Si notre approche avait été utilisée, les trois anticorps auraient d'abord été activés avec N3-NHS, après purification, chaque anticorps pourrait ensuite être divisé en 50 aliquotes et mis à réagir avec divers rapports des 5 lieurs, et le produit résultant pourrait être directement utilisé sans autre purification. Le nombre total de purifications aurait été réduit de 150 à 3.

Comme indiqué dans la section "Résultat", le retour des avantages diminue avec un aDoL plus élevé pour le marquage des fluorophores en raison de l'auto-extinction de la fluorescence et de l'impact possible sur la fonction de la protéine. Nous avons testé cinq anticorps différents avec différents I.R et comparé l'impact de N3 sur la fonction de la protéine. Comme prévu, certains anticorps ont maintenu leur activité de liaison tandis que d'autres ont perdu 30 % de leur capacité à se lier à leur antigène à des I.R plus élevés. Bien que certaines protéines puissent contenir plus de 20 étiquettes N3, mais chaque protéine est différente, il est important de confirmer la propriété de la protéine après toute modification. Nous recommandons d'introduire 3–5 -N3 attachement à chaque protéine, ce qui est suffisant pour accueillir 2 DBCO-fluorophores dans l'étape de réaction finale. Il est également possible d'utiliser le TCEP pour réduire le groupe azido n'ayant pas réagi sur la protéine en amine après réaction avec le DBCO, cependant, il est important de confirmer que le TCEP n'a pas rompu la liaison disulfure de la protéine.

Dans l'ensemble, nous avons effectué des études approfondies pour démontrer que notre approche fournit un moyen simple de marquer parallèlement des protéines en faible quantité avec un aDoL bien contrôlé.

Les données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Degré moyen d'étiquetage

Taux d'incorporation

Spectroscopie de corrélation de fluorescence

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Le travail a été soutenu par Abbott Laboratories. Les auteurs remercient Sergey Tetin pour une discussion judicieuse. Nous remercions notre collègue Rich Haack pour la caractérisation des DBCO-fluorophores et AF488-NHS par LC-MS. Nous remercions notre collègue Patrick J. Macdonald pour ses commentaires qui ont grandement amélioré le manuscrit. Nous remercions Ray Zhao pour la préparation d'images haute résolution de figures.

Recherche appliquée et technologie, Abbott Diagnostics Division, AP-20, Abbott Laboratories, 100 Abbott Park Road, Abbott Park, IL, 60064-6016, États-Unis

Qiaoqiao Ruan et Cheng Zhao

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QR a conçu et réalisé la plupart des expériences décrites dans le manuscrit. QR a écrit le manuscrit. CZ a réalisé certaines des expériences et a participé à la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Qiaoqiao Ruan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ruan, Q., Zhao, C. Une méthode de marquage parallèle des protéines à l'échelle microscopique et un contrôle précis du degré moyen de marquage (aDoL). Sci Rep 13, 8961 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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Reçu : 30 janvier 2023

Accepté : 30 mai 2023

Publié: 02 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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