Cytokimère GIL

Mar 24, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 418 (2023) Citer cet article

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Toutes les cytokines sauf une de la famille des interleukines (IL-)6 partagent la glycoprotéine (gp) 130 comme chaîne commune de récepteurs β. Alors que l'interleukine (IL-)11 signale via le récepteur IL-11 non signalant (IL-11R) et les homodimères gp130, le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) recrute les hétérodimères gp130: récepteur LIF (LIFR). En utilisant l'IL-11 comme cadre, nous échangeons le site III de liaison gp130 de l'IL-11 avec le site III de liaison LIFR du LIF. Le cytokimère synthétique résultant GIL-11 recrute efficacement le complexe de signalisation du récepteur non naturel constitué de gp130, IL-11R et LIFR, entraînant la transduction du signal et la prolifération des cellules Ba/F3 dépendantes du facteur. Outre le LIF et l'IL-11, le GIL-11 n'active pas les complexes récepteurs constitués respectivement de gp130:LIFR ou gp130:IL-11R. La GIL-11 humaine montre une réactivité croisée avec la souris et les souris IL-6R-/- sauvées après une hépatectomie partielle, démontrant que la signalisation gp130:IL-11R:LIFR induit efficacement la régénération du foie. Avec le développement du cytokimère GIL-11, nous concevons l'assemblage fonctionnel du complexe récepteur de cytokines non naturel gp130:IL-11R:LIFR.

Les progrès réalisés dans notre compréhension de la formation de complexes de récepteurs de cytokines ont permis la mise en œuvre de diverses approches pour assembler des complexes de récepteurs de cytokines non naturels par des cytokines de créateurs. Il s'agit notamment des synthékines1, des néoleukines2 et des cytokines chimériques (cytokimères)3 mais aussi des systèmes de cytokines entièrement synthétiques4. Les synthékines sont des fusions de deux variantes de cytokines négatives dominantes dans lesquelles chaque variante ne lie qu'une seule sous-unité de récepteur1. Les néoleukines reprennent certains aspects des cytokines naturelles mais ont une conception globale et une séquence d'acides aminés totalement indépendantes2. Les cytokimères sont basés sur le cadre d'une cytokine naturelle avec au moins un site de reconnaissance de récepteur échangé à partir d'une cytokine étroitement apparentée3, un concept qui a encore été spécifiquement appliqué pour les cytokines de type IL-6 Interleukine (IL-)6 et le facteur neurotrophique ciliaire ( CNTF) dans la cytokine IC73.

Les cytokines de type IL-6 comprennent l'IL-6, l'IL-11, l'IL-27, l'IL-30, l'IL-31, le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), l'oncostatine M (OSM), le CNTF, la cardiotrophine-1 (CT-1) , la cytokine de type cardiotrophine (CLC) et la neuropoeitine5,6. Hormis l'IL-31, toutes les cytokines de type IL-6 induisent une transduction du signal via le récepteur β gp130 commun7,8, qui active les cascades de signalisation, notamment les voies JAK/STAT, Ras/Map kinase et la phosphatidylinositol 3-kinase8,9. Alors que l'IL-6 et l'IL-11 signalent via des homodimères gp130, les autres cytokines signalent via des hétérodimères gp130. Par exemple, le CNTF et le LIF recrutent le récepteur gp130:LIF (LIFR)10,11,12. De plus, les cytokines de type IL-6 IL-6, IL-11 et CNTF doivent interagir avec des récepteurs α spécifiques (IL-6R, IL-11R, CNTFR, respectivement) pour permettre la liaison aux récepteurs β10,11,13 ,14,15.

Dans l'article historique de 19993, Kallen et al. ont suggéré que les sites de reconnaissance des récepteurs des cytokines ont évolué sous forme de modules discontinus qui devraient principalement être librement échangeables entre différentes cytokines. En général les cytokines de type IL-6 ont dans le cas du LIF deux ou dans le cas de l'IL-11 ou du CNTF trois sites de liaison aux récepteurs, le site I pour le récepteur α, le site II et le site III pour les deux récepteurs β10,11 ,12. Grâce au transfert du site de liaison LIFR III du CNTF16 au site de liaison III de l'IL-6, le premier cytokimère de ce type IC7 a été décrit il y a plus de 20 ans3. L'abréviation IC7 provient du septième variant chimérique Interleukine/CNTF testé. L'échange de module a créé une cytokine mash-up avec une activité dépendante de l'IL-6R sur les cellules exprimant gp130, IL-6R et LIFR, au lieu d'être dépendante de l'IL-6R et de la gp130 dans le cas de l'IL-6 ou de la gp130, du CNTFR et du LIFR en cas de CNTF3. Il a récemment été démontré que IC7 améliore la tolérance au glucose et l'hyperglycémie, empêchant ainsi la prise de poids et la stéatose hépatique chez la souris17. Outre IC7, d'autres cytokines de la famille des cytokines IL-6 ont également montré des effets protecteurs contre l'obésité et l'insuline, notamment l'IL-618, l'IL-2719 et le CNTF20. Cependant, toute utilisation thérapeutique de l'IL-6 est cependant hors de question en raison de ses effets pro-inflammatoires prononcés. Le variant CNTF Axokine a échoué en raison du développement précoce d'anticorps neutralisants du CNTF21. IC7 a combiné le meilleur des deux mondes et n'a montré aucun problème de sécurité chez les primates non humains17.

Ici, nous avons développé le cytokimère GIL-11 qui lie le complexe récepteur non naturel constitué de gp130:IL-11R:LIFR. Nous avons utilisé l'IL-11 comme squelette pour le transfert du site III du LIF, ce qui a donné le cytokimère GIL-11. Le GIL-11 hautement actif combine les activités de LIF22,23 et IL-1124 en une seule molécule. Il convient de noter qu'une contribution protectrice de l'IL-11 dans les maladies du foie a récemment été contestée25,26, rendant l'application thérapeutique de l'IL-11 indésirable. Pour démontrer le potentiel thérapeutique de GIL-11, nous avons utilisé des souris IL-6R−/− provoquées en hépatectomie partielle (PHX). Les souris IL-6R-/- ont montré un taux de mortalité élevé allant jusqu'à 80 % contre 10 % chez les souris de type sauvage après PHX27. Ici, nous avons montré que GIL-11 a sauvé des souris de la mort après une hépatectomie partielle.

Les cytokines de type IL-6 partagent une structure commune de faisceau à quatre hélices composée de quatre hélices alpha anti-parallèles (A, B, C et D) reliées par deux longues boucles croisées (AB, CD) et une boucle courte. (C.-B.)28. L'IL-6, l'IL-11 et le CNTF se lient à leur récepteur α via le site de liaison I qui comprend des résidus de la boucle AB C-terminale et de l'hélice D C-terminale10,11,13,14,15. Les résidus des hélices A et C du CNTF, du LIF et de l'IL-6 constituent un site de liaison à la gp130 appelé site II10,11,12. Dans IL-6 et IL-11, un second site III de liaison à la gp130 est constitué de résidus d'acides aminés de la boucle AB N-terminale, de la boucle CD C-terminale et de l'hélice D N-terminale10,11. Le site III dans le CNTF et le LIF rend le contact au LIFR, tandis que le site II est en contact avec gp13012. Pour l'IL-11, le site II et le site III sont en contact avec gp130, tandis qu'un troisième site (site I) recrute l'IL-11R11. Notamment, la liaison primaire de l'IL-11 à l'IL-11R est obligatoire pour la liaison secondaire à gp13011,29. Le paradigme du site I, II, III pour l'IL-11 et le LIF est illustré sur les Fig. 1a, b.

une illustration schématique des possibilités du complexe récepteur IL-11:IL-11R:gp130 tétramère et hexamère. L'IL-11 se lie initialement à l'IL-11R via le site I. La gp130 est recrutée dans ce complexe via des interactions majeures entre le site III de l'IL-11 et D1 (Ig-like) de la gp130 et le site II de l'IL-11 et D2/D3 ( module de liaison aux cytokines (CBM)) de la gp130. b illustration schématique du complexe trimérique LIF:gp130:LIFR. Le LIF se lie via le site III à D3/D4 de LIFR et via le site II à D2/D3 de gp130. c illustration schématique du complexe tétramérique GIL-11:IL-11R:gp130:LIFR. GIL-11 se lie via le site III à D3/D4 de LIFR, via le site II à D2/D3 de gp130 et via le site I à D2/D3 de IL-11R. d illustration schématique (à gauche) et modèle de remplissage d'espace (à droite) du tétramérique GIL-11:IL-11R:LIFR:gp130 (PDB 6O4P;11 2Q7N;83 1P9M10). GIL-11 se lie via le site I à IL-11R, via le site II à gp130 et via le site III à LIFR. e Modèle de bande/remplissage d'espace transparent combiné de GIL-11, rouge : IL-11, vert : région échangée par LIF. f Alignement de séquence schématique basé sur la structure de hIL-11 (PDB 6O4O11), hLIF (PDB 1PVH33) et le GIL-11 résultant. Les résidus des sites IIIa,b,c sont mis en évidence dans les cases vertes et rouges.

Il convient de noter que l'IL-6 et l'IL-11 peuvent former des complexes de récepteurs tétramères et hexamères, constitués d'une cytokine, d'un récepteur α et de deux gp130 ou de deux cytokines, de deux récepteurs α et de deux gp13010,30 (Fig. 1a). Bien que le complexe récepteur tétramère soit principalement biologiquement actif31, les structures des complexes récepteurs ne présentaient que des assemblages hexamères10,11. Cependant, le LIF signale exclusivement via un complexe récepteur trimérique constitué de LIF engagé avec une gp130 via le site II et un LIFR via le site III12,32 (Fig. 1b). Il convient de noter que le LIF ne nécessite pas de récepteur α pour se lier à sa combinaison de récepteurs β de gp130 et LIFR12. La liaison du LIF au LIFR est cependant facilitée par un site de liaison III situé de manière identique dans l'IL-11 à la gp130 (Fig. 1b)12. Nous avons émis l'hypothèse que l'échange basé sur la structure du site de liaison cloisonné III de l'IL-11 humaine avec le site III du LIF humain transformera la cytokine chimérique résultante en un liant de la composition de récepteur de cytokine non naturelle gp130:IL-11R:LIFR, une classe de cytokines que nous avons appelée cytokimère GIL-11. Étant donné que la liaison au récepteur β du LIF est indépendante du récepteur α12, nous n'avons pas décidé si le recrutement gp130: LIFR de la cytokine chimère GIL-11 dépendra de l'IL-11R (Fig. 1c, d). L'inspection structurelle du site III dans l'IL-11 et le LIF a guidé la conception du cytokimère GIL-11 avec le cadre de l'IL-11 et un échange du site III du LIF11,33. L'IL-11 est constituée de 199 acides aminés, nous avons identifié le site III partitionné à partir des acides aminés 58–72 pour IIIa, 111–128 pour IIIb et 162–179 pour IIIc. Le LIF a 202 acides aminés avec un site III partitionné situé à partir des acides aminés 64–88 pour IIIa, 119–138 pour IIIb et 172–189 pour IIIc (Fig. 1d – f, Fig. 1A supplémentaire). Nous avons décidé de transférer le site de liaison complet du LIF vers l'IL-11, bien que cela ait entraîné un cytokimère GIL-11 un peu plus long avec 211 acides aminés que l'IL-11 d'origine. La modélisation moléculaire a suggéré que le transfert de l'ensemble des tronçons d'acides aminés du site III ne devrait pas interférer avec l'architecture globale et le repliement du cytokimère GIL-11 (Fig. 1d, e) 11,12. Comparable aux complexes trimères LIF:gp130:LIFR, GIL-11 ne formera que des complexes de récepteurs tétramères GIL-11:IL-11R:gp130:LIFR. L'assemblage tétramère sera basé sur l'exigence de GIL-11 pour le LIFR. Alors que gp130 a deux sites de liaison de cytokines dans une molécule de récepteur, le LIFR n'a qu'un seul site de liaison de cytokines. Le LIFR n'interagit qu'avec le site III de LIF/GIL-11, alors que la gp130 contacte le site II de LIF/GIL-11. Dans ce contexte, le deuxième site de contact dans gp130 reste libre, car le site III de LIF/GIL-11 ne peut pas interagir avec gp130 (Fig. 1c) et la formation de complexes hexamériques 2xGIL-11 :2xIL-11R :1xLIFR :1xgp130 peut être exclu.

La prolifération de la lignée cellulaire pré-B murine Ba/F3 dépend de l'IL-334. Après l'introduction de la gp130 humaine plus des récepteurs familiaux supplémentaires (IL-6R, IL-11R35,36, OSMR et LIFR (Fig. 1B, C supplémentaires)), la prolifération s'est déplacée vers la combinaison respective de récepteurs de cytokines de type IL-6. Dans le cas des cellules Ba/F3-gp130, la prolifération est induite par l'IL-11 et l'IL-11R soluble ou par la protéine de fusion correspondante Hyper IL-11 (HIL-11)37, l'introduction supplémentaire d'IL-11R rend ces cellules IL -11 dépendant. La co-expression de gpl30 et d'IL-6R rend ces cellules sensibles à l'IL-6. Les cellules Ba/F3 exprimant gp130 et LIFR prolifèrent avec LIF et OSM, tandis que gp130 et OSMR exprimant les cellules Ba/F3 sont sensibles à OSM. Utilisation de notre répertoire de cellules Ba/F3 avec les huit combinaisons de récepteurs gp130, gp130:IL-11R, gp130:LIFR, gp130:OSMR, gp130:IL-11R:OSMR, gp130:IL-6R:LIFR et gp130:IL-11R :LIFR, nous avons déterminé les propriétés qualitatives de prolifération après addition d'IL-11, HIL-11, OSM, LIF et GIL-11. Utilisation d'une concentration assez élevée de 500 ng/ml pour évaluer initialement une éventuelle activation croisée des récepteurs. GIL-11 n'induisait spécifiquement que la prolifération des cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR mais pas de toute autre lignée cellulaire testée, ce qui suggère que GIL-11 signale via gp130:IL-11R:LIFR (Fig. 2a, Données supplémentaires ). Comme prévu, seule HIL-11 a induit la prolifération de toutes les lignées cellulaires Ba/F3, puisqu'elles expriment toutes gp130. Toutes les cellules Ba/F3 exprimant gp130 et IL-11R ont proliféré avec IL-11. L'expression de la gp130 et du LIFR a entraîné une prolifération induite par le LIF et l'OSM, tandis que les cellules exprimant la gp130 et les cellules OSMR étaient sélectives pour l'OSM. Ensuite, nous avons analysé la phosphorylation de STAT3 qui est la principale caractéristique de la signalisation JAK/STAT de la cytokine de type IL-6 dans notre portefeuille de cellules Ba/F3. Comme prévu à partir des tests de prolifération des cellules Ba/F3 induites par les cytokines (Fig. 2a), la phosphorylation de STAT3 dans les cellules Ba/F3 a été induite par les combinaisons cytokines/récepteurs de cytokines suivantes : HIL-11 via gp130 ; IL-11 via gp130:IL-11R ; OSM via gp130:OSMR ; OSM et LIF via gp130: LIFR (Fig. 2b; Figs. Supplémentaires 2, 3). Il est important de noter que la phosphorylation soutenue de STAT3 pour GIL-11 n'a été observée que dans les cellules Ba / F3 exprimant la combinaison de récepteurs gp130, IL-11R et LIFR (Fig. 2b; Figs. 2, 3 supplémentaires). Pris ensemble, nos données ont également montré que GIL-11 activait spécifiquement la signalisation via le complexe récepteur non naturel constitué de gp130:IL-11R:LIFR.

a Prolifération de Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130-IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR, Ba/F3 -gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:cellules IL-11R sans cytokine (-), avec 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 50 ng/ml IL- 6, LIF 10 ng/ml, OSM 10 ng/ml, GIL-11 500 ng/ml. Les données représentent ± SEM de trois expériences indépendantes sur trois avec trois répétitions techniques chacune. Une ANOVA à deux facteurs, y compris la correction de Dunnet, a été utilisée pour les statistiques. b Activation STAT3 dans Ba/F3, Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130_IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR, Cellules Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R sans cytokine (-) et après stimulation avec 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 10 ng/ml LIF, 10 ng/ml OSM, 500 ng/ml GIL-11 pendant 15 min. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant phospho-STAT3 et STAT3. Les données de Western blot montrent une expérience représentative sur trois.

Pour évaluer le profil de transcription de GIL-11, les cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR ont été stimulées pendant 40 min avec GIL-11, IL-11 ou LIF avec des concentrations d'EC50 de 100 fois pour assurer une transduction et une comparabilité maximales du signal pour l'analyse du transcriptome. Le diagramme de Venn montre que 37 gènes ont été régulés positivement au moins 1,5 fois par GIL-11, IL-11 et LIF (Fig. 3a, b). Fait intéressant, 31 gènes ont été régulés positivement au moins 1,5 fois par IL-11 et LIF mais pas par GIL-11. Au total, 52 gènes ont été régulés positivement par IL-11 et/ou LIF mais pas par GIL-11 suggérant que GIL-11 conduit à une transcription plus atténuée par rapport à IL-11 ou LIF. L'analyse de l'enrichissement de l'ontologie des gènes montre que plusieurs gènes impliqués dans les réponses inflammatoires ou l'hématopoïèse sont régulés à la hausse par GIL-11, IL-11 et LIF (Fig. 3c, d). Pris ensemble, nos données démontrent que le modèle de transcription de GIL-11 diffère légèrement des cytokines naturelles IL-11 et LIF.

un diagramme de Venn montre le chevauchement des gènes qui sont activés par des cytokines naturelles ou synthétiques. Filtre : p < 0,05 incluant la correction du taux de fausses découvertes ; |FC| ≥ 1,5. b La carte thermique montre les gènes significativement augmentés par GIL-11 vs non traité, IL-11 vs non traité et LIF vs non traité. La barre d'échelle montre le changement de pli du journal. Filtre : p < 0,05 incluant la correction du taux de fausses découvertes ; |FC| ≥ 1,5 Analyse ontologique des gènes des voies génétiques communes activées par GIL-11, LIF et IL-11 (c) et par les cytokines naturelles uniquement (d). Filtre : p < 0,05 incluant la correction du taux de fausses découvertes ; |FC| ≥ 1,5. Axe des abscisses : nombre de gènes impliqués dans la voie commune des gènes. Code d'accès à l'expression génique : GSE226064.

Ensuite, nous avons effectué une prolifération dose-dépendante pour déterminer la qualité et la capacité de GIL-11. Encore une fois, GIL-11 n'a pas induit de prolifération de cellules Ba/F3 exprimant gp130, gp130:IL-11R, gp130:LIFR, gp130:OSMR, gp130:IL-11R:OSMR même à la concentration appliquée la plus élevée de 500 ng/ml, tandis que la prolifération des cellules Ba / F3-gp130: IL-11R: LIFR était clairement dose-dépendante avec une CE50 de 1, 44 ng / ml (Fig. 4a; Données supplémentaires). À titre de comparaison, nous avons déterminé que l'EC50 pour le LIF et l'IL-11 était de 0,074 ng/ml et de 0,72 ng/ml sur les cellules Ba/F3-gp130 : IL-11R : LIFR (Fig. 4b, c ; Données supplémentaires). Pour analyser la phosphorylation de STAT3 et ERK, les cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR ont été stimulées avec des quantités croissantes de GIL-11, IL-11 et LIF. Le transfert Western a montré que 10 à 100 ng / ml de GIL-11 et d'IL-11 étaient nécessaires pour obtenir une phosphorylation maximale de STAT3 et ERK, alors que l'activité biologique du LIF était plus élevée avec 0, 1 à 1 ng / ml nécessaire pour une phosphorylation maximale de STAT3 (Fig. 4d, Fig. 4 supplémentaire). En ce qui concerne l'activation des autres STAT dans les cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR, la phosphorylation de STAT1, 3, 5 et 6 a été évaluée après stimulation avec HIL-11, IL-11, OSM, LIF et GIL-11. Via gp130, toutes les cytokines de type IL-6 activent efficacement STAT3, mais seulement dans une moindre mesure STAT1 et STAT5. Dans le cas de LIF et OSM, STAT3 et STAT1, ainsi que STAT5, une activation a été observée38. Ici, toutes les cytokines ont induit une phosphorylation soutenue de STAT3. Fait intéressant, HIL-11 et IL-11 n'ont pas induit la phosphorylation de STAT1 et STAT5, tandis que LIF, OSM et GIL-11 ont également induit la phosphorylation de STAT1 (Fig. 4e, Fig. 6 supplémentaire; 2c, d). La phosphorylation de STAT5 n'a été observée que pour GIL-11. Comme prévu, aucune des cytokines n'a induit la phosphorylation de STAT6. Ensuite, nous avons stimulé les cellules Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R avec IL-11, LIF et GIL-11 pendant 5 à 240 min. La phosphorylation de STAT3 commence 5 min après la stimulation des cytokines, avec un pic après 30 à 60 min. Comme on le voit généralement pour l'IL-11 et le LIF, la phosphorylation de STAT3 diminue après 120 à 240 min, ce qui est probablement dû à la régulation à la hausse de SOCS339 (comparer la Fig. 3b, analyse transcriptomique, la régulation à la hausse de SOCS3 par 10,5 fois GIL-11, 18,4 fois IL- 11, LIF 14,5 fois), la même régulation de la phosphorylation de STAT3 a été observée pour la cytokine GIL-11 (Fig. 4f, Fig. 7 supplémentaire). Pris ensemble, l'activité de GIL-11 est dans la même plage de concentration que la cytokine précurseur IL-11, démontrant que l'expansion de l'exigence du récepteur par le transfert du site III n'a pas affecté l'activité biologique globale de la cytokine.

a Prolifération de Ba/F3, Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130:IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR , Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R en présence et en l'absence de concentrations croissantes de GIL-11 (0,0005–500 ng/ml). b Prolifération de cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR en présence et en l'absence de concentrations croissantes de LIF (0,000025–200 ng/ml). c Prolifération de cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR en présence et en l'absence de concentrations croissantes d'IL-11 (0,000025–500 ng/ml). a–c Les barres d'erreur définissent ±SEM. Une expérience représentative avec trois répétitions biologiques sur trois est présentée. d Activation de STAT3 et ERK dans les cellules Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R sans cytokine (-) et après stimulation avec des quantités croissantes de GIL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml), LIF (0,1, 1, 10, 100 ng/ml) et IL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml) pendant 15 min. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant phospho-STAT3, STAT3, ERK et phospho-ERK. Les données de Western blot montrent une expérience représentative sur trois. e Activation de STAT1,3,5,6 dans les cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR sans cytokine (-) et après stimulation avec 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 10 ng/ ml de LIF, 10 ng/ml d'OSM, 500 ng/ml de GIL-11 pendant 15 min. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant les phospho-STAT et les STAT. Les données de Western blot montrent une expérience représentative sur trois. f Activation STAT3 en fonction du temps des cellules Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR avec les cytokines IL-11 (200 ng/ml), LIF (20 ng/ml) et GIL-11 (200 ng/ml) pour l'heure indiquée. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant phospho-STAT3 et STAT3.

Les cytokines dépendantes du récepteur α IL-6 et IL-11 activent les cellules via le récepteur de transduction de signal gp130 et l'IL-6R ou l'IL-11R lié à la membrane sans signalisation, respectivement37,40. Ici, nous avons montré des signaux GIL-11 via l'IL-11R lié à la membrane en complexe avec le complexe hétérodimérique gp130:LIFR. La signalisation via l'IL-11R lié à la membrane est appelée signalisation classique. L'IL-11R existe également en tant que récepteur soluble qui, en complexe avec l'IL-11, active les cellules dépourvues d'expression du récepteur α lié à la membrane dans un processus appelé trans-signalisation37,40. Ici, nous avons analysé dans quelle mesure GIL-11 induisait une trans-signalisation en complexe avec IL-11R soluble (sIL-11R) sur des cellules exprimant gp130 et LIFR. Les cellules Ba/F3-gp130:LIFR ont été stimulées avec une concentration fixe de 100 ng/ml de sIL-11R et des concentrations croissantes de GIL-11 (2 à 2 000 ng/ml). À titre de comparaison, nous avons utilisé la même concentration fixe de sIL-11R et des concentrations croissantes de cytokines pour l'IL-11. Alors que l'EC50 pour l'IL-11 était de 71, 6 ng / ml pour 100 ng / ml de sIL-11R (Fig. 5a; données supplémentaires), GIL-11 n'a guère induit de prolifération via sIL-11R. Il n'a pas été possible de calculer une valeur EC50, car même la concentration de 2000 ng/ml de GIL-11 n'était pas suffisante pour atteindre une prolifération cellulaire maximale (Fig. 5b ; Données supplémentaires). Par conséquent, nous avons évalué la transduction du signal intracellulaire dans des cellules Ba/F3-gp130:LIFR stimulées avec des concentrations comparativement élevées de 1 µg/ml de GIL-11 et 2 µg/ml de sIL-11R. Ici, les complexes GIL-11:sIL-11R ont entraîné une activation soutenue de STAT3. sgp130Fc est un inhibiteur sélectif de la trans-signalisation IL-6/IL-11, qui inhibe la signalisation LIF au moins 100 à 1000 fois moins efficacement que la trans-signalisation IL-6/IL-1140,41. Ensuite, nous avons testé si sgp130Fc inhibe la trans-signalisation GIL-11. Comme le montre la Fig. 5c, Fig. 8 supplémentaire, sgp130Fc (10 µg/ml) n'a pas inhibé la phosphorylation de STAT3 induite par GIL-11 (1 µg/ml):sIL-11R (2 µg/ml) trans-signalisation dans Ba /F3-gp130 : Cellules LIFR (Fig. 5c, Fig. 8 supplémentaire). Pour les cellules Ba/F3-gp130:LIFR, les concentrations de GIL-11 (0,5 µg/ml) ou IL-11 (0,5 µg/ml) plus sIL-11R (1 µg/ml) ont été choisies pour permettre la prolifération cellulaire par trans- signalisation. Le titrage de concentrations croissantes de sgp130Fc a entraîné l'inhibition de la trans-signalisation de l'IL-11 (IC50 = 22,5 ng/ml, Fig. 5d ; données supplémentaires), alors que même la concentration la plus élevée de 10 µg/ml de sgp130Fc n'a pas pu inhiber GIL -11 trans-signalisation. En principe, GIL-11 est capable de signaler via la trans-signalisation, mais avec une efficacité bien moindre par rapport à IL-11. Comme le LIF, la trans-signalisation de GIL-11 n'est pas inhibée par le sgp130Fc, du moins dans des conditions suffisantes pour bloquer la trans-signalisation de l'IL-1137,40,41. Comme le montre la figure 2a, la prolifération de Ba/F3-gp130:LIFR et Ba/F3-gp130:IL-11R a été induite par LIF et IL-11, respectivement, mais pas par GIL-11. Nous ne pouvions cependant pas exclure que GIL-11 se lie à IL-11R:gp130 sur les cellules Ba/F3-gp130:IL-11R et bloque la signalisation de l'IL-11 ou au LIFR sur les cellules Ba/F3-gp130:LIFR et bloque le LIF signalisation. L'utilisation de la co-incubation de cytokines pour Ba/F3-gp130:IL-11R avec IL-11 et GIL-11 et pour Ba/F3-gp130:LIFR avec LIF et GIL-11 n'a pas entraîné d'inhibition de la prolifération cellulaire même à 20 un excès de concentration massique de GIL-11 par rapport à IL-11 et un excès de GIL-11 de 200 fois par rapport à LIF (Fig. 5e; Données supplémentaires). Nous concluons que GIL-11 n'a pas interféré avec la signalisation IL-11 et LIF au moins pour la plage de concentration testée.

a Prolifération des cellules Ba/F3-gp130:LIFR en présence et en l'absence de concentrations fixes de sIL-11R (0 ou 100 ng/ml) et de concentrations croissantes d'IL-11 (1–2000 ng/ml). Une expérience représentative sur trois est présentée. b Prolifération de cellules Ba/F3-gp130:LIFR en présence et en l'absence de concentrations fixes de sIL-11R (0 ou 100 ng/ml) et de concentrations croissantes de GIL-11 (1–2000 ng/ml). Une expérience représentative sur trois est présentée. c Activation de STAT3 dans les cellules Ba/F3-gp130:LIFR sans cytokine (-) et après stimulation avec HIL-11 (50 ng/ml), GIL-11 (1 µg/ml), GIL-11 (1 µg/ml) :sIL-11R (2 µg/ml), GIL-11 (1 µg/ml) :sIL-11R (2 µg/ml) :sgp130Fc (10 µg/ml) pendant 15 min. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant phospho-STAT3 et STAT3. Les données de Western blot montrent une expérience représentative sur trois. d Prolifération des cellules Ba/F3-gp130:LIFR en présence et en l'absence de concentrations fixes d'IL-11 (0,5 µg/ml) :sIL-11R (1 µg/ml) ou GIL-11 (0,5 µg/ml) : sIL-11R (1 µg/ml) et concentrations croissantes de sgp130Fc (1–10 000 ng/ml). Une expérience représentative sur trois est présentée. e Prolifération de cellules Ba/F3-gp130:LIFR en présence et en l'absence de concentrations fixes de LIF (10 ng/ml) et de concentrations croissantes de GIL-11 (1–2000 ng/ml) (vert). Prolifération des cellules Ba/F3-gp130:IL-11R en présence et en l'absence de concentrations fixes d'IL-11 (100 ng/ml) et de concentrations croissantes de GIL-11 (1–2000 ng/ml) (rouge). Les barres d'erreur définissent ± SEM. Une expérience représentative avec trois répétitions biologiques sur trois est présentée.

L'IL-11 et le LIF humains présentent une réaction croisée entre les souris et les hommes42,43,44. Nous avons analysé si la GIL-11 humaine active également les cellules murines exprimant les chaînes murines gp130:IL-11R:LIFR. Nous avons choisi la lignée cellulaire de myoblastes murins C2C12. Les cellules C2C12 ont été stimulées avec HIL-11 humain (200 ng/ml), IL-11 humain (200 ng/ml), LIF humain (10 ng/ml) et GIL-11 (200 ng/ml). HIL-11 et LIF ont induit une phosphorylation soutenue de STAT3 alors que IL-11 et GIL-11 ne l'ont pas fait, ce qui suggère que les cellules C2C12 expriment gp130 et LIFR mais n'ont pas l'expression de IL-11R (Fig. 6a, Fig. 9 supplémentaire). Nous avons transfecté des cellules C2C12 avec un plasmide codant pour l'ADNc de l'IL-11R murin. Résultant en l'expression de mIL-11R, ce qui rend ces cellules sensibles à l'IL-11 et au GIL-11, comme le montre la phosphorylation de STAT3 (Fig. 6a, Fig. 9 supplémentaire). Nous avons également stimulé la lignée de fibroblastes embryonnaires murins NIH/3T3 avec 1, 10, 100 et 1000 ng/ml de GIL-11 humaine, IL-11 et 0,1, 1, 10 et 100 ng/ml de LIF. Le LIF et l'IL-11 ont induit la phosphorylation de STAT3 dans NIH / 3T3, comme le montre le transfert Western (Fig. 6b, Fig. 10 supplémentaire), car ces cellules expriment gp130, LIFR et IL-11R45. La stimulation cellulaire dose-dépendante a montré que 10 à 100 ng / ml de GIL-11 et d'IL-11 étaient nécessaires pour obtenir une phosphorylation soutenue de STAT3 dans le NIH / 3T3 murin. Ensuite, nous avons injecté 5, 10 et 20 µg de GIL-11 par voie intrapéritonéale à des souris de type sauvage. 30 minutes après l'injection, les souris ont été sacrifiées et les tissus cardiaques, hépatiques et spléniques ont été prélevés. L'analyse de la phosphorylation de STAT3 par Western blot a montré qu'au moins 10 µg/souris GIL-11 étaient suffisants pour induire une phosphorylation soutenue de STAT3 dans le cœur, le foie et la rate (Fig. 6c, Fig. 11 supplémentaire). Ensemble, nos données ont démontré que la GIL-11 humaine active la combinaison de récepteurs murins gp130:IL-11R:LIFR.

une activation de STAT3 dans des myoblastes murins non transfectés et transfectés avec un ADNc codant pour l'IL-11R murin (C2C12) sans cytokine (-) et après stimulation avec HIL-11 (200 ng/ml), IL-11 (200 ng/ml ), LIF (10 ng/ml), GIL-11 (200 ng/ml) pendant 15 min. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant phospho-STAT3 et STAT3. Les données de Western blot montrent une expérience représentative sur trois. b Activation de STAT3 dans le fibroblaste murin NIH/3T3 sans cytokine (-) et après stimulation avec des quantités croissantes de GIL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml), LIF (0,1, 1, 10, 100 ng/ml) et IL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml) pendant 20 min. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant phospho-STAT3 et STAT3. Les données de Western blot montrent une expérience représentative sur trois. c Activation de STAT3 dans le cœur, le foie et la rate après injection de 5, 10 ou 20 µg/ml de GIL-11. Les souris ont été sacrifiées 30 minutes après l'injection intrapéritonéale de cytokines. Des quantités égales de protéines (50 µg/piste) ont été analysées via des anticorps spécifiques détectant phospho-STAT3 et STAT3. Les données de Western blot montrent une expérience représentative sur trois.

L'interleukine-6 ​​(IL-6) est impliquée de manière critique dans la régénération du foie après une hépatectomie partielle (PHX). Les souris IL-6−/− et IL-6R−/− ont un taux de mortalité élevé de 40 à 80 % contre 10 % chez les souris de type sauvage accompagné d'une diminution de la phosphorylation de STAT3 et d'une diminution de la prolifération des hépatocytes27,46,47,48,49 ,50 ont suivi PHX. Nous avons précédemment montré que l'injection d'Hyper IL-6 (HIL-6) 24 h avant et directement après la chirurgie a sauvé des souris de la mort après une hépatectomie partielle51. Ici, 10 µg/souris GIL-11 ont été injectés 24 h avant et directement après PHX chez des souris IL-6R-/-. Le taux de survie global des souris IL-6R−/− 9 jours après PHX était d'environ 40 %, alors que les souris IL-6R−/− injectées avec deux doses de GIL-11 avaient un taux de survie de 90 % (Fig. 7a ; Données). Comme on l'a vu précédemment 27, le poids corporel 9 jours après la PHX n'était pas différent chez les souris IL-6R − / − survivantes, qu'elles aient reçu une injection de GIL-11 ou de PBS, alors que le rapport poids du foie sur poids corporel était légèrement diminué (Fig. 7b, c; Données supplémentaires). Cependant, nous avons remarqué que les souris IL-6R-/- non traitées avaient un poids de rate plus important que les souris IL-6R-/- traitées avec GIL-11 (Fig. 7d; Données supplémentaires). L'analyse de l'expression génique a montré une expression accrue du marqueur fibrotique αSMA et du gène de réponse de phase aiguë SAA1 chez les souris IL-6R-/- traitées avec GIL-11 par rapport aux souris IL-6R-/- non traitées directement après PHX (Fig. 7e; Données supplémentaires) . Ensemble, nos données ont montré que GIL-11 a sauvé des souris IL-6R-/- de la mort après une hépatectomie partielle.

a Des souris IL-6R−/− ont été soumises à 70 % de PHX, injectées avec du PBS (n = 11) ou du GIL-11 (n = 11), 20 µg chacune, 24 h avant et directement après la chirurgie et la survie a été surveillée pendant 9 jours. b Le poids corporel des souris IL-6R-/- traitées avec et sans GIL-11 après 70 % de PHX a été déterminé 12 jours après PHX (n = 4 non traités, n = 5 GIL-11). c Le rapport poids foie/corps des souris IL-6R−/− traitées avec et sans GIL-11 après 70 % de PHX a été déterminé 9 jours après PHX (n = 5 non traités, n = 7 GIL-11). d Le poids de la rate des souris IL-6R-/- traitées avec et sans GIL-11 après 70 % de PHX a été déterminé 9 jours après PHX (n = 5 non traités, n = 7 GIL-11). e L'ARN total a été extrait du foie directement après PHX de souris IL-6R−/− préalablement traitées avec et sans GIL-11 et le niveau d'ARNm d'aSMA, SAA1, Ki67, EGF, CycA2 et G0S2 a été déterminé par PCR quantitative (n = 6). b–e Chaque point représente les données dérivées d'une souris. Les barres d'erreur sont ± SEM.

Nos expériences définissent une cytokine chimérique humaine qui induit une signalisation JAK/STAT typique de la famille et une prolifération cellulaire via le complexe non naturel gp130:IL-11R:LIFR avec une spécificité inter-espèces de la souris à l'homme. L'échange du site III du LIF vers l'IL-11 donne le cytokimère GIL-11 avec des propriétés de liaison au récepteur jusqu'à présent introuvables dans la nature. Le prototype de cytokimère IC7, basé sur l'échafaudage IL-6 avec le site III du CNTF, a servi de modèle pour GIL-113. IC7 et GIL-11 ont révélé que l'échafaudage global au sein de la famille des cytokines de type IL-6 est échangeable en raison d'une architecture modulaire générale. Le transfert étant limité au site III, il reste à voir si le transfert du site I et du site II sera également réalisable. Avec le deuxième du genre, GIL-11 possède des caractéristiques uniques qui le distinguent de IC7. Tout d'abord, IC7 recrute le complexe récepteur gp130:IL-6R:LIFR, tandis que GIL-11 assemble gp130:IL-11R:LIFR, ce qui signifie que seules les cellules exprimant IL-11R sont ciblées par GIL-11. Cela pourrait être un problème important en ce qui concerne la spécificité cellulaire in vivo. Alors que le récepteur β commun gp130 est exprimé de manière ubiquitaire, l'expression du LIFR et également des récepteurs α est restreinte et donc plus spécifique au type de cellule. Contrairement à l'IL-6R, qui se trouve principalement sur les cellules immunitaires et les hépatocytes52,53, la distribution de l'IL-11R lié à la membrane semble être plus équilibrée54, y compris les cardiomyocytes55, les fibroblastes56 et les cellules épithéliales57.

En raison de leur profil d'expression limité, les récepteurs α IL-6R, IL-11R et CNTFR confèrent une deuxième couche de spécificité cellulaire6. Nous émettons l'hypothèse que le recrutement de complexes synthétiques aboutit finalement à un gain de fonction dans la spécificité cellulaire et pourrait ainsi favoriser de manière bénéfique et réduire les effets négatifs lors des applications in vivo de cytokines de créateurs en biologie synthétique. Il convient de noter que l'IC7Fc active sélectivement les voies métaboliques entraînant une oxydation accrue des acides gras accompagnée d'une stéatose empêchée, une dissipation d'énergie accrue accompagnée d'une perte de poids, une hypertrophie musculaire et une masse maigre préservée avec une stabilité osseuse améliorée chez la souris17. Contrairement à l'IL-6 et au CNTF, l'injection d'IC7 s'est avérée sûre chez les souris et les macaques primates non humains sans favoriser les réponses inflammatoires excessives3,17,58.

De plus, il a été supposé que le profil transcriptomique de GIL-11 pourrait couvrir le LIF, puisque les deux recrutent et activent les hétérodimères gp130 et LIFR, tandis que l'IL-11 recrute les homodimères gp130. Fait intéressant, GIL-11 a agi plus entre IL-11 et LIF mais avec une mesure atténuée. Il a été proposé que la géométrie et l'affinité du complexe ligand-récepteur pourraient expliquer la diversité fonctionnelle de cytokines particulières de type IL-659. Le manque de capacité des GIL-11 pour l'expression de certains gènes pourrait être bénéfique. Smad7 est un régulateur négatif de la signalisation TGF-ß et semble être impliqué dans la pathogenèse des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), y compris la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) et médie l'inflammation intestinale60. Il a été démontré que la surexpression de MyD88 diminue la fonction cardiaque et contribue aux maladies auto-immunes cardiovasculaires61,62,63. Arid5a est supposé contribuer à la tempête de cytokines. En dehors de cela, les souris Arid5a−/− sont réfractaires au choc endotoxinique, aux lésions pulmonaires induites par la bléomycine et aux maladies auto-immunes inflammatoires64.

Deuxièmement, les cytokines naturelles IC7, IL-6 et CNTF dépendent de la liaison au récepteur α avant de se lier à gp130 et LIFR3, ce qui signifie que la formation du site de liaison III dérivé du CNTF dans IC7 est une conséquence directe de la liaison à l'IL-6R, comme après liaison du CNTF au CNTFR. Cette situation est différente pour GIL-11. Ici, nous avons introduit le site de liaison III indépendant du récepteur α du LIF dans l'IL-11 dépendant du récepteur α. Comme indiqué ici, GIL-11 active le complexe récepteur gp130: LIFR uniquement après la liaison à l'IL-11R non transducteur de signal. De plus, GIL-11 n'a pas été capable d'inhiber la signalisation LIF sur les cellules Ba/F3-gp130:LIFR, ce qui aurait dû être le cas, si GIL-11 peut se lier à LIFR en l'absence d'IL-11R. Pris ensemble, nos expériences ont montré que bien que le contexte du site de liaison d'origine du site III du LIF au LIFR soit indépendant du récepteur α, le reformatage du site III du LIF dans l'échafaudage IL-11 rend le récepteur α de liaison du site III du LIF dépendant . Par conséquent, ce n'est pas la composition exacte en acides aminés du site de liaison III, mais plutôt l'interconnexion médiée par les déplacements en hélice α du site I avec le site III, qui définit si une cytokine est dépendante ou indépendante du récepteur α65.

En ce qui concerne l'activité biologique, GIL-11 (EC50 : 1,44 ng/ml) est comparable à IL-11 (EC50 : 0,72 ng/ml) mais moins efficace que LIF (EC50 : 0,074 ng/ml). Cela pourrait être basé sur l'effet d'échafaudage dominant de l'IL-11 plutôt que sur l'effet d'échange mineur du site III du LIF. L'activité biologique de GIL-11 pourrait cependant être augmentée par la mutation du site I D186A, puisque cet échange d'acides aminés est connu pour augmenter l'affinité de IL-11 pour IL-11R66. L'amélioration de la liaison des cytokines au récepteur α est une stratégie courante pour améliorer l'activité globale de cette famille de cytokines, comme cela a également été montré pour CNTF à CNTFR67 et IL-6 à IL-6R68.

Après avoir caractérisé l'activité biologique et la composition unique des récepteurs de GIL-11, nous avons étudié la capacité de GIL-11 à remplacer fonctionnellement l'IL-6 lors de la régénération hépatique après PHX chez des souris IL-6R−/−. Nous et d'autres avons déjà montré que l'IL-6 et l'IL-6R sont impliqués de manière critique dans la régénération du foie après PHX, entraînant une mortalité plus élevée chez les souris IL-6R-/-27,46,47,48,49,50. Fait important, HIL-6 a sauvé des souris de la mort après une hépatectomie partielle51. De plus, chez les souris de type sauvage, l'injection combinée d'IL-6 et d'IL-6R soluble (sIL-6R), mais pas d'IL-6 seule, accélère la régénération du foie après PHX69. Probablement parce que les hépatocytes expriment beaucoup plus de gp130 que d'IL-6R, la présence accrue d'IL-6 et de sIL-6R entraîne une plus grande activation de gp130 et une signalisation plus forte de l'IL-6 par rapport à l'IL-6 seule70. Enfin, le blocage de la trans-signalisation de l'IL-6 par le sgp130Fc entraîne une augmentation de la mortalité après PHX27. Mécaniquement, la production de facteur de croissance des hépatocytes (HGF) induite par la trans-signalisation de l'IL-6 par les cellules étoilées hépatiques a directement contribué à la régénération du foie après PHX27. Étant donné que les souris IL-6R-/- utilisées dans ce travail manquent d'expression d'IL-6R, la signalisation classique et la signalisation trans sont désactivées. Ainsi, elles présentent un taux de mortalité de 90 % contre 10 % chez les souris de type sauvage27. Une différence cruciale entre le traitement GIL-11 et HIL-6 est que GIL-11 cible uniquement les cellules exprimant gp130:IL-11R:LIFR, ce qui limite la portée des cellules ciblées potentielles dans le corps, alors que HIL-6 cible presque toutes les cellules, car contrairement à l'IL-11R et au LIFR, la gp130 est considérée comme étant exprimée de manière ubiquitaire71. Cependant, étant donné que l'IL-11R, le LIFR ainsi que la gp130 sont exprimés sur les hépatocytes, GIL-11 a pu compenser la trans-signalisation de l'IL-6 et a sauvé les souris IL-6R-/- de la mort après PHX. Fait intéressant, la plupart des paramètres, y compris le poids du corps, du foie et de la rate, n'ont pas été modifiés chez les souris survivantes traitées au GIL-11 et non traitées. GIL-11, cependant, augmente SAA1 plus de 300 fois même neuf jours après PHX. SAA1 induit la prolifération de cellules étoilées hépatiques72, ce qui pourrait contribuer à la régénération du foie suite à l'application de GIL-11.

Ayant montré l'activité générale in vitro et in vivo, nous pensons que GIL-11 sera d'un intérêt commun pour les conditions dans lesquelles les cytokines de type IL-6, y compris IC7, montrent des effets bénéfiques73. Récemment, les effets bénéfiques décrits à l'origine de l'IL-116 humaine dans des modèles murins de maladies humaines ont été contestés. Il a été indiqué que le mode d'action de l'IL-11 humaine injectée à des souris repose en fait sur l'inhibition compétitive de la signalisation endogène de l'IL-1126. Il a été conclu que l'IL-11 a des effets plutôt néfastes que bénéfiques dans une variété de modèles de maladies murines, y compris la stéatohépatite non alcoolique, la fibrose cardiovasculaire, la fibrose pulmonaire idiopathique et la maladie pulmonaire fibrotique26. Fait intéressant, l'IL-11 a été considérée comme induisant préférentiellement la signalisation ERK et non, comme l'IL-6, qui agit via le même homodimère gp130, la phosphorylation de STAT326. Par conséquent, nous avons traité des myoblastes murins (cellules C2C12) avec HIL-11, IL-11 et GIL-11 recombinants en présence et en l'absence d'IL-11R murin, ce qui a toutefois entraîné une phosphorylation soutenue de STAT3 dépendante de l'IL-11R. L'injection de GIL-11 à des souris a également entraîné une phosphorylation soutenue de STAT3 dans les tissus cardiaques, hépatiques et spléniques, démontrant que nos cytokines humaines et GIL-11 activent les voies de signalisation canoniques gp130 et gp130:LIFR caractérisées par la phosphorylation de STAT3. Pour des raisons inconnues et contrairement à l'IL-11, GIL-11 n'induit que faiblement la trans-signalisation via les complexes GIL-11:sIL-11R et n'est pas inhibé par le sgp130Fc. Il sera intéressant de voir quelles seront les conséquences de l'application de GIL-11 pour des modèles murins de maladies fibrotiques.

Bien que le LIF soit lié à la fertilité et à une série de troubles neurologiques, dont la sclérose en plaques, le LIF recombinant n'est pas utilisé à des fins thérapeutiques74,75. La capacité des GIL-11 à induire une signalisation de type LIF via des complexes gp130: LIFR pourrait ouvrir des applications de type LIF en tant que substitut potentiel du hLIF recombinant. Étant donné que l'activité GIL-11 a besoin de cellules exprimant non seulement le LIFR mais également l'IL-11R, l'activité du GIL-11 est limitée à un nombre limité de cellules cibles par rapport au LIF, ce qui pourrait atténuer les effets secondaires négatifs indésirables potentiels.

En conclusion, notre étude définit GIL-11 comme un nouveau cytokimère prometteur à notre connaissance avec une activation spécifique à haute affinité du complexe récepteur non naturel gp130:LIFR:IL-11R. L'architecture modulaire des cytokimères en général permet une large gamme de combinaisons de récepteurs ciblés et de ciblage cellulaire dirigé.

L'ADNc codant pour GIL-11 a été commandé par BioCat GmbH, qui a été optimisé en codons et basé sur l'IL-11 et le LIF humains. L'ADNc de GIL-11 a ensuite été inséré dans le vecteur d'expression pcDNA3.1 comprenant le peptide signal 5 'pour l'IL-11R humain (Q14626, aa 1–24) suivi des séquences pour l'étiquette myc (EQKLISEEDL) et le fragment codant pour GIL-11, Gly4Ser linker, un site de reconnaissance TEV et un tag twin-strep.

Des modèles de protéines ont été générés via le portail Web Phyre276. Des modèles complexes et des alignements de séquences basés sur la structure ont été générés à l'aide de la version 1.13.1 de l'UCSF Chimera, développée par la Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics de l'Université de Californie à San Francisco, avec le soutien du NIH P41-GM10331177.

La génération de cellules Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130:IL-6R et Ba/F3-gp130:IL-11R a été décrite ailleurs35,36. La lignée cellulaire d'emballage Phoenix-Eco a été reçue d'Ursula Klingmüller (DKFZ, Heidelberg, Allemagne). Les cellules NIH/3T3 ont été achetées auprès du Leibnitz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Culture (Braunschweig, Allemagne). Toutes les cellules ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans une atmosphère saturée d'eau dans le milieu de culture à haute teneur en glucose du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (GIBCO®, Life Technologies, Darmstadt, Allemagne) avec 10 % de sérum de veau fœtal (GIBCO ®, Life Technologies) et 60 mg/l de pénicilline et 100 mg/l de streptomycine (Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm, Allemagne). Des cellules murines Ba/F3-gp130 ont été obtenues auprès d'Immunex (Seattle, WA, USA) et cultivées en présence de HIL-6. 0,2% (10 ng/ml) de milieu conditionné d'un clone stable de cellules CHO-K1 sécrétant HIL-6 dans le surnageant78. Les cellules Expi-293F™ (ThermoFisher Scientific) ont été cultivées dans le milieu d'expression Expi293™ sans antibiotiques jusqu'à ce qu'elles atteignent une densité de 3–5 × 106 c/ml dans un incubateur à 37 °C avec 8 % de CO2 sur un agitateur orbital à 125 tr/min. Les ligands synthétiques ont été exprimés et purifiés comme décrit79. L'OSM humain recombinant (n° de catalogue 295-OM) et le LIF humain recombinant (n° de catalogue 7734-LF) ont été achetés auprès de R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Un plasmide d'expression pour l'IL-11 pET22-IL-11-His6 a été utilisé pour l'expression de l'IL-11. L'IL-11 a été exprimée sous forme de protéine soluble dans Escherichia coli et purifiée par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé. Sgp130FC a été exprimé dans des cellules ExpiCHOTM (ThermoFisher Scientific). Les cellules ont été cultivées dans du milieu ExpiCHOTM et transfectées conformément au manuel du fournisseur (numéro de catalogue : A29133). La protéine a été purifiée comme décrit précédemment80.

Les lignées cellulaires Ba/F3-gp130 ont été lavées trois fois avec du PBS pour éliminer les cytokines et affamées dans du DMEM sans sérum pendant 3 h. L'inhibiteur sgp130Fc ou sIL-11R a été ajouté 5 min avant la stimulation. Les cellules ont été stimulées pendant 15 min (ou comme indiqué) avec une protéine purifiée (concentration comme indiqué), récoltées, congelées dans de l'azote liquide puis lysées. Dans le cas des cellules C2C12 et NIH / 3T3, les cellules ont été lavées une fois après la stimulation avec du PBS avant d'être détachées par un traitement à 0, 05% de trypsine, 0, 1% d'EDTA (Genaxxon, catalogue. C4261.0100) pendant 5 min et lavées à nouveau. Les cellules ont été lysées pendant 45 min avec un tampon contenant du Tris-HCl 10 mM, pH 7, 5, du NaCl 150 mM, du MgCl2 0, 5 mM et un comprimé complet de mélange d'inhibiteurs de protéase sans EDTA (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne). La concentration en protéine a été déterminée par un test de protéine BCA (Thermo Fisher Scientific) selon les instructions du fabricant. L'expression des protéines et l'activation des voies ont ensuite été analysées par western blot.

Cinquante microgrammes de protéines totales ont été chargés dans chaque voie et séparés par SDS-PAGE dans des conditions réductrices et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Amersham Protan ; Cytiva ; LC, Royaume-Uni ; n° de catalogue 10600016). Le blocage de la membrane a été réalisé avec un tampon de blocage (Intercept® Blocking Buffer ; LI-COR ; USA ; catalogue n° 927-60001) dilué au 1/3 dans du TBS (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, NaCl 150 mM) pendant 1 h. Anticorps primaires (Phospho-STAT3 ; Tyr-705 ; D3A7 ; n° de catalogue 9145, STAT3 ; 124H6 ; n° de catalogue 9139, Erk1/2 ; L34F12 ; n° de catalogue 4696, Phospho-Erk1/2 ; D13.14.4E ; n° de catalogue n° 4370, Cell Signaling Technology, USA ont été dilués au 1:1000 dans un tampon de blocage contenant 0,2 % de Tween-20 (Sigma-Aldrich ; USA ; catalogue n° P1379-1L) pendant au moins 90 min à température ambiante ou une nuit à 4° C. Les membranes ont été lavées avec du TBS-T (0,1 % de Tween-20), puis incubées avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore 1:10 000 (IRDye® 800CW Donkey anti-Rabbit ; catalogue n° 926-32213 et IRDye® 680RD Donkey anti- Souris ; numéro de catalogue 926-68072, LI-COR ; États-Unis) pendant 1 h. La détection du signal a été réalisée à l'aide de LI-COR Odyssey ; États-Unis ; modèle 2800). Les anticorps secondaires ont été détectés simultanément sur différents canaux. L'analyse des données a été effectuée à l'aide d'Image Studio Lite 5.2. Le foie, la rate et le tissu cardiaque ont été lysés dans un tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 2 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 % NP-40, 1 % Triton X-100 , 1 comprimé complet de cocktail d'inhibiteurs de protéase). Après lyse, la teneur en protéines a été mesurée par dosage BCA. Une quantité totale de protéines de cinquante microgrammes a ensuite été chargée sur chaque ligne, suivie d'un immunotransfert. Les anticorps utilisés pour le buvardage d'organes animaux lysés étaient les suivants : anti-p-STAT3 (n° de catalogue 9145), anti-STAT3 total (n° de catalogue 9139).

Les lignées cellulaires Ba/F3-gp130 ont été lavées trois fois avec du PBS pour éliminer les cytokines du milieu. Les cellules avec une densité de 5 x 104 cellules/ml ont été mises en suspension dans du DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 60 mg/l de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine. Les cellules ont été cultivées pendant 3 jours dans un volume de 100 ul avec ou sans cytokines ou inhibiteur aux concentrations indiquées. Le test de viabilité CellTiter Blue (Promega, Karlsruhe, Allemagne) a été utilisé pour déterminer le nombre approximatif de cellules viables en mesurant la fluorescence (λex560 nm/λem590 nm) à l'aide du lecteur de plaques Infinite M200 Pro (Tecan, Crailsheim, Allemagne). Après avoir ajouté 20 µl/puits de réactif CellTiter Blue (point temporel 0), la fluorescence a été mesurée après 60 min toutes les 20 min pendant jusqu'à 2 h. Pour chaque condition d'une expérience, 3 puits ont été mesurés. Toutes les valeurs ont été normalisées en soustrayant les valeurs du point 0 dans le temps de la mesure finale.

Les lignées cellulaires Ba/F3-gp130 ont été transduites de manière rétrovirale avec les plasmides d'expression pMOWS comme décrit34. Les cellules transduites ont été cultivées dans du milieu DMEM comme décrit ci-dessus additionné de 10 ng/ml de HIL-6. La sélection des cellules Ba/F3-gp130 transduites a été réalisée avec de la puromycine (1,5 μg/ml) ou de l'hygromycine B (1 mg/ml) (Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne) pendant au moins 2 semaines. Ensuite, les lignées cellulaires Ba/F3-gp130 générées ont été analysées pour l'expression de la surface cellulaire du récepteur par cytométrie en flux. Les cellules C2C12 ont été transfectées par 7,5 µg de plasmide pcDNA3.1 codant pour l'ADNc de mIL-11R et 15 µl de TurboFect et incubées pendant 48 h.

L'expression de la surface cellulaire des lignées cellulaires Ba/F3-gp130 transfectées de manière stable a été détectée par des anticorps spécifiques. 5 × 105 cellules ont été lavées dans du tampon FACS (PBS, 1% BSA) puis incubées dans 50 µl de tampon FACS contenant l'anticorps primaire spécifique indiqué (anti-LIFR ou –OSMR ; 1:20 ; catalogue n° BAF249 et BAF4389, R&D Systems ; MN, États-Unis). Après une incubation d'au moins 1 h à température ambiante, les cellules ont été lavées et remises en suspension dans 50 µl de tampon FACS contenant un anticorps secondaire (IgG anti-chèvre conjugué à NorthernLights 493 1:200) et incubées pendant 30 min à température ambiante. Les cellules ont été lavées et remises en suspension dans 500 µl de tampon FACS et analysées par cytométrie en flux (cytomètre en flux BD FACSCanto II utilisant le logiciel FACSDiva, BD Biosciences). L'analyse des données a été effectuée à l'aide de FlowJo Version 10 (Tree Star Inc, États-Unis).

Les souris C57BL/6 et IL-6R−/−52 ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory et de l'animalerie de l'Université Heinrich-Heine de Düsseldorf, respectivement. Les expériences de cette étude ont été réalisées conformément aux exigences de LANUV-NRW, Allemagne avec le numéro d'approbation 84-02.04.2019.A303.

Les cellules Ba/F3-gp130-IL-11R:LIFR ont été stimulées avec GIL-11, IL-11 ou LIF pendant 40 min à 37 °C. L'ARNm a été isolé avec de l'ARN NucleoSpin (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne; n° de catalogue 740955.250) conformément au manuel du vendeur. Les échantillons d'ARN total digérés à la DNase utilisés pour les analyses 3′-ARN-Seq ont été quantifiés (Qubit RNA HS Assay, Thermo Fisher Scientific) et la qualité mesurée par électrophorèse capillaire à l'aide de l'analyseur de fragments et du "Total RNA standard Sensitivity Assay" (Agilent Technologies, Inc. .Santa Clara, États-Unis). Tous les échantillons de cette étude ont montré des numéros de qualité d'ARN (RQN ; moyenne = 10,0) de très haute qualité. La préparation de la bibliothèque a été réalisée selon le protocole du fabricant en utilisant le kit de préparation de bibliothèque QuantSeq 3'mRNA-Seq FWD de Lexogen®. Le montage d'entrée était de 200 ng d'ARN total. Les bibliothèques purifiées de billes ont été normalisées et finalement séquencées sur le système NextSeq2000 (Illumina Inc. San Diego, États-Unis) avec une configuration de lecture de SR 1 × 100 bp. L'outil Illumina DRAGEN FASTQ Generation (version 3.8.4) a été utilisé pour convertir les fichiers bcl en fichiers fastq ainsi que pour le découpage et le démultiplexage de l'adaptateur. L'analyse de l'ontologie des gènes a été réalisée avec le package r clusterprofiler et r version 4.1.3.

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes et manipulées conformément aux réglementations définies par la FELASA et l'organisme national de protection des animaux GV-SOLAS (www.gv-solas.de). Tous les animaux transgéniques étaient sur fond C57BL/6N. Les souris ont été nourries avec un régime de laboratoire standard et ont reçu de l'eau du robinet autoclavée ad libitum. Ils ont été conservés dans une pièce climatisée à température contrôlée (20–24 °C), humidité (45–65 %) et cycle jour/nuit (12 h de lumière, 12 h d'obscurité). La laparotomie a été réalisée principalement sur des souris mâles âgées d'au moins 10 à 12 semaines en utilisant une narcose par inhalation d'isoflurane 1,5 à 2 % d'isoflurane avec 1 l/min d'oxygène81. Afin d'effectuer une hépatectomie partielle à 70 %, le lobe supérieur droit, le lobe supérieur gauche et le lobe inférieur gauche du foie ainsi que la vésicule biliaire ont été réséqués par une ligature en une étape à l'aide d'un lien de suture en polyester 5-0 (B. Braun Surgical, SA, Rubi , Espagne). Par la suite, la cavité abdominale et la couche externe de la peau ont été fermées par de l'acide polyglycolique 5-0 (HR13, B. Braun Surgical, SA, Rubi, Espagne) et du monofilament de polypropylène 4-0 (DS16, B. Braun Surgical, SA, Rubi, Espagne) respectivement. Afin de réduire la douleur légère de l'opération, les souris ont été traitées avec 5 mg/kg de carprofène (Rimadyl ; Pfizer, Wurselen, Allemagne) après l'opération. Des souris IL-6R-/- ont été soumises à une hépatectomie partielle à 70 %. À des moments précis (0, 12 et 24 h) après la chirurgie, les souris ont été pesées et anesthésiées (100 mg/kg de kétamine, 10 mg/kg de xylazine ; Vetoquinol GmbH, Ravensburg, Allemagne). Lors de l'anesthésie, les souris ont été saignées afin de générer le sérum pour une analyse ultérieure. Pour le tissu hépatique, le foie a été rincé avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et pesé pour calculer le rapport poids du foie sur poids corporel et les échantillons de tissus ont été stockés à -80 ° C pour l'histologie et l'extraction de l'ARN et des protéines.

GIL-11 a été produit et sécrété par des cellules Expi293 (Thermo Fisher) et purifié par chromatographie d'affinité Strep-Tag (Strep-TactinXT 4flow ; IBA, catalogue n° 2-5023-001) selon le manuel du fabricant. Afin de forcer la signalisation des cytokines, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale (ip) de 20 µg de GIL-11 24 h avant et directement après la chirurgie.

L'ARN total a été extrait du foie et de la rate à l'aide de Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La concentration d'ARN a été mesurée avec le spectrophotomètre NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA, cat. #172-5140) et ajustée à 100 ng/µl pour tous les échantillons. Pour déterminer l'expression de gènes spécifiques, le kit iTaqTM Universal SYBR green One-Step (BioRad, Californie, États-Unis, n° de catalogue 1725151) a été utilisé. Le Master Mix a été préparé selon les instructions du fabricant. 5 µl de mélange réactionnel de sonde universelle iTaq (2 ×), 0,125 µl de transcriptase inverse avancée iScript, 0,125 µl d'amorces et 200 ng d'ARN ont été utilisés. Le volume total du mélange a ensuite été ajusté à 10 ul en ajoutant de l'H2O sans nucléase. Pour l'analyse, les niveaux d'expression de tous les gènes cibles ont été normalisés à l'expression de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (gapdh) (ΔCT). Les valeurs d'expression génique ont été calculées sur la base de la méthode ΔΔCt. Les quantités relatives82 ont été déterminées à l'aide de l'équation : RQ = 2−ΔΔCt. Le niveau d'expression des gènes cibles a été déterminé par le système de PCR en temps réel ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées dans cette étude : GAPDH fw 5′ TCCCACTCTTCCACCTTCGA, GAPDH rev 5′ AGTTGGGATAGGGCCTCTCTT, SAA1 fw 5′ GACACCATTGCTGAGCAGGAA, SAA1 fw 5′ GGGAGTCCAGGAGCTCTGTAG, Ki67 fw 5′ GCCGAGTCTGGCATTGAA, Ki67 rev 5 ′ TTTTCTTTCTTCTTTTGCTGAGG, EGF fw 5′ TTCTCACAAGGAAAGAGCATCTC, EGF rev 5′ GTCCTGTCCCGTTAAGGAAAAC, Cyclin A2 fw 5′ GAGGTGGGAGAAGAATATAA, Cyclin A2 rev 5′ ACTAGGTGCTCCATTCTCAG, G0S2 fw 5′ TCTCTTCCCACTGCACCCTA, G0S2 rev 5′ TCCTGCACACTTTCCCATCTG, un SMA fw 5′ CTGACAGAGGCACCACTGAA, aSMA rev 5′ CATCTCCAGAGTCCAGCACA.

Les données sont fournies sous forme de moyennes arithmétiques ± SEM à l'aide de GraphPad Prism, version 8. Les différences statistiquement significatives entre deux groupes ont été déterminées avec un test t de Student, y compris la correction de Welch si indiquée. L'analyse statistique entre plusieurs groupes a été déterminée à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs, y compris la correction de Tukey ou Dunnet. La signification a été calculée comme suit p > 0,05 : ns ; p < 0,05 : * ; p < 0,01 : ** ; p < 0,001 : *** ; p < 0,0001 : ****. Des essais in vitro ont été effectués au moins dans trois expériences indépendantes. Pour les expériences in vivo, des souris de même portée ont été utilisées comme spécimens individuels indépendants.

Les analyses de données sur les fichiers fastq ont été effectuées avec CLC Genomics Workbench (version 22.0.2, QIAGEN, Venlo. NL). Après le filtrage UMI (Unique Molecular Identifier), toutes les lectures restantes de toutes les sondes ont été ajustées par l'adaptateur et la qualité ajustée (en utilisant les paramètres par défaut : les bases inférieures à Q13 ont été coupées à partir de la fin des lectures, nucléotides ambigus maximum 2). La cartographie a été effectuée par rapport à la séquence du génome de Mus musculus (mm39; GRCm39.107) (20 juillet 2022). Après le regroupement des échantillons (pour les répliques biologiques chacun) en fonction de leur condition expérimentale respective, l'expression différentielle statistique a été déterminée à l'aide de l'outil Differential Expression for RNA-Seq (version 2.7). Les valeurs P résultantes ont été corrigées pour plusieurs tests par correction FDR. Une valeur AP ≤ 0,05 a été considérée comme significative. Le test d'enrichissement de l'ensemble de gènes (version 1.2) a été réalisé avec des paramètres par défaut et basé sur le terme GO « processus biologique » (M. musculus ; 16 décembre 2021). Pour chaque groupe n = 4 échantillons biologiquement indépendants ont été utilisés.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que les données soutenant les résultats de cette étude sont disponibles dans le manuscrit et auprès des auteurs sur demande. Les données d'expression génique de 3′-ARN-Seq sont disponibles sur NCBI Gene Expression Omnibus ; code d'accès : GSE226064. Le plasmide codant pour GIL-11 a été déposé chez Addgene ; ID de plasmide : 199627 et sera fourni sur demande.

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Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Institut de biochimie et de biologie moléculaire II, Faculté de médecine, Université Heinrich-Heine, 40225, Düsseldorf, Allemagne

Puyan Rafii, Christiane Seibel, Hendrik T. Weitz, Julia Ettich, Anna Rita Minafra, Doreen M. Floss, Kristina Behnke, Jens M. Moll et Jürgen Scheller

Centre de recherche biologique et médicale (BMFZ), Faculté de médecine, Université Heinrich-Heine, Universitätsstraße 1, 40225, Düsseldorf, Allemagne

Patrick Petzsch

Laboratoire de recherche cardiovasculaire, Faculté de médecine, Hôpital universitaire de Düsseldorf, 40225, Düsseldorf, Allemagne

Alexander Lang et Karl Köhrer

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PR a effectué la plupart des expériences, curation des données, PR, CS, AM, HTW, DMF, KB, JM, JS analyse formelle, validation, enquête, méthodologie, correction du manuscrit ; KB et HTW ont pratiqué une hépatectomie partielle. JE a soutenu le clonage et la culture cellulaire. CS a exprimé et purifié le sgp130Fc ; PP et KK ont participé à l'analyse transcriptomique ; AL a aidé avec le diagramme de Venn et l'ontologie des gènes ; Rédaction de PR et JS - brouillon original ; Administration du projet JS, acquisition de financement.

Correspondance avec Jürgen Scheller.

JS, PR et JM sont les inventeurs de GIL-11 et détiennent des brevets pour cette molécule (EP22214005.5). Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Joao Valente.

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Rafii, P., Seibel, C., Weitz, HT et al. Cytokimera GIL-11 a sauvé des souris déficientes en IL-6R de la mort induite par une hépatectomie partielle en signalant via des complexes non naturels gp130:LIFR:IL-11R. Commun Biol 6, 418 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4

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Reçu : 30 juin 2022

Accepté : 27 mars 2023

Publié: 15 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4

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