Production hétérologue du D

Jan 12, 2024

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8551 (2023) Citer cet article

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La tuberculose (TB) est la deuxième cause de décès par une seule maladie infectieuse derrière le COVID-19. Malgré un siècle d'efforts, le vaccin antituberculeux actuel ne prévient pas efficacement la tuberculose pulmonaire, ne favorise pas l'immunité collective ou ne prévient pas la transmission. Par conséquent, des approches alternatives sont nécessaires. Nous cherchons à développer une thérapie cellulaire qui produit un antibiotique efficace en réponse à l'infection tuberculeuse. La D-cyclosérine (D-CS) est un antibiotique de deuxième ligne contre la tuberculose qui inhibe la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne. Nous avons déterminé que le D-CS était le candidat optimal pour la thérapie cellulaire antituberculeuse en raison de son efficacité contre la tuberculose, de sa voie de biosynthèse relativement courte et de sa faible incidence de résistance. La première étape engagée vers la synthèse de D-CS est catalysée par la L-sérine-O-acétyltransférase (DcsE) qui convertit la L-sérine et l'acétyl-CoA en O-acétyl-L-sérine (L-OAS). Pour tester si la voie D-CS pouvait être une prophylaxie efficace de la tuberculose, nous nous sommes efforcés d'exprimer le DcsE fonctionnel dans les cellules A549 en tant que modèle pulmonaire humain. Nous avons observé l'expression de DcsE-FLAG-GFP en utilisant la microscopie à fluorescence. Le DcsE purifié à partir de cellules A549 a catalysé la synthèse de L-OAS comme observé par HPLC-MS. Par conséquent, les cellules humaines synthétisent du DcsE fonctionnel capable de convertir la L-sérine et l'acétyl-CoA en L-OAS démontrant la première étape vers la production de D-CS dans les cellules humaines.

La tuberculose (TB) est une maladie infectieuse principalement respiratoire causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb)1. La tuberculose reste l'une des principales causes de décès par maladie transmissible dans le monde, infectant 10 millions de personnes et tuant 1,5 million de personnes en 20212. Le vaccin Bacillus Calmette-Guérin (BCG) contre la tuberculose a des taux de protection variables contre la tuberculose pulmonaire qui ne durent pas jusqu'à l'âge adulte et peuvent entraîner des effets indésirables (pour examen, voir réf.3). D'autres tentatives de vaccin, telles que le vaccin MVA85A, ont été développées pour compléter le BCG mais ont échoué dans les essais de phase IIIb, par conséquent, la prophylaxie antituberculeuse reste insaisissable4.

Le développement d'une prophylaxie antituberculeuse efficace présente une opportunité importante pour des approches alternatives. L'histoire réussie de la chimioprophylaxie et des thérapies géniques émergentes a jeté les bases de la possibilité de développer une prophylaxie génétique qui produit un antibiotique dans les cellules humaines (chimioprophylaxie génétique). L'isoniazide a été utilisé comme chimioprophylaxie qui diminue le risque de développer la tuberculose de 40 % sur 2 ans ou plus5. Les thérapies géniques ont récemment été découvertes efficaces contre le cancer. La thérapie CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-Cell) modifie génétiquement les lymphocytes T pour inclure un récepteur d'antigène chimérique. Cela aide les lymphocytes T à cibler les cellules cancéreuses, en particulier la leucémie aiguë lymphoblastique et les lymphomes à grandes cellules B6. Dans un essai clinique recrutant des enfants atteints de leucémie aiguë lymphoblastique B pour des traitements CAR T-22, 17 participants sur 20 ont obtenu une rémission d'au moins un an7. Après que la thérapie CAR-T ait démontré qu'il est possible de modifier génétiquement des cellules pour cibler les cellules cancéreuses, de nombreuses méthodes alternatives d'administration et thérapies cellulaires ont été développées8. En raison de l'efficacité de la chimioprophylaxie et de l'émergence de la thérapie génique, nous cherchons à explorer la faisabilité d'une chimioprophylaxie génétique produisant un antibiotique pour prévenir la tuberculose.

Après avoir évalué tous les antibiotiques antituberculeux de première et de deuxième ligne, nous avons sélectionné la voie de biosynthèse de la D-cyclosérine (D-CS) comme candidat optimal pour la chimioprophylaxie génétique. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la première enzyme de la voie de biosynthèse, la L-sérine-O-acétyltransférase (DcsE), qui produit la O-acétyl-L-sérine (L-OAS) à partir de la L-sérine et de l'acétyl-CoA9 (Fig. . 1). Nous avons cherché à tester si le DcsE fonctionnel pouvait être exprimé dans les cellules A549, un modèle de cellules pulmonaires humaines de type II10. Nous avons transfecté DcsE marqué avec FLAG et Green Fluorescent Protein (GFP) dans des cellules A549 et observé une production de haut niveau de DcsE-FLAG-GFP en utilisant la microscopie à fluorescence. Nous avons observé la synthèse in vitro de L-OAS spécifiquement par DcsE purifié à l'aide de HPLC-MS. Nous apportons la preuve que le DcsE fonctionnel peut être synthétisé dans les cellules humaines comme première étape pour la synthèse prophylactique du D-CS.

Voie de biosynthèse pour D-CS9,14. Réaction en boîte catalysée par DcsE. La D-cyclosérine peut être produite par biosynthèse à l'aide de six enzymes, DcsA-G, (en gras) et de réactifs biologiquement disponibles : la L-sérine, la L-arginine et l'acétyl-CoA12.

Pour identifier l'antibiotique optimal pour la synthèse dans les cellules humaines, nous avons sélectionné des antibiotiques TB connus avec des profils de faible résistance, des voies de biosynthèse courtes et des précurseurs présents dans les cellules humaines. Nous avons limité notre recherche aux douze médicaments antituberculeux de première et deuxième ligne, en raison de leur efficacité connue contre la tuberculose (Tableau 1). Nous avons exclu les agents chimiothérapeutiques et les antibiotiques semi-synthétiques qui ne pouvaient pas être produits par biosynthèse (tableau 1). Par exemple, l'isoniazide est produit par synthèse organique et il n'existe aucune voie biosynthétique connue pour sa production11. De même, le composé semi-synthétique, l'amikacine est dérivé de la kanamycine A via une réaction d'acylation avec l'acide L-(-)-4-amino-2-hydroxybutyrique qui n'est pas détecté dans le métabolome humain12. Par conséquent, étant donné que l'amikacine ne peut pas être produite par biosynthèse sans synthèse supplémentaire d'acide L-(-)-4-amino-2-hydroxybutyrique, elle est exclue. Parmi les douze thérapies de première et de deuxième ligne, seules la capréomycine IA/IB, la D-CS, la kanamycine A, la streptomycine et la rifamycine SV ont pu être produites dans les cellules humaines car leurs précurseurs étaient présents dans les cellules humaines et leurs voies sont entièrement biosynthétiques. Entre ces voies, D-CS est la voie la plus courte ne nécessitant que six étapes pour la synthèse (tableau 1). En revanche, la capréomycine IA/IB nécessite quatorze étapes, la kanamycine nécessite huit étapes, la streptomycine nécessite vingt-cinq étapes et la rifamycine SV nécessite vingt-sept étapes. Le D-CS est un antibiotique de deuxième ligne capable de traiter la tuberculose multirésistante et est produit par plusieurs espèces de Streptomyces13. S. lavendulae produit du D-CS en utilisant la L-sérine, l'acétyl-CoA, la L-arginine et six enzymes codées par DcsABCDEG (Fig. 1). Cette voie de biosynthèse a été reproduite de manière hétérologue chez Escherichia coli et s'est avérée synthétiser des concentrations micromolaires de D-CS14. De plus, le D-CS inhibe deux enzymes essentielles pour la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne, l'alanine racémase et la D-alanyl-D-alanine ligase15, ce qui contribue à la faible incidence de résistance au D-CS16. Parce que D-CS est synthétisé dans une voie relativement courte, les précurseurs sont présents dans les cellules humaines, et il y a une faible incidence de résistance 16, la voie D-CS est optimale pour la chimioprophylaxie génétique proposée.

Nous avons cherché à tester si DcsE, la première enzyme de la voie de biosynthèse S. lavendulae D-CS, est fonctionnelle lorsqu'elle est synthétisée dans des cellules humaines. Pour exprimer DcsE-FLAG-GFP dans des cellules pulmonaires humaines (A549), nous avons transfecté les cellules avec de l'ADN plasmidique contenant DcsE-FLAG-GFP ou FLAG-GFP comme contrôle négatif. La fluorescence GFP peut être utilisée pour mesurer si DcsE est exprimé et son emplacement dans la cellule. Après douze heures de transfection, nous avons observé une fluorescence GFP diffuse dans les cellules transfectées FLAG-GFP (Fig. 2a). En revanche, nous avons observé à la fois une fluorescence GFP diffuse ainsi que des points lacrymaux dans les cellules transfectées DcsE-FLAG-GFP (Fig. 2b). Sur la base de ces observations, nous concluons que DcsE-FLAG-GFP s'exprime dans les cellules A549.

Les cellules A549 expriment FLAG-GFP et DcsE marqués avec FLAG et GFP. ( a ) La GFP dans les cellules A549 transfectées par FLAG-GFP (contrôle négatif) indique l'expression de GFP-FLAG et d'une protéine plus diffusée. ( b ) La GFP dans les cellules A549 transfectées par DcsE-FLAG-GFP indique une expression plus ponctuée de DcsE-FLAG-GFP. Microscopie optique (LM), Green Fluorescent Protein (GFP). La barre d'échelle est de 100 µm.

Nous avons développé une méthode pour détecter L-OAS et les réactifs dans un tampon de réaction adapté au DcsE en utilisant HPLC-MS/MS. Nous avons observé des temps de rétention spécifiques pour la L-sérine à 0,9 min (Fig. 3a), L-OAS à 1,1 min (Fig. 3b) et l'acétyl CoA (Fig. S1) avec des masses correspondant à la L-sérine et L-OAS (Fig. 3c–f). Un ion parent d'un standard de L-sérine a donné une masse de 106,049 m/z et des fragments en une masse de 88,0396 m/z, ce qui est cohérent avec la perte d'un groupe alcool (Fig. 3e). Un ion parent d'un standard L-OAS a donné une masse de 148,06 m/z avec trois ions fragments de 130,05 m/z (cohérent avec la perte d'un groupe alcool de L-OAS), 106,049 m/z (cohérent avec la perte du groupe acétyle sur L-OAS) et 88,0396 m / z (conforme à la perte d'un groupe alcool de la sérine désacétylée; Fig. 3f).

Temps de rétention, MS, résultats MSMS et courbes standard pour la L-sérine et L-OAS dans le tampon de réaction à l'aide de HPLC-MS. ( a ) Chromatogramme HPLC montrant le temps de rétention par rapport au nombre de L-sérine 500 µM (0, 9 min). ( b ) Chromatogramme HPLC d'un étalon L-OAS pur de 125 µM. L-OAS (noir) et la fragmentation de L-OAS en L-sérine (rouge) apparaissent au temps de rétention de 1,1 min. ( c ) Pic de mode positif ESI-TOF pour la L-sérine 106, 05 m / z (poids moléculaire (MW) de la L-sérine 105, 09). ( d ) Pic en mode positif ESI-TOF pour L-OAS 148,0581 m / z (MW de L-OAS 147,13) et L-OAS fragmenté en L-sérine 106,0499 m / z. (e) Tandem MS pour la L-sérine à 5 V montre un seul fragment de 88,0396 m/z et une L-sérine intacte à 106,0499 m/z. (f) Tandem MS pour L-OAS à 5 V montre des fragments de 88,0396, 106,0499, 130,0500 et L-OAS intact à 148,0602 m/z. ( g ) Relation linéaire entre la surface du pic de L-OAS à partir de la courbe standard et la surface du pic de L-OAS fragmenté en L-sérine. (h) Courbe standard de L-OAS (concentrations allant de 1 mM à 7,8 µM). Le schéma chimique en médaillon représente une fragmentation cohérente avec les ions fragmentés observés.

Un standard de L-sérine pure ne révèle qu'une masse pour la L-sérine à 0,9 min (Fig. 3c). Un étalon pur de L-OAS révèle des masses de L-sérine et de L-OAS au temps de rétention de 1, 1 min sans pic de sérine à 0, 9 min (Fig. 3b, d). Cette observation est cohérente avec la désacétylation de l'étalon L-OAS en L-sérine par l'ioniseur à électropulvérisation après élution HPLC. Si la sérine était présente dans l'étalon L-OAS d'origine, un temps de rétention distinct aurait été observé.

Pour tester si la désacétylation par l'ESI affecte la quantification de la L-OAS, nous avons comparé le rapport de la surface du pic de la L-sérine (à 1,1 min) et de la surface du pic de la L-OAS (à 1,1 min) sur notre courbe standard L-OAS. Nous avons observé que la fragmentation de L-OAS en L-sérine est proportionnelle à la concentration (Fig. 3g). Par conséquent, notre méthode convient à la détection et à la quantification de L-OAS (Fig. 3h).

Après avoir observé l'expression de DcsE-FLAG-GFP dans les cellules A549, nous avons cherché à déterminer si L-OAS pouvait être détecté à partir du milieu de transfection. Les milieux de cellules A549 exprimant DcsE-FLAG-GFP et FLAG-GFP comme contrôle négatif ont été analysés par HPLC-MS pour détecter L-OAS. L-OAS n'a pas été détecté dans le milieu des cellules transfectées avec DcsE-FLAG-GFP par rapport à FLAG-GFP (Fig. 4). Dans les deux échantillons, une masse de 148,058 m/z a été détectée avec une abondance relative similaire (Fig. 4b, c), cependant, des ions fragments insuffisants associés à un standard L-OAS (Fig. 3f) ont été identifiés (Fig. 4d, e ). Un fragment de 130 m/z a été détecté à partir du milieu de transfection FLAG-GFP indiquant une perte d'un groupe alcool du composé avec une masse de 148 m/z ; cependant, le pic de sérine (106 m / z) et l'ion fragment de sérine n'ont pas été détectés (Fig. 4d). Aucun ion fragment n'a été détecté dans le milieu de transfection DcsE-FLAG-GFP, indiquant que le composé d'une masse de 148 m / z n'était pas L-OAS (Fig. 4e). Pris ensemble, nous concluons que L-OAS n'a pas pu être détecté à partir du milieu de transfection.

Aucune détection de L-OAS à partir du milieu de cellules A549 transfectées avec DcsE-FLAG-GFP ou FLAG-GFP. ( a ) Chromatogramme de L-OAS suspecté (148 m / z) détecté à partir des milieux de transfection FLAG-GFP (rouge) et DcsE-FLAG-GFP (noir). (b, c) Pics ESI-TOF de 148,058 m/z représentant le L-OAS suspecté à 1,14 min à partir des milieux de transfection FLAG-GFP (b) et DcsE-FLAG-GFP (c). (d,e) Tandem MS de 148 m/z de (b) et (c), respectivement, montrent des fragments de 84,0444, 102,0545, 130,0497 et 148,06 m/z à 5 V. Les ions fragmentés attendus 88,0396 et 106,05 d'un La norme L-OAS n'a pas été détectée.

Pour comprendre si DcsE-FLAG-GFP produit dans les cellules A549 est capable de catalyser la réaction de la L-sérine et de l'acétyl-CoA pour former L-OAS, nous avons purifié l'enzyme des cellules à l'aide de l'étiquette FLAG. Pour déterminer si FLAG-GFP et DcsE-FLAG-GFP ont été purifiés après immunoprécipitation, nous avons effectué une analyse par immunoblot sur un lysat de cellules entières et sélectionné des fractions d'immunoprécipitation (voir matériaux et méthodes et Fig. 5). Comme prévu, DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) et FLAG-GFP (28 kDa) sont observés dans leurs lysats respectifs (Fig. 5). FLAG-GFP et DcsE-FLAG-GFP ne sont pas détectés dans l'écoulement ou les lavages indiquant la protéine exprimée par gel d'affinité FLAG capturée. Suite à l'élution avec le peptide 3 × FLAG, la présence de FLAG-GFP et de DcsE-FLAG-GFP indique que le peptide 3 × FLAG élue la protéine ciblée. La présence de bandes supplémentaires dans les élutions concentrées indique une dégradation partielle des protéines. La présence de tubuline dans le lysat et les fractions d'écoulement et l'absence de tubuline dans les élutions indiquent que FLAG-GFP et DcsE-FLAG-GFP sont purifiés à partir d'autres protéines cellulaires (Fig. 5). Ensemble, ces résultats indiquent que la précipitation et l'élution FLAG purifient FLAG-GFP et DcsE-FLAG-GFP.

DcsE-FLAG-GFP est purifié et concentré après immunoprécipitation FLAG. Analyse Western blot des fractions indiquées à partir de la purification de DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) ou FLAG-GFP (28 kDa) à partir de cellules A549 transfectées. 7 µl de la fraction indiquée ont été chargés par piste. La membrane a d'abord été sondée avec un anticorps anti-FLAG, puis décapée et resondée à l'aide d'anti-tubuline comme détaillé dans les matériaux et méthodes. Des transferts en taille réelle et des images en échelle sont fournis en tant que données supplémentaires (Fig. S2).

Pour tester si le DcsE purifié produit dans les cellules A549 peut catalyser la réaction de la L-sérine et de l'acétyl-CoA en L-OAS, nous avons fait réagir la L-sérine et l'acétyl-CoA en présence de DcsE-FLAG-GFP ou FLAG-GFP purifié comme un contrôle et utilisé HPLC-MS pour détecter le produit attendu L-OAS. Nous avons observé L-OAS dans l'échantillon contenant DcsE-FLAG-GFP mais pas FLAG-GFP (Fig. 6a). L-OAS produit par DcsE-FLAG-GFP avait un temps de rétention de 1,117 min (Fig. 6a) et 148,0606 m/z (Fig. 6c). La MS en tandem montre le L-OAS produit par les fragments DcsE-FLAG-GFP en fragments 131,0335, 106,0498 et 88,0395 m/z (Fig. 6d), conformément aux données de MS en tandem pour une norme L-OAS (Fig. 3f). Aucun L-OAS n'a été détecté dans la réaction FLAG-GFP (Fig. 6b). Simultanément, nous avons exécuté une courbe standard de L-OAS (Fig. 3h) pour calculer le L-OAS produit par DcsE-FLAG-GFP. Nous avons observé que DcsE-FLAG-GFP produisait 40,3 µM de L-OAS après une réaction de 1 h à 30 °C. De cela, nous concluons la production hétérologue active de DcsE-FLAG-GFP dans les cellules A549.

Synthèse de l'intermédiaire D-CS, L-OAS, par DcsE-FLAG-GFP purifié hétérologue. Le DcsE purifié ayant réagi avec la L-sérine et l'acétyl-CoA était fonctionnel, comme déterminé par la présence du produit enzymatique, le L-OAS en utilisant HPLC-MS, tel qu'analysé par MassHunter. ( a ) Chromatogramme HPLC de L-OAS produit par DcsE-FLAG-GFP (en noir) à 1,117 min. L-OAS n'a pas été détecté à partir d'une réaction contenant FLAG-GFP (en rouge). ( b ) Les échantillons contenant FLAG-GFP ne produisent aucun pic détectable de 148, 06 m / z à 1, 117 min, ce qui ne suggère aucune production de L-OAS. ( c ) Les échantillons contenant DcsE-FLAG-GFP produisent un pic ESI-TOF de 148, 06 m / z à 1, 117 min, ce qui correspond à la masse de L-OAS. (d) le tandem MS de L-OAS produit par DcsE crée des fragments à 88, 04, 106, 05 et 131, 03 m / z.

Dans cette étude, nous avons observé que les cellules pulmonaires humaines transfectées avec DcsE-FLAG-GFP sont capables de synthétiser du DcsE fonctionnel, qui catalyse la première étape vers la synthèse de D-CS. Le D-CS est un candidat optimal pour une chimioprophylaxie génétique contre la tuberculose car il s'agit de la voie la plus courte connue pour un antibiotique antituberculeux avec des précurseurs biologiquement disponibles (tableau 1). Le DcsE marqué avec FLAG-GFP peut être exprimé dans les cellules A549 (Fig. 2), mais il n'y a pas de différence appréciable entre le L-OAS détecté à partir des milieux de transfection DcsE-FLAG-GFP et FLAG-GFP (Fig. 4). Cependant, DcsE-FLAG-GFP purifié (Fig. 5) catalyse la formation de L-OAS à partir de L-sérine et d'acétyl-CoA (Fig. 6). L-OAS produit par DcsE-FLAG-GFP purifié a le temps de rétention attendu de 1,1 min (Fig. 6a), une masse de 148,13 m/z (Fig. 6c) et produit les mêmes 106 m/z et 131 m/z fragments à 5 V (Fig. 6d) en tant que standard L-OAS 0, 5 mM dans un tampon de réaction (Fig. 3f). Aucun L-OAS n'a été détecté à partir d'une réaction contenant du FLAG-GFP purifié (Fig. 6b).

La production d'une enzyme DcsE active dans les cellules pulmonaires humaines démontre un progrès vers une chimioprophylaxie génétique contre la tuberculose. Des études antérieures ont montré que d'autres antibiotiques antituberculeux tels que l'isoniazide peuvent être utilisés à titre prophylactique pour prévenir l'infection tuberculeuse chez les personnes infectées par le VIH et les personnes qui ont été testées positives pour la tuberculose par le test cutané de la tuberculose26. L'isoniazide n'est pas le seul antibiotique antituberculeux utilisé en chimioprophylaxie ; il a également été démontré que la rifampicine, la pyridoxine et les combinaisons de rifampicine et de pyridoxine réduisent l'incidence de l'infection tuberculeuse par rapport à un placebo27.

Une limitation à l'utilisation de D-CS pour la thérapie génique proposée est la concentration minimale inhibitrice (CMI) relativement élevée pour Mtb de 10 à 50 µg/mL, ce qui pourrait restreindre l'efficacité de la thérapie en fonction de la quantité de D-CS pouvant être produite dans humains. Dans cette étude, 40,3 µM de L-OAS ont été produits après une réaction de 1 h à 30 °C, ce qui équivaut à 5,94 µg/mL de L-OAS, ce qui signifie que la concentration d'un précurseur est inférieure à la CMI de D-CS. De plus, aucun L-OAS n'a été détecté dans les milieux de cellules transfectées FLAG-GFP et DcsE-FLAG-GFP (Fig. 4), de sorte que DcsE et d'autres gènes biosynthétiques D-CS doivent être optimisés.

Cependant, l'expression de D-CS n'a pas besoin d'atteindre la concentration totale de MIC pour être efficace. En règle générale, le D-CS n'atteint pas les concentrations de CMI chez les patients, ce qui suggère que l'atteinte de la CMI n'est pas nécessaire pour l'efficacité thérapeutique. Le D-CS est connu pour sa faible pénétration dans la cavité pulmonaire ; la dose clinique pour les adultes de 250 mg n'atteint que des concentrations inférieures à 2 µg/mL dans les poumons28, ce qui signifie que de petites quantités de D-CS produites de manière intracellulaire alors que l'infection est légère pourraient être cliniquement pertinentes. De futures expériences dans des conditions qui modélisent plus étroitement l'environnement complexe du système humain pourraient mieux déterminer les concentrations réalistes de D-CS qui pourraient être produites. Par exemple, des modèles cellulaires non cancéreux tels que Beas-2B, des macrophages et des modèles in vivo pourraient être utilisés. De plus, les modèles in vivo décriront mieux comment l'expression locale de D-CS pourrait protéger au niveau des organes dans les systèmes corporels.

Pour appliquer en toute sécurité la chimioprophylaxie génétique de la tuberculose, nous proposons de développer une thérapie génique excisable qui délivre le D-CS spécifiquement en présence d'une infection tuberculeuse, comme illustré à la Fig. 7. Une telle thérapie génique devra être excisable en cas d'effets indésirables, inductible en cas d'infection, et actif spécifiquement en réponse à la tuberculose. La recombinaison site-spécifique du système CRE/loxP1 pourrait être utilisée pour exciser définitivement le dcsABCDEG en cas d'effets indésirables. Comme le montre la figure 7a, l'expression de la recombinase CRE est activée par le médicament tamoxifène29. Lorsqu'elle est exprimée, la CRE clive les deux sites loxP, excisant ainsi la construction responsable de la production de D-CS (Fig. 7b). Le système CRE/loxP1 est un système approprié pour cette application car il est précis, contrôlé par un médicament qui n'est pas naturellement présent dans les cellules humaines, et est capable d'arrêter l'expression de D-CS rapidement et définitivement. De plus, dcsABCDEG sera exprimé sélectivement en présence d'infection par un élément promoteur sensible à l'infection approprié (InfRE; Fig. 7c). Par exemple, le promoteur MIP-2 pourrait être utilisé pour activer le plasmide en présence de bactéries intracellulaires telles que Mtb30,31. Étant donné que le promoteur MIP-2 est sensible à toutes les infections intracellulaires, une ingénierie moléculaire supplémentaire sera nécessaire. Pour ce faire, la protéase MycP132, produite par Mtb, pourrait être utilisée pour contrôler l'expression d'enzymes fonctionnelles. En liant DcsABCDEG avec le polypeptide spécifique de MycP1 SLKPASAGGG, nous nous attendons à ce que l'enzyme active ne soit produite qu'en présence de TB. En incluant un promoteur induit par l'infection, des sites MycP1 entre chaque enzyme pour contrôler la fonctionnalité des enzymes en présence de tuberculose, et un plasmide excisable contrôlé par CRE/loxP1 dans notre conception, l'expression des gènes de synthèse D-CS est contrôlée.

Plasmide D-CS excisable proposé pour l'expression inductible par la tuberculose. ( a ) Carte du plasmide D-CS proposé. Promoteur de l'élément sensible à l'infection (gris : InfRE), promoteur inductible par le tamoxifène (gris : TAM), gènes DcsABCDEG et CRE (rouges), sites loxP excisables (or), sites de clivage Mtb MycP1 SLKPASAGGG (lignes pointillées). ( b ) Cellule avec un plasmide excisé activé par le tamoxifène qui exprime la recombinase CRE pour couper aux sites loxP. ( c ) Cellule n'exprimant pas DcsABCDEG en l'absence d'infection tuberculeuse. ( d ) Cellule exprimant DcsABCDEG dans le cas d'une infection tuberculeuse.

Un autre facteur de sécurité important est la tolérance de l'hôte. Comme le montre la figure 1, DcsA et B synthétisent de l'hydroxyurée à partir de L-arginine14. L'hydroxyurée est connue pour être cytotoxique pour les cellules humaines entre des concentrations de 2 à 10 mM 33. Bien que ces concentrations dépassent de loin la concentration in vivo attendue de D-CS d'environ 50 µM, un futur domaine d'étude important consistera à déterminer si l'hydroxyurée atteint des niveaux toxiques. niveaux, ou est consommé assez rapidement par DCSD pour éviter tout effet cytotoxique.

Le système utilisé pour administrer la chimioprophylaxie génétique doit être de longue durée et bien toléré. Les virus adéno-associés (AAV) sont un moyen de délivrer une construction similaire à celle proposée sur la figure 7a. Les AAV sont un moyen polyvalent et efficace de délivrer du matériel génétique via une enveloppe protéique contenant de l'ADN simple brin34. La capacité du génome de l'AAV est généralement considérée comme étant d'environ 4,5 à 5 kb, ce qui est inférieur à la taille estimée du plasmide proposé à la Fig. 7. Cependant, il a été démontré que l'AAV5, un sérotype d'AAV, incorpore des tailles de génome allant jusqu'à 8,9 kb35 qui est plus grand que le plasmide proposé à la Fig. 7. Les liposomes cationiques (CL) sont un autre exemple d'une technologie capable de délivrer une thérapie génique. Les CL ne sont pas viraux et utilisent une membrane bicouche lipidique fermée pour délivrer les gènes et protéger l'ADN de la dégradation36. Les CL sont très personnalisables et peuvent transférer jusqu'à 1 000 kb36 dans les cellules, ce qui en fait une autre technologie prometteuse pour les applications de thérapie génique. Dans l'ensemble, les AAV et les CL sont des méthodes de livraison qui pourraient être utilisées pour livrer le tissu de construction de manière spécifique, sûre et fiable. L'administration in vivo de la thérapie génique est un domaine de recherche actif pour augmenter l'efficacité de transfection relativement faible à l'aide de l'AAV et du CL37. De plus, des études futures seraient nécessaires pour déterminer si les macrophages ou les cellules pulmonaires seraient une meilleure cible ultime pour cette approche basée sur la nature de l'infection tuberculeuse et l'efficacité de transfection de chaque type de cellule.

En observant la production hétérologue de DcsE-FLAG-GFP fonctionnel, nous apportons la preuve que la première étape de la synthèse prophylactique de D-CS est possible dans les cellules humaines. Nos orientations futures immédiates incluent le développement d'une méthode pour observer cette activité enzymatique dans les cellules A549 vivantes et éventuellement passer à la synthèse des six enzymes de la voie D-CS via le plasmide proposé. De plus, de futures études pourraient reproduire cette étude dans des modèles cellulaires non cancéreux tels que Beas-2B ou des macrophages. Enfin, des modèles in vivo seraient finalement nécessaires pour déterminer l'efficacité de la chimioprophylaxie génétique proposée. Dans l'ensemble, avec la croissance rapide des thérapies cellulaires, nous cherchons à créer dès maintenant les outils nécessaires pour nous préparer à un état futur où les thérapies géniques seront courantes, sûres, économiquement plausibles et bien acceptées.

Les cellules épithéliales respiratoires A549 (ATCC CCL-185) ont été maintenues dans un milieu F-12 K complet composé de Kaighn's Modification of Ham's F-12 K Medium (ATCC 30–2004), 10 % FBS (v/v; VWR 89,510–186) , et 1 % de pénicilline-streptomycine (v/v ; ATCC 30-2300). Les cellules ont été conservées conformément aux directives de manipulation de l'ATCC pour les cellules A54938.

Le gène DcsE est présent dans la bactérie synthétisant la D-cyclosérine Streptomyces lavendulae. S. lavendulae (ATCC #11 924) a été obtenu auprès de l'ATCC sous forme lyophilisée et a été réanimé conformément aux instructions du fournisseur (ATCC, nd-c). L'organisme a été ravivé dans un bouillon d'extrait de malt de levure (5 g de dextrose, 2,5 g de peptone, 1,5 g d'extrait de malt et 1,5 g d'extrait de levure complété à 500 ml dans du diH2O) et strié sur le même milieu gélosé, la croissance se produisant deux jours après ensemencement à 26°C.

Une culture liquide fraîche de S. lavendulae a ensuite été cultivée à partir d'une seule colonie, et après la croissance, les cellules ont été lysées. 5 ml de cellules ont été culottés et lavés dans 200 ul de tampon de digestion au lysozyme. Ensuite, les cellules ont été transférées dans un tube à centrifuger à bouchon à vis contenant des billes de verre de 0,1 mm et homogénéisées pendant 30 s. L'ADN génomique a ensuite été extrait des bactéries à l'aide du PureLink Genomic DNA Minikit (référence catalogue k182001). La solution éluée finale a été analysée à l'aide d'une nanogoutte et a révélé le pic propre à 260 nm caractéristique de l'ADN. Deux lectures de concentration ont été effectuées, donnant une concentration approximative de 15 ng/µl.

DcsE a d'abord été cloné dans le vecteur pCOOFY50 (plasmide Addgene # 55 189) par assemblage Gibson (https://www.nature.com/articles/nmeth.1318) en utilisant le système d'ADN NEB HiFi (catalogue # E2621S). 20 ng de squelette PCOOFY50 ont été amplifiés à l'aide des amorces AB0001 et AB0002 (Tableau 2) et de la polymérase haute fidélité pHusion (NEB # M0530S) selon le protocole PCR décrit dans le Tableau 3. De même, un fragment DcsE a été amplifié à l'aide de 50 ng de génomique ADN de S. lavendulae et amorces AB0009 et AB0010 selon le même protocole. Après le nettoyage du produit de PCR à l'aide du kit de nettoyage et de concentration Zymo (Zymo # D4004), les extrémités homologues des deux produits ont été recuites à l'aide du système NEB HiFi DNA (catalogue # E2621S) et transformées en DH5α E. coli comme décrit ci-dessous.

Ni DcsE ni GFP n'ont été exprimés à l'aide du vecteur pCOOFY50, donc DcsE a été sous-cloné dans pCS2 + (https://www.addgene.org/vector-database/2295/) contenant FLAG-GFP en aval du promoteur CMV. DcsE a été sous-cloné dans pCS2 + en utilisant une amplification PCR suivie d'un assemblage Gibson comme décrit ci-dessus avec les modifications suivantes : les amorces ASB001 et ASB002 ont été utilisées pour amplifier le squelette pCS2-FLAG-GFP et les amorces ASB011 et ASB012 ont été utilisées pour amplifier DcsE à partir de pCOOFY50 DcsE. Les plasmides résultants ont été nommés pCS2-FLAG-GFP et pCS2-DcsE-FLAG-GFP.

Les séquences promotrices et les cadres de lecture ouverts des plasmides ont été vérifiés par séquençage Sanger à l'installation de séquençage du Comprehensive Cancer Center (UCCC) de l'Université de Chicago.

Pour transformer la DH5α compétente avec DcsE-FLAG-GFP ou FLAG-GFP, 50 µl de DH5α compétente et 2 µl de plasmide purifié ont été combinés et incubés sur de la glace pendant 30 min. Les échantillons ont été soumis à un choc thermique à 42 ° C pendant 45 s et placés sur de la glace pendant 5 min. 800 ul de SOC ont été ajoutés et secoués pendant une heure à température ambiante. 150 ul de cette solution ont été étalés sur des plaques de gélose LB avec 100 ug/ml d'ampicilline et cultivés pendant une nuit à 37°C. Une colonie a été transférée dans 5 ml de bouillon LB stérile avec 100 µg/ml d'ampicilline et agitée à 37 °C pendant 12 h. Le kit ZymoPURE Plasmid Miniprep a été utilisé en suivant le protocole de centrifugation pour purifier le plasmide pur.

Pour transfecter des cellules A549 avec DcsE-FLAG-GFP ou FLAG-GFP, les cellules ont été étalées sur des plaques de 60 mm traitées par culture tissulaire à une concentration de 176 800 cellules/mL dans du milieu F-12 K complet. 12 h après le placage, les cellules ont été transfectées à l'aide de Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher L3000) et de 6 ug de plasmide purifié conformément aux directives de Thermo Fisher pour les cellules A54939. Les cellules ont été transfectées pendant une nuit pendant 12 h à 37 ° C à 4,5 % de CO2. Après 12 h de transfection, le milieu a été collecté et conservé pour une analyse ultérieure.

Les cellules A549 ont été imagées 12 h après la transfection à l'aide d'un microscope à contraste de phase inversé Nikon Eclipse TE2000-U (Tokyo, Japon) avec une alimentation Nikon TE2-PS100W, une lampe au mercure Chiu Technical Corporation 100-W (Kings Park, États-Unis) et Logiciel Nikon NIS-Elements. Les images cellulaires ont été prises à l'aide de l'objectif 10X, du zoom bonus 1,5X et de la phase 1. Pour chaque position, une image a été prise à l'aide d'un contraste interférentiel différentiel (DIC) pour focaliser les cellules et la lumière bleue pour imager la fluorescence GFP. ImageJ a été utilisé pour fusionner des images.

Les cellules A549 ont été lysées immédiatement après la transfection et l'imagerie. Le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées avec 5 ml de PBS (ATCC 30-2200). 150 µl de tampon de lyse froid pour essai de radioimmunoprécipitation (RIPA) contenant 150 mM de NaCl, 1 % d'IGEPAL CA-630 (NP40), 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS (dodécylsulfate de sodium), 50 mM de Tris–HCl, pH 8,0 ont été ajoutés à chaque assiette. Les cellules ont été lysées sur de la glace pendant environ 30 secondes à l'aide d'un grattoir à cellules. Un microscope inversé a été utilisé pour s'assurer que toutes les cellules ont été lysées. Tout le liquide a été transféré dans des tubes de microcentrifugeuse prérefroidis et centrifugé à 13 000 xg pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a été transféré dans un nouveau tube et la purification a immédiatement suivi.

Le lysat cellulaire a été immédiatement purifié pour éliminer les protéases dans le lysat brut. La protéine a été purifiée à l'aide du gel d'affinité Sigma Monoclonal ANTI-FLAG M2 et le protocole sigma "Immunoprécipitation des protéines de fusion FLAG à l'aide de gels d'affinité d'anticorps monoclonaux" a été suivi. Du TBS (Tris HCl 0,5 M, pH 7,5, NaCl 1 M) a été utilisé pour laver le gel avant l'immunoprécipitation. Les échantillons ont été élues trois fois en utilisant le peptide 3 × FLAG (Rockland Immunochemicals) à une concentration de travail de 150 ng/µL dans du TBS. Après l'élution, les échantillons ont été filtrés à l'aide de 500 µl de filtre microcentrifugeuse 10 kDa (Amicon) pour filtrer l'excès de peptide 3 × FLAG, échanger le tampon de lyse contre 10 × tampon de réaction contenant 40 mM Tris – HCl (pH 7,6), 400 mM NaCl, 2 mM EDTA, modifié à partir de et pour concentrer les échantillons jusqu'à un volume final de 50 µl.

La présence de FLAG-GFP et de DcsE-FLAG-GFP a été détectée à l'aide du protocole abcam Western blot40. 7 µl de chaque fraction ont été chargés par voie avec 2,5 µl de tampon d'échantillon 4 × LDS (Thermo Fisher NP0007). Une échelle de protéines précolorée PageRuler de 5 µl a été utilisée comme référence (Thermo Fisher 26 616). Un gel NuPAGE 4–12 % Bis–Tris (Thermo Fisher NP0321BOX) a été utilisé avec un tampon de fonctionnement NuPAGE MES SDS (Thermo Fisher NP0002) conformément aux instructions du fabricant41. Les gels ont été transférés sur une membrane PVDF à l'aide d'une cellule de transfert semi-sèche Bio-Rad Trans-Blot SD à 25 V pendant 30 min avec un tampon de transfert Bjerrum Schafer-Nielsen : Tris Base 48 mM et Glycine 39 mM (pH 9,2). La membrane a été bloquée dans du BSA à 3 % (p/v) dans du PBS à 0,1 % de Tween 20. L'anti-FLAG primaire (Sigma F1804) a été dilué au 1/1000 dans du BSA à 3 % et l'anti-souris secondaire (Thermo Fisher 31,431) a été dilué. 1:10 000. Le substrat ECL (BioRad 1 705 062) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant42 avec un système d'imagerie BioRad ChemiDoc. Les Western blots ont été strippés et résondés en utilisant le protocole de stripping abcam pour le résondage43. L'anti-tubuline primaire (NOVUS NB600-936) a été dilué au 1:1000 et l'anti-lapin secondaire (Promega W401B) a été dilué au 1:2000. Les transferts ont été imagés comme décrit ci-dessus.

Pour effectuer la synthèse in vitro de L-OAS14, 20 µl de DcsE-FLAG-GFP et FLAG-GFP purifiés ont été mis à réagir dans une réaction de 50 µl à une concentration finale de 1 mM de L-sérine et 1 mM d'acétyl-CoA dans un tampon de réaction44 contenant du Tris-HCl 4 mM (pH 7,6), du NaCl 40 mM, de l'EDTA 0,2 mM et du dithiothréitol (DTT) 1 mM. Les échantillons ont été mis à réagir pendant 1 h à 30 °C.

La HPLC-MS a été utilisée pour détecter la L-sérine et la L-OAS à partir d'échantillons de synthèse in vitro de L-OAS. Les échantillons ont été séparés à l'aide d'une HPLC Agilent 1290 Infinity II avec une colonne C18 aqueuse YMC ODS-AQ 2,0 mm × 100 mm, 5 μm (YMC America) et un spectromètre de masse Agilent 6545 Quadripôle Time of Flight LC/MS en mode positif au Installations du Molecular Structure Education and Research Center (IMSERC) de la Northwestern University. 1 µl d'échantillons ont été injectés en commençant par une concentration de 100 % de solvant A (H2O + 0,1 % d'acide formique (FA)) et 0 % de solvant B (ACN + 0,1 % FA). Le rapport du solvant B a été augmenté linéairement à 50 % de 2,0 à 7,0 min. De 7,0 à 9,0 min, le rapport de solvant B a de nouveau augmenté linéairement jusqu'à 99 %. De 11,0 min à 11,5 min, le solvant A a été augmenté de 1,0 % à 100 %. Le solvant A est resté à 100 % jusqu'à ce que la méthode totale atteigne 16 min. Le débit a été réglé à 0,3 mL/min et tous les échantillons ont été analysés à température ambiante.

Cette méthode a été utilisée pour créer une courbe standard de dilutions en série 1:1 pour la L-sérine et la L-OAS allant de 500 uM à 3,9 uM. Les échantillons ayant réagi ont été préparés en ajoutant un volume égal de FA à 0,1 % (Sigma 5.43804) dans de l'acétonitrile (Sigma 34 851) immédiatement après la fin de la réaction. Les échantillons ont été vortexés et centrifugés à vitesse maximale pendant 10 minutes, puis 75 µl du surnageant ont été transférés dans des flacons d'échantillonneur automatique. En utilisant la même méthode que ci-dessus, la HPLC-MS a été utilisée pour détecter le produit dans les échantillons. Pour la SM en tandem, des tensions de 2,0 et 5,0 V ont été utilisées. Le logiciel MassHunter Data Acquisition a été utilisé pour faire fonctionner l'instrument et MassHunter Qualitative Analysis a été utilisé pour l'analyse des données (Agilent MassHunter Quantitative Analysis, Version 10.0, Build 10.0.10305.0. RRID:SCR_016657).

Les données sous-jacentes de ce travail sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs remercient le Dr Fernando Tobias et le Dr Ben Owen des installations du nord-ouest de l'IMSERC pour leur aide en utilisant HPLC-MS et le DebBurman Lab pour leur microscope à fluorescence. Les auteurs remercient également Rebecca Delventhal et Karen Kirk pour leur lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le programme de biochimie et de biologie moléculaire du Lake Forest College.

Département de chimie et biochimie et programme de biologie moléculaire, Lake Forest College, Lake Forest, États-Unis

Laurel Robbins, Ariane Balaram, Stefanie Dejneka, Matthew McMahon, Zarina Najibi, Peter Pawlowicz et William H. Conrad

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LR et WC ont écrit le manuscrit principal et conçu des expériences. LR a effectué toutes les expériences à l'exception de la conception de plasmide. ZN a conçu des expériences et contribué à reproduire la Fig. 1. AB a réalisé la construction et la validation du plasmide. LR a généré toutes les figures sauf la Fig. 7 et MM a préparé le Tableau 1. SD et PP ont contribué à l'introduction, aux expériences et à la Fig. 7. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à William H. Conrad.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Robbins, L., Balaram, A., Dejneka, S. et al. Production hétérologue de l'intermédiaire D-cyclosérine O-acétyl-L-sérine dans un modèle de cellule pulmonaire humaine de type II. Sci Rep 13, 8551 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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Reçu : 19 octobre 2022

Accepté : 21 mai 2023

Publié: 26 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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