Chromatographie par paires d'ions

Mar 13, 2023

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La chromatographie des analytes chargés est souvent difficile car ils ne sont pas retenus efficacement sur les colonnes à phase inversée couramment utilisées et s'éluent dans le volume mort. Sur les colonnes avec des phases stationnaires polaires ou aqueuses, les formes des pics peuvent être médiocres en raison d'une rétention excessive. Les colonnes échangeuses d'ions qui utilisent des phases stationnaires chargées pour séparer les ions chargés de manière opposée sont coûteuses, adaptées à une petite gamme d'analytes et ont une efficacité de séparation limitée. La chromatographie par paires d'ions (IPC) est une alternative appropriée pour la chromatographie d'espèces polaires ou ioniques.

Qu'est-ce que la chromatographie par paires d'ions ?

En quoi la chromatographie en phase inversée par paires d'ions diffère-t-elle des autres types de chromatographie ionique ?

- Mécanisme de rétention

- Facteurs affectant la rétention

- Rôle de l'effet paire d'ions

- Analyse environnementale

- Analyse pharmaceutique et alimentaire

- Analyse biologique

- Analyse des métaux

Conclusion

L'IPC est un type de chromatographie ionique qui est utilisé pour séparer les analytes hydrophiles ou chargés sur des colonnes en utilisant des phases stationnaires en phase inversée ou "neutres" qui ne portent pas de charges. Il s'agit de modifier la polarité des analytes chargés par leur interaction avec un réactif d'appariement d'ions qui est ajouté à la phase mobile. Ces molécules réactives portent des charges opposées à celle des ions analytes avec lesquels elles sont capables de former des liaisons électrostatiques. Les paires formées entre les analytes et les ions réactifs se comportent comme des fractions neutres et hydrophobes qui peuvent être séparées sur des colonnes C18 ou C8. L'IPC est utilisé pour la séparation des acides organiques polaires, des bases et des zwitterions ainsi que des ions inorganiques.

Les réactifs d'appariement d'ions sont également connus sous le nom d'additifs d'appariement d'ions ou d'hétérons. Comme ces molécules ont une tête polaire et des chaînes hydrocarbonées hydrophobes, elles ressemblent à un savon (Figure 1). Par conséquent, cette technique a été appelée « chromatographie au savon » lorsqu'elle a été introduite par Göran Schill en 1973.1,2 Elle est également appelée chromatographie à interaction ionique, car l'ion réactif interagit avec la phase stationnaire pour réguler la rétention des ions présents dans l'échantillon. .

La chromatographie ionique (CI) fait généralement référence à la séparation des ions et comprend trois mécanismes distincts, à savoir l'échange d'ions, l'exclusion d'ions et l'appariement d'ions. Lorsque la séparation est provoquée par une interaction compétitive entre les ions analytes et les ions éluants pour les sites chargés de manière opposée sur la phase stationnaire (Figure 2), le type de chromatographie est appelé chromatographie échangeuse d'ions (IEX).

Un mélange d'analytes non dissociés, partiellement dissociés et entièrement dissociés peut être séparé par chromatographie d'exclusion ionique (CEI), qui utilise également des phases stationnaires chargées (Figure 3). La phase mobile s'accumule en surface et à l'intérieur des pores de la phase stationnaire conduisant à la formation d'une "phase occluse". Les analytes neutres sont fortement retenus dans la phase occluse et éluent en dernier de la colonne. Les analytes partiellement dissociés qui ont une interaction légèrement moindre avec la phase mobile adsorbée éluent plus tôt. Les analytes entièrement dissociés et chargés qui sont repoussés par les ions chargés de manière similaire de la phase stationnaire, la "membrane Donnan", s'éluent en premier, tous dans le volume vide de la colonne.

La chromatographie en phase inverse à paires d'ions est réalisée sur des colonnes non polaires "en phase inverse" en ajoutant des réactifs d'appariement d'ions à la phase mobile. Par exemple, l'acide trifluoroacétique est utilisé pour l'appariement avec des peptides chargés positivement, tandis que les trialkylamines sont utilisées pour l'appariement ionique avec des anions tels que des carboxylates ou des oligonucléotides.

La chromatographie ionique en phase mobile (MPIC) est un terme souvent utilisé dans le contexte de la séparation de petits ions inorganiques par IPC, suivie de leur détection par mesure de conductivité supprimée. Cette technique est adaptée à l'analyse de molécules à charges localisées.

Quelques microlitres de solution d'échantillon sont injectés dans une colonne en phase inverse. Lorsque la phase mobile contenant le réactif d'appariement d'ions s'écoule à travers la colonne, les ions analytes interagissent avec les ions réactifs de charge opposée et forment des complexes neutres qui peuvent être séparés sur une phase stationnaire non polaire. La séparation des analytes est contrôlée par le réactif d'appariement d'ions, les modificateurs organiques et tous les sels ajoutés à la phase mobile.

Les méthodes spectroscopiques ultraviolettes (UV) et de fluorescence sont les techniques de détection les plus couramment utilisées pour l'IPC. L'utilisation d'autres techniques telles que la spectrométrie de masse (MS) et la spectrométrie plasma-masse à couplage inductif (ICP-MS)3 a également été rapportée. La mesure de la conductivité est une méthode bien établie pour la détection des ions inorganiques par IC mais moins fréquemment utilisée pour l'IPC.4

Différents modèles ont été proposés pour expliquer le mécanisme de séparation observé dans l'IPC.5 Dans le modèle d'appariement d'ions, également appelé modèle de partition, l'interaction entre les ions analytes et les ions réactifs d'appariement d'ions est considérée comme se produisant dans la phase mobile. Les ions analytes avec les contre-ions forment une fraction non polaire qui peut s'adsorber sur la phase stationnaire hydrophobe. Le complexe de paires d'ions est ensuite élué en augmentant la concentration de modificateur organique dans la phase mobile (figure 5).

Le modèle d'échange d'ions, également appelé modèle d'adsorption, implique l'adsorption de la chaîne alkyle lipophile des molécules de réactif d'appariement d'ions sur la phase stationnaire. Les groupes de têtes polaires libres des molécules adsorbées agissent comme un pseudo-échangeur d'ions pour les ions analytes chargés de manière opposée (Figure 6).

Dans le modèle d'interaction ionique, également appelé modèle électrostatique, on pense qu'une double couche électrique se forme lorsqu'une colonne est équilibrée avec la phase mobile contenant un agent d'appariement d'ions. La chaîne hydrocarbonée non polaire de ces fragments se lie à la colonne. Les groupes de têtes polaires forment une couche stationnaire de charges tandis que les contre-ions du réactif d'appariement d'ions dans la phase mobile forment la couche de charge opposée. Les ions analytes subissent une attraction électrostatique vers les charges stationnaires et sont capables de pénétrer la double couche. L'interaction coulombique entre une molécule d'analyte et la couche "chargée" conduit à une diminution apparente de la charge à la surface de la phase stationnaire. Par conséquent, une molécule de l'agent d'appariement ionique est adsorbée à la surface de la phase stationnaire pour restaurer la charge. Pris ensemble, cela peut être considéré comme l'adsorption de deux charges opposées - celle de l'analyte et de l'agent d'appariement d'ions - sur la phase stationnaire.

Figure 7 : Le modèle d'interaction ionique pour la séparation IPC, montrant l'interaction dynamique entre l'ion analyte, les ions réactifs d'appariement d'ions et la phase stationnaire. A) Le réactif d'appariement d'ions se lie à la phase stationnaire. B) Les ions analyte pénètrent dans la double couche. C) Les ions analyte se lient au groupe de tête polaire. D) Une nouvelle molécule de réactif d'appariement d'ions se lie à la phase stationnaire.

Dans IPC, plusieurs paramètres peuvent être modifiés pour obtenir la séparation souhaitée. Considérons quelques-unes des variables affectant la rétention de l'analyte.

Lorsque des électrolytes sont ajoutés à un solvant, ils se dissocient en leurs ions constitutifs et sont entourés par les molécules de solvant. Mais à mesure que la polarité du solvant diminue, la solvatation des ions diminue et, en raison de l'attraction électrostatique, l'interaction entre eux augmente. À mesure que la taille des ions augmente, la densité de charge diminue, ce qui entraîne également une moindre solvatation et une plus grande interaction avec les ions de charge opposée. Plus la charge des ions est élevée, plus la force coulombienne d'attraction entre les ions de charges opposées est forte.

Les réactifs d'appariement d'ions ont de longues chaînes alkyle ou des groupes aryle et ne sont pas aussi solvatés que les petits ions avec des densités de charge élevées. En conséquence, ils peuvent attirer et s'apparier avec des ions analytes chargés de manière opposée. De plus, lorsque les réactifs d'appariement d'ions sont adsorbés sur la phase stationnaire non polaire, leur solvatation est encore réduite. Cela leur permet de former des paires d'ions "serrées" ou "intimes" avec des molécules d'analyte. Ces paires d'ions n'ont pas de molécules de solvant entre les deux ions. Plus la charge de l'analyte et des ions réactifs est élevée, plus la liaison entre eux est forte.

Le choix du réactif d'appariement d'ions est peut-être le paramètre le plus important lors de l'utilisation de l'IPC. Le type de réactif, sa concentration et sa compatibilité avec la phase mobile et le détecteur jouent tous un rôle important dans la séparation efficace des analytes. Les considérations suivantes doivent être prises en compte lors de la sélection d'un réactif d'appariement d'ions pour l'échantillon étudié.

Bien que la chromatographie par appariement d'ions offre certains avantages par rapport à d'autres techniques telles que l'IEX et la chromatographie en phase normale, elle souffre également de limitations (tableau 1). Ces avantages et inconvénients doivent être soigneusement considérés avant d'opter pour ce mode de séparation.

Tableau 1 : Forces et limites de l'IPC.

Forces

Limites

L'analyse d'un mélange de composés polaires, non polaires et ioniques difficiles à séparer par d'autres techniques peut être réalisée en choisissant un réactif d'appariement d'ions approprié et en ajustant sa concentration

De longs temps d'équilibrage sont nécessaires pour que le réactif d'appariement d'ions s'adsorbe à la surface de la phase stationnaire

L'IPC peut être effectué sur des colonnes C18 ou C8 qui sont couramment disponibles dans la plupart des laboratoires

L'analyse des gradients peut être difficile pour l'IPC car les modifications de la composition de la phase mobile pourraient entraîner un équilibrage plus long de la colonne

Les cations et les anions peuvent être séparés en utilisant la même colonne

Le réactif d'appariement d'ions ne doit pas absorber les longueurs d'onde dans lesquelles la détection UV ou de fluorescence est effectuée. La présence de réactifs absorbant la lumière dans la phase mobile peut provoquer des pics fantômes et des pics négatifs en raison d'une absorbance plus faible par l'analyte par rapport à celle de la phase mobile contenant le réactif d'appariement d'ions

Les réactifs d'appariement d'ions aident à améliorer la rétention, la forme des pics et la résolution

Les agents d'appariement d'ions couramment utilisés qui ont une volatilité limitée ont une compatibilité limitée avec les spectromètres de masse. Le TFA, lorsqu'il est utilisé comme modificateur, provoque la suppression du signal dans les spectromètres de masse

Des durées d'exécution et des limites de détection plus faibles peuvent être obtenues en présence de réactifs d'appariement d'ions

Des colonnes dédiées peuvent devoir être utilisées lorsque vous travaillez avec des réactifs IPC

L'IPC a été appliqué pour l'analyse d'une grande variété d'analytes, allant des échantillons environnementaux, pharmaceutiques et alimentaires aux échantillons biologiques et aux métaux.

Plusieurs modes de chromatographie, tels que la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) et IEX, et différents types de phases stationnaires, telles que l'échange d'ions ou polaire, ont été utilisés pour la séparation des molécules chargées et polarisables. Pourtant, l'IPC continue d'être utilisé pour leur analyse en raison de sa simplicité et de sa personnalisation. Des paramètres comprenant le choix du réactif d'appariement d'ions, sa concentration, les modificateurs organiques et les additifs de phase mobile peuvent être optimisés pour obtenir la séparation souhaitée.

Les références

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