Nanoclusters de carbonate de calcium amorphe paramagnétique hautement hydratés comme agent de contraste IRM

Apr 04, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5088 (2022) Citer cet article

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Le carbonate de calcium amorphe joue un rôle clé en tant que précurseur transitoire dans les premiers stades de la formation de carbonate de calcium biogénique dans la nature. Cependant, en raison de son instabilité en solution aqueuse, il y a encore peu de succès à utiliser le carbonate de calcium amorphe en biomédecine. Nous rapportons ici l'effet mutuel entre les ions gadolinium paramagnétiques et le carbonate de calcium amorphe, résultant en des nanoclusters de carbonate amorphe paramagnétique ultrafins en présence à la fois d'un environnement de type carbonate hautement hydraté occlus de gadolinium et de poly(acide acrylique). Il est confirmé que le gadolinium améliore la teneur en eau du carbonate de calcium amorphe, et la teneur élevée en eau des nanoclusters de carbonate amorphe contribue à l'efficacité de contraste d'imagerie par résonance magnétique bien améliorée par rapport aux agents de contraste à base de gadolinium disponibles dans le commerce. En outre, les performances améliorées de l'imagerie par résonance magnétique pondérée T1 et la biocompatibilité des nanoclusters de carbonate amorphe sont évaluées plus en détail chez divers animaux, notamment le rat, le lapin et le chien beagle, en combinaison avec une innocuité prometteuse in vivo. Dans l'ensemble, les nanoclusters de carbonate amorphe à production de masse exceptionnellement faciles présentent de superbes performances d'imagerie et une stabilité impressionnante, ce qui fournit une stratégie prometteuse pour concevoir un agent de contraste par résonance magnétique.

Le carbonate de calcium amorphe (ACC), qui existe largement dans la nature, joue un rôle clé en tant que précurseur transitoire dans les premiers stades de la formation biominérale1,2,3,4. En utilisant une stratégie bio-inspirée, divers matériaux avec une phase contrôlée, des propriétés physiques et chimiques peuvent être obtenus5,6. Le contenu hautement hydraté est une caractéristique distinctive de l'ACC et joue un rôle central dans sa stabilisation6,7,8,9,10,11,12. En tant que phase métastable du carbonate de calcium, l'ACC est instable en solution aqueuse et se transformera rapidement en phases cristallines en raison de la déshydratation, de la liaison des ions et d'autres facteurs6,7,8,13. Par conséquent, l'application potentielle de l'ACC hautement hydraté est largement ignorée et il existe peu d'exemples réussis d'utilisation de l'ACC en biomédecine.

Un paramètre important pour améliorer les performances de contraste des agents de contraste IRM T1 à base de gadolinium est leur hydratation14. Avec sept électrons non appariés, l'ion gadolinium possède un grand moment magnétique et un long temps de relaxation du spin électronique, conduisant à de nombreux agents de contraste extracellulaires à base de gadolinium cliniquement disponibles pour l'IRM T114,15. En vertu d'une fonctionnalisation polyvalente pour interagir avec des biomolécules in vivo et des taux de fuite d'ions gadolinium inférieurs bénéficiant d'une nanostructure inorganique, les nanoagents inorganiques à base de Gd ont attiré une attention considérable15,16. Malheureusement, l'hydratation des nanoparticules à base de gadolinium souffre d'une synthèse à haute température, bien que la fuite d'ions qui en résulte soit minimisée par la nanostructure confinée par rapport aux complexes de chélate15.

Ici, nous introduisons des ions gadolinium dans le processus de minéralisation de l'ACC, qui se sont avérés intégrés dans la phase finale de carbonate de calcium amorphe. Dans ce système amorphe, les ions gadolinium en conjonction avec le poly(acide acrylique) facilitent l'amélioration de l'hydratation de l'eau et de la stabilité des nanoclusters, tandis que le confinement des ions gadolinium par le carbonate améliore la biocompatibilité et les performances, indiquant que le produit résultant possède des propriétés d'agent de contraste IRM remarquables. En outre, un effet mutuel entre l'ion gadolinium de lanthanide paramagnétique et le carbonate de calcium amorphe est découvert, ce qui contribue à la teneur hydratée maximisée dans les nanoclusters composites amorphes préparés et à une relaxation longitudinale élevée. Les nanoclusters finaux de carbonate amorphe paramagnétique (ACNC) possèdent un rapport eau/Ca élevé (eau/Ca = 7,2) par rapport aux ACC normaux (les rapports sont restés constants à environ 0,4-1,9). La relaxivité longitudinale de l'ACNC (37,93 ± 0,63 mM−1 · s−1 sous 3,0 T) a également bénéficié de la forte teneur en eau, qui est dix fois supérieure à celle de l'agent de contraste MR disponible dans le commerce, l'acide gadopentétique (Gd-DTPA) et hautement résistant aux fuites d'ions, il peut donc servir d'agent de contraste potentiel pour la RM.

Jusqu'à présent, outre différents types d'additifs organiques tels que les biomolécules et les polymères, le magnésium est le seul cation inorganique qui a été signalé capable de stabiliser l'ACC6,17. L'ion gadolinium, dont le rayon ionique est plus proche de celui de l'ion calcium que de celui du magnésium, peut être considéré comme un analogue plus petit de l'ion calcium avec une valence et une énergie d'hydratation plus élevées18,19. De même que la chélation entre le poly(acide acrylique) (PAA) et le calcium pour la stabilité accrue de l'ACC7,20, les groupes carboxylate du PAA ont le potentiel de chélater les ions gadolinium, permettant au complexe lié d'être ensuite solidifié en carbonate21.

Comme le montre la figure 1a, du chlorure de calcium et du chlorure de gadolinium ont été mélangés avec du PAA, et une solution de carbonate de sodium équimolaire a ensuite été ajoutée sous agitation vigoureuse. Cette synthèse efficace à température ambiante s'est avérée donner de l'ACNC en présence à la fois de gadolinium et de PAA. Deux litres de produit aqueux peuvent être facilement produits, indiquant l'évolutivité et la reproductibilité de la méthode rapportée ici (Fig. 1b). La présence de grappes dispersées dans une solution saline normale était reflétée par l'effet Tyndall (Fig. 1c). Comme le montre la figure 1d, la morphologie sphérique a été étudiée plus en détail par microscopie électronique à cryotransmission (cryo-TEM) et s'est avérée comparable à l'ACC, comme indiqué précédemment22. Les nanoclusters observés par STEM (Fig. 1 supplémentaire) étaient conformes aux observations TEM à champ sombre annulaire à angle élevé (HAADF-STEM) et le caractère amorphe des clusters a été validé par analyse SAED (Fig. 1e). Les données EDS ont montré les distributions uniformes de gadolinium et de calcium dans les agrégats de grappes (Fig. 2a, b supplémentaires).

un schéma du processus de synthèse de l'ACNC. b Image numérique de l'ACNC préparé à grande échelle avec un volume total supérieur à 2 litres. c Image numérique de l'effet Tyndall de quatre litres d'ACNC dispersés dans une solution saline normale, et une bouteille d'eau déionisée a été insérée (deuxième à droite). d image cryo-TEM et e image HAADF-STEM de l'ACNC dispersée dans une solution saline normale. Une image représentative de trois expériences individuelles est montrée. L'encart en (e) montre la SAED de l'ACNC. Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment. f EXAFS pondéré k2 et g transformée de Fourier pondérée k2 de l'EXAFS pour la norme ACNC et ACC. Les lignes noires pointillées sont leurs meilleurs ajustements. h Modèles SAXS d'ACNC dispersés dans une solution saline normale. Particules de sphère en forme de ligne solide rouge. i Distribution à distance reçue par SAXS d'ACNC dispersés dans une solution saline normale. j TGA de poudre d'ACNC sous atmosphère de N2 avec une vitesse de chauffage de 10 °C min−1. k Spectres TG-FTIR de poudre ACNC sous atmosphère N2 avec une vitesse de chauffage de 10 °C min−1.

L'ACNC n'a présenté aucun pic cristallin dans le diagramme de diffraction des rayons X sur poudre (XRD), même après avoir été dispersé dans une solution aqueuse pendant 6 mois (Fig. 3 supplémentaire). La spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) de l'ACNC a montré les pics caractéristiques, correspondant respectivement à l'oxygène (O 1s), au carbone (C 1s), au gadolinium (Gd 4d) et au calcium (Ca 2p). Conformément à l'observation précédente d'ACC7, les pics avec des énergies de liaison de 350,8 et 347,3 eV ont été attribués à l'état Ca 2p1/2 et Ca 2p3/2, respectivement. Dans le spectre de niveau central de Gd 4d, deux pics ont été observés à 142, 6 eV et 150, 6 eV, ce qui correspondait respectivement aux états Gd 4d5 / 2 et Gd 4d3 / 2 (Fig. 4 supplémentaire). L'ACNC a été étudié plus en détail par spectroscopie d'absorption des rayons X (XAS) et analyse de la structure fine d'absorption des rayons X étendue (EXAFS), et l'environnement Ca – O à courte portée au sein de l'ACNC s'est révélé étroitement lié à ceux de la norme ACC et ACC signalés précédemment10,11,23 (Fig. 1f, g, tableaux supplémentaires 1, 2). La distribution de taille de l'ACNC reçue de l'analyse d'ajustement SAXS a montré un rayon moyen de 1, 3 nm (Fig. 1h, i).

Les résultats de l'analyse thermogravimétrique (TGA) et du calorimètre à balayage différentiel (DSC) pour l'ACNC ont montré une perte de plus de 20 % en poids lors du chauffage à 300 °C en raison de la déshydratation de l'ACC, indiquant une forte teneur en eau de l'ACNC. De plus, la pyrolyse du PAA s'est produite entre 300 et 500 ° C et le carbonate s'est décomposé au-dessus de 550 ° C (Fig. 1j et Fig. 5 supplémentaire). Sur la base du résultat TGA, la composition de l'ACNC comprenait une teneur en eau d'environ 20 %, 40 % de PAA et 40 % de carbonate amorphe. L'absorbance observée en FTIR couplé TGA (TG-FTIR) sur ACNC à 2358 et 2322 cm-1 au-dessus de 550 ° C correspondait à la vibration d'étirement asymétrique du CO2 provenant de la décomposition du carbonate (Fig. 1k). Comme le montre la Fig. 6 supplémentaire, la bande divisée à 1415 et 1454 cm-1 en spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) peut être attribuée à la vibration d'étirement asymétrique des ions carbonate dans des environnements ACC typiques20. Un large pic centré à 1086 cm-1 attribué à l'étirement interne symétrique du CO32 a été confirmé par spectroscopie Raman (Fig. 7 supplémentaire).

Afin d'étudier la contribution de chaque composant au contenu hautement hydraté et à l'environnement de type ACC, une série d'échantillons de contrôle de composition variable ont été synthétisés comme indiqué dans le tableau supplémentaire 3, y compris un composite ACC occlus par Gd (ACC-Gd), ACC stabilisé au PAA (ACC-PAA), carbonate de gadolinium amorphe (AGC), AGC stabilisé au PAA (AGC-PAA) et deux chélates sans carbonate (PAA-Ca et PAA-Ca/Gd). Des modèles XRD et des spectres Raman ont été réalisés pour identifier la phase amorphe (Fig. 8a, b supplémentaires)12. Les résultats de la structure fine d'absorption des rayons X étendue (EXAFS) ont confirmé la présence d'environnements de type ACC (Fig. 2a, b).

a EXAFS pondéré k2 et b transformée de Fourier pondérée k2 de l'EXAFS pour l'ACNC, la norme ACC, l'ACC-PAA, l'ACC-Gd, le PAA-Ca et le PAA-Ca/Gd. Les lignes noires pointillées sont leur meilleur ajustement. c Courbe thermogravimétrique de poudre lyophilisée d'ACC et d'ACC-Gd isolée par de l'eau déminéralisée puis exposée à l'air sec pendant plus de 6 mois. La perte de poids avant 300 °C pourrait être attribuée à la perte d'eau. d La teneur en eau de l'ACC, de l'ACC-PAA, de l'ACC-Gd, de l'AGC, de l'AGC-PAA et de l'ACNC selon l'analyse thermogravimétrique (TG) et les mesures volumétriques de titrage Karl Fischer (n = 3 échantillons indépendants). Les données montrent signifie ± SD. e Rapport molaire des molécules d'eau par mole de CaCO3 dans l'ACC, l'ACC-PAA, l'ACC-Gd et l'ACNC par rapport aux plages de valeurs rapportées de l'ACC sans additif (région rose) et de l'ACC stabilisé au PAA (région orange) (n = 3 échantillons indépendants). Les données montrent signifie ± SD. f Rapport molaire des molécules d'eau par mole de Gd dans AGC, AGC-PAA, ACC-Gd et ACNC (n = 3 échantillons indépendants). Les données montrent signifie ± SD.

En l'absence de PAA, l'ACC-Gd a montré une morphologie typique des nanoparticules d'ACC agrégées avec une distribution uniforme de Gd et de Ca (Fig. 9 supplémentaire). Le résultat de la résonance magnétique nucléaire (RMN) du 13C de l'ACC-Gd a montré une vibration caractéristique à 168 ppm, ce qui indiquait la phase précurseur de l'ACC dans l'ACC-Gd (Fig. 10 supplémentaire). Le spectre FT-IR a montré une cohérence par rapport à la phase de carbonate de calcium amorphe, et la vibration v2 décalée vers une valeur inférieure a indiqué la formation d'une phase de carbonate de gadolinium (AGC) amorphe (Fig. 11 supplémentaire) 24. Le pic d'oxygène (O 1s) du résultat XPS d'ACG était assez similaire à la courbe d'ACC (Fig. 12 supplémentaire)7. Le spectre XPS de l'AGC-PAA présentait un profil similaire à celui de l'ACNC (Fig. 13 supplémentaire).

Les transformations de l'ACC-Gd ont été étudiées dans différents milieux (éthanol, eau) pour explorer plus avant comment Gd affectait la stabilité de l'ACC. Les résultats XRD des échantillons ont été collectés à différents moments (Fig. 14 supplémentaire). Après 6 mois, la calcite, l'aragonite et la vatérite étaient toutes contenues dans de l'ACNC dispersé dans de l'éthanol. À l'opposé, l'ACC-Gd était stable dans l'éthanol pendant 6 mois. L'ACC sans additif fraîchement préparé cristallise rapidement après dispersion dans l'eau, tandis que l'ACC-Gd peut maintenir une phase amorphe pendant des dizaines de minutes. Dans l'ensemble, Gd devrait jouer un rôle raisonnable en retardant la cristallisation de l'ACC. Plus attrayant, il y avait encore une teneur en eau plus élevée dans l'ACC-Gd par rapport à l'ACC pur pendant une longue période. Selon le résultat TGA, la perte de poids avant 300 ° C de la poudre d'ACC-Gd et d'ACC exposée à l'air pendant 6 mois était supérieure à 10% et seulement 0, 1%, respectivement (Fig. 2c). A noter que l'ACC a complètement perdu son eau d'hydratation dans ces conditions.

Dans les résultats des mesures de titrage TGA et volumétrique Karl Fischer, la perte de poids avant 300 ° C pourrait être attribuée à la perte d'eau, et l'ACNC présentait la teneur en eau la plus élevée de 20% en poids calculé parmi les produits de composition différente (Fig. 2d) . Selon des rapports antérieurs, les teneurs en eau par mole de calcium dans l'ACC sans additif et l'ACC stabilisé au PAA se situaient généralement entre 0,4 et 1,58 et 1,33 et 1,93, respectivement20,25. Au contraire, ACC-Gd et ACC-PAA ont montré un rapport eau / Ca plus élevé, et le rapport le plus élevé a été obtenu dans ACNC (eau / Ca = 7, 2) (Fig. 2e), indiquant une amélioration synergique de la liaison de l'eau par PAA et Gd dans ces nanoparticules amorphes. Plus important encore, pour comparer le rapport de l'eau à Gd comme indiqué sur la figure 2f, la teneur en hydrate par mole de gadolinium en présence à la fois d'un environnement de type ACC et de PAA dans l'ACNC est plus de quatre fois supérieure à celle du carbonate de gadolinium occlus par PAA ( PAA-AGC). Par rapport à l'AGC, la présence d'ACC dans le composite Gd-ACC a également entraîné une double augmentation de la teneur en hydrate par ion gadolinium.

Pour étudier l'origine de l'hydratation, une ultracentrifugation analytique (AUC) a été appliquée pour déterminer l'eau d'hydratation de l'ACNC via le rapport de frottement et la fonction de Perrin en supposant une forme sphérique vue dans les images de microscopie électronique (tableau supplémentaire 4). Les échantillons montrent des coefficients de sédimentation de l'ordre de 10−13 s, ce qui est typique pour les clusters de prénucléation (PNC) qui ont des tailles similaires26. Les ACNC ont un diamètre de 1,5 nm, ce qui est encore plus petit que celui trouvé par SAXS, mais toujours en accord raisonnable. Leur masse molaire de 2230 g/mol indique qu'ils sont constitués d'environ 20 paires d'ions CaCO3 dont les ions Gd3+. La quantité déterminée d'eau d'hydratation liée en solution de 8,8 mol H2O par CaCO3 (et 23,0 mol H2O par Gd3+) est considérablement plus élevée que dans les ACC courants (Fig. 2e, f et tableau supplémentaire 5). Notamment, la teneur en eau de l'ACNC déterminée par l'AUC est en accord raisonnable avec les résultats de la TGA, étant donné que l'hydratation a été déterminée respectivement à l'état humide et à l'état sec6.

Outre la contribution du dopant de l'ion gadolinium à la teneur en ACC hautement hydratée, un comportement paramagnétique typique a été obtenu dans les nanoclusters de carbonate amorphe, comme le montre la courbe M – H (Fig. 3a). À la fois l'hydratation élevée et le confinement des ions gadolinium, l'ACNC paramagnétique était propice à l'augmentation des performances de contraste IRM. Les temps de relaxation T1 de l'ACNC dispersé dans une solution saline normale à des concentrations variables ont été mesurés à l'aide d'un scanner 3,0 Tesla MR. Comme le montre la carte T1 (Fig. 3b), la relaxivité longitudinale (r1) de l'ACNC a atteint 37,21 mM−1 · s−1 (Fig. 3c), soit dix fois plus que celle du Gd-DTPA utilisé commercialement (3,19 mM−1 · s−1). Outre la contribution des macromolécules et des nanoparticules, l'ACNC possédait une relaxivité longitudinale quatre fois plus élevée que le carbonate de gadolinium amorphe modifié par le PAA (AGC-PAA) (7,91 mM-1·s-1), ce qui a été attribué à la forte teneur en hydratation de l'ACC -comme des environnements. Cette teneur élevée en eau peut être principalement attribuée à la plus forte capacité d'hydratation du Gd3+ trivalent par rapport aux ions Ca2+ divalents19, ce qui a raisonnablement amélioré les relaxations de la sphère interne et de la sphère externe de l'environnement de type ACC occlus l'ACNC14.

une courbe M – H de l'ACNC à température ambiante. b, c Carte T1 et courbe de concentration 1/T1 versus Gd de ACNC (R2 = 0,9999), AGC-PAA (R2 = 0,9987) et Gd-DTPA (R2 = 0,9966) sous 3,0 T. d Rapport molaire des molécules d'eau par mole de la relaxivité de Gd et r1 dans ACNC, ACNC(2n-PAA), ACNC(n/2-PAA) et ACNC(n/10-PAA) (n = 3 échantillons indépendants). Les données montrent signifie ± SD. e Courbe de concentration 1/T1 versus Gd de l'ACNC (R2 = 0,9999), de l'ACNC(2n-PAA) (R2 = 0,9999), de l'ACNC(n/2-PAA) (R2 = 0,9999) et de l'ACNC(n/10-PAA) (R2 = 0,9845) sous 3,0 T. f 1/T1 en fonction de la courbe de concentration de Gd de l'ACNC(Gd/Ca=1:10) (R2 = 0,9993) et de l'ACNC(Gd/Ca=1:2) (R2 = 0,9996) sous 3,0 T. g 1/T1 en fonction de la courbe de concentration de Gd de l'ACNC sous 3,0 T (n = 3 échantillons indépendants). h 1/T1 en fonction de la courbe de concentration de Gd de l'ACNC sous 3,0 T (R2 = 0,9993) et 0,5 T (R2 = 0,9999). i Courbe de concentration 1/T2 versus Gd de l'ACNC sous 3,0 T (R2 = 0,9991) et 0,5 T (R2 = 0,9999). j Évolution des valeurs relatives de R1 de l'instant zéro à chaque instant (R1(t)/R1(0)) pour ACNC, Gd-DTPA et PAA-Ca/Gd (n = 3 expériences indépendantes). Les données montrent signifie ± SD.

Ici, nous évaluons davantage l'effet de la teneur en PAA sur la teneur en eau et la relaxivité. Nous avons désigné l'entrée de PAA pour le produit ACNC par 'n'. En utilisant les mêmes méthodes de synthèse, plusieurs produits avec des apports en PAA de '2n', 'n/2', 'n/10' (étiquetés ACNC(2n-PAA), ACNC(n/2-PAA), ACNC(n/10 -PAA)) ont été obtenus dans les mêmes conditions expérimentales. Nous avons constaté une augmentation significative de la teneur en eau de l'ensemble du système de produits avec l'ajout de PAA (Fig. 15 supplémentaire). Cependant, un effet de "montagnes russes" a également été détecté lorsque le rapport molaire des molécules d'eau par mole de Gd a atteint son maximum avec une taille d'entrée de "n", mais a diminué avec une taille d'entrée accrue telle que "2n" (Fig. 3d). De plus, nous avons mesuré les relaxivités de ces échantillons. Fait intéressant, ses performances étaient très cohérentes avec celles de la teneur en eau par Gd dans la mesure où la relaxivité de l'ACNC atteignait la plus élevée dans la condition de 'n', mais était réduite lorsque la quantité de PAA était '2n' et 'n/2' . Plus précisément, la relaxivité a diminué de manière significative lorsque la quantité de PAA n'était que de «10 / n» (Fig. 3d, e). Au vu des résultats, il était clair que le rapport molaire des molécules d'eau par mole de Gd agissait fortement sur les performances des produits. Ces comparaisons suggèrent que la relaxivité changeait avec la teneur en eau par Gd car elles partagent une voie de changement similaire.

Nous avons en outre conçu et fabriqué deux autres nanoclusters de carbonate amorphe avec des ratios variables de Gd ajoutés à des fins de comparaison. Dans la synthèse d'ACNC, mol[GdCl3]:mol[CaCl2] est égal à 1:5. Nous avons également préparé deux échantillons avec un rapport d'alimentation Gd/Ca initial de 1:10 et 1:2 (noté ACNC(Gd/Ca=1:10) et ACNC(Gd/Ca=1:2), respectivement). ACNC(Gd/Ca=1:10) et ACNC(Gd/Ca=1:2) étaient tous deux des phases amorphes, et aucun pic de cristallisation n'a pu être trouvé dans les schémas XRD des deux produits dispersés dans des solutions aqueuses pendant 3 mois (Figure supplémentaire 16). ACNC(Gd/Ca=1:10) a conservé une bonne performance MR avec une relaxivité élevée de 34,25 mM-1.s-1 lorsque la proportion de dopage Gd était faible. Cependant, lorsque le niveau d'incorporation de Gd était élevé, les valeurs de relaxivité longitudinale (r1) de l'ACNC (Gd / Ca = 1: 2) diminuaient remarquablement à 17, 21 mM −1 · s −1 (Fig. 3f). Une explication pourrait être que la quantité excessive de Gd peut potentiellement perturber l'environnement de type ACC hautement hydraté, qui à son tour a affecté la génération d'ACC à forte teneur en eau. En résumé, la quantité de dopage de Gd a affecté de manière significative la relaxivité de l'ACNC paramagnétique, ACNC s'est avéré être le meilleur produit en termes de performances de contraste.

Après trois tests, la valeur r1 de l'ACNC a été calculée comme étant d'environ 37,93 ± 0,63 mM−1 · s−1 (Fig. 3g). De plus, les valeurs r1 et r2 de l'ACNC ont été mesurées sous différents champs magnétiques (3, 0 T et 0, 5 T) et son rapport r2 / r1 correspondant a été calculé (Fig. 3h, i). La valeur r1 de l'ACNC mesurée sur 3,0 T était aussi élevée que 38,19 mM−1 · s−1, et la valeur r2 correspondante et le rapport r2/r1 étaient de 72,49 mM−1 · s−1 et 1,90, respectivement. En utilisant un système de scanner IRM à faible champ (0,5 T), les valeurs r1 et r2 correspondantes de l'ACNC étaient de 66,37 mM−1 · s−1 et 78,04 mM−1 · s−1, respectivement, et le rapport r2/r1 était de 1,18. Sur la base des résultats des mesures de l'AUC, la masse molaire de l'ACNC d'un diamètre de 1,5 nm était de 2230 g/mol. La densité de relaxivité de l'ACNC peut éventuellement être calculée à l'aide du volume et du poids moléculaire (21,46 mM-1 · s-1/nm3, 17,01 mM-1 · s-1/kDa, respectivement).

Une stabilité élevée est essentielle pour les agents de contraste à base de gadolinium, car la transmétallation entraînera la libération d'ions gadolinium dissociés avec une toxicité signalée telle qu'une fibrose systémique néphrogénique14,27. Laurent et Muller ont signalé la faible inertie cinétique vis-à-vis de la transmétallation pour les agents de contraste linéaires à base de gadolinium tels que le Gd-DTPA28 utilisé dans le commerce. Comme le montre la figure 3j, le chélate PAA-Ca / Gd présentait une inertie encore pire que le Gd-DTPA après exposition à Zn 2 + dans du PBS pendant 48 h. Au contraire, l'ACNC a manifestement amélioré la stabilité contre la transmétallation, en raison du confinement du gadolinium dans des environnements de type ACC. De plus, nous avons abordé un test de compétition de ligands en solution aqueuse homogène contenant du DTPA et de l'ACNC. Il n'y avait aucune preuve observable montrant que la relaxivité de l'ACNC était significativement altérée, ce qui confirmait que l'ACNC n'était pas affectée par la compétition entre le complexe Gd (III) et un ligand sans DTPA excessif (Fig. 17 supplémentaire).

Les spectres d'absorption d'Arsenazo III sont généralement utilisés pour détecter la fuite d'ions gadolinium à partir d'un nanocomposite à base de Gd et de chélates de gadolinium29,30. Lorsque la solution aqueuse d'Arsenazo III a été mélangée avec du Gd3+, la solution rose est devenue bleue en raison de la formation du complexe arsenazo-Gd3+ (Fig. 4a). Comme le montre la figure 4b, l'ion gadolinium libre à une faible concentration de 1 µg / ml était détectable par les spectres d'absorption médiés par Arsenazo III. Cependant, dans la dispersion saline normale d'ACNC, aucune fuite d'ions gadolinium libres lors d'une dialyse d'une semaine n'a été détectée à l'aide de cette analyse colorimétrique, qui a été confirmée par ICP-MS (Fig. 4c). Contrairement à l'ACNC, le chélate PAA-Ca/Gd a montré une fuite évidente par rapport à l'ACNC, confirmant davantage le confinement des ions gadolinium par le carbonate.

a Photos des mélanges de solution aqueuse d'Arsenazo III avec des solutions dialysées d'ACNC, de solution saline normale (NS, servant de contrôle négatif) et de solution aqueuse de chlorure de gadolinium à des concentrations variables (1, 10 et 100 µg Gd/mL) (servant de témoins positifs), respectivement. b Les spectres d'absorption des mélanges d'Arsenazo III-dialysat et des dialysats ont été collectés à différents moments sur 7 jours pour surveiller la fuite de gadolinium de l'ACNC. Aucune fuite détectable d'ion gadolinium n'a été surveillée par rapport aux témoins négatifs (NS) et positifs (solution aqueuse de chlorure de gadolinium). c Analyse quantitative et comparaison de la fuite d'ions gadolinium libres d'ACNC et de PAA-Ca/Gd dans NS au moyen d'ICP-AES. Le chélate PAA-Ca/Gd a montré une faible inertie dans NS, et environ 9 % de gadolinium s'est échappé du chélate après 7 jours. Au contraire, peu d'ions gadolinium libres ont été détectés dans les dialysats d'ACNC (n = 3 échantillons indépendants). Les données montrent signifie ± SD. d, e Spectres d'absorption du mélange d'Arsenazo III avec des solutions dialysées recueillies à différents moments à partir de d sérum humain avec ACNC dispersé et e sérum humain avec ACNC dispersé et additionné de phosphate supplémentaire. f Évaluation de la compatibilité sanguine de l'ACNC à différentes concentrations de gadolinium (n = 3 échantillons indépendants). Les données montrent signifie ± SD.

Il est bien connu que le pH joue un rôle clé dans l'homéostasie tissulaire et cellulaire. De plus, différents compartiments cellulaires présentent une variété de conditions acido-basiques. Nous avons utilisé des tampons PBS avec un pH de 6, 0 à 6, 8 pour imiter l'état faiblement acide de différents emplacements intracellulaires. Bien que la fuite d'ions Ca puisse être observée, la fuite d'ions Gd a été à peine détectée au bout de 7 jours (Fig. 18 supplémentaire). Nous supposons que le Gd(III) au sein de l'ACNC aura tendance à former du GdPO4 avec du phosphate dans le tampon PBS en raison du produit de solubilité thermodynamique (Ksp) du phosphate inférieur à celui du carbonate31. La précipitation des ions Gd3+ libres a été supprimée dans des conditions presque neutres (pH = 6), ce qui a empêché la fuite des ions Gd, indiquant la bonne biosécurité de l'ACNC dans des conditions d'acide faible. Sous un pH environnemental plus acide (pH 4, 5–5, 5) simulé par des tampons acétate, la libération d'ions Gd augmente légèrement avec la diminution du pH (Fig. 18 supplémentaire). Par rapport aux résultats dans l'environnement PBS, l'amélioration de la fuite des ions Gd a été attribuée à la perte de protection fournie par le phosphate. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que Gd (III) était difficile à fuir de l'ACNC et existe sous forme d'ions dans un environnement physiologique.

De plus, l'ACNC a été dispersée dans le sérum humain à 1 mmol (Gd)/L. Pendant ce temps, pour simuler les concentrations élevées de phosphate dans le sérum chez les patients atteints d'insuffisance rénale terminale33, la même concentration d'ACNC a été dispersée dans le sérum humain complétée par une concentration supplémentaire de phosphate de 10 mmol/L pendant 15 jours, suivie d'une dialyse à différents moments. . Aucune fuite d'ions gadolinium libres n'a été détectée dans les dialysats par ICP-MS et analyse colorimétrique (Fig. 4d, e et Fig. 19 supplémentaire), indiquant le faible risque de dissociation de l'ACNC pendant la période de rétention in vivo.

Pour déterminer si les ACNC provoquent une hémolyse, les ACNC à différentes concentrations ont été incubées avec du sérum sanguin humain à 37 ° C pour un test d'hémolyse. Selon la norme, les ACNC n'ont pas d'hémocylolyse même à une concentration élevée de 0,5 mg (Gd)/mL, suggérant une bonne compatibilité sanguine (Fig. 4f). Le test MTT a été utilisé comme évaluation de la cytotoxicité en co-cultivant des lignées de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HK-2) ou de kératinocytes immortels humains (HaCaT) avec ACNC pendant 24 h et 48 h. Une faible réduction de la viabilité des cellules a été induite après exposition à l'ACNC, même à une concentration élevée de 0, 5 mg (Gd) / ml (Fig. 20 supplémentaire). De plus, de bonnes cytocompatibilités de l'ACNC (Gd/Ca=1:10) et de l'ACNC(Gd/Ca=1:2) ont été validées (Fig. 21 supplémentaire). Encouragés par les résultats obtenus jusqu'à présent, une série d'études de compatibilité subcellulaire a été réalisée à l'aide de cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HK-2). Des mitochondries saines de cellules HK-2 ont été démontrées par une étude des potentiels de membrane mitochondriale (MMP) (Fig. 22 supplémentaire). Le test de coloration immunofluorescent dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) de HK-2 a montré que l'ACNC n'avait pas accumulé de dommages à l'ADN nucléaire des cellules (Fig. 23 supplémentaire). Un test EdU (5-Ethynyl-2′-désoxyuridine) a été effectué et a confirmé que l'ACNC n'avait aucun effet sur la prolifération cellulaire (Fig. 24 supplémentaire).

Pendant ce temps, des coupes histologiques des principaux organes ont été prélevées 2 semaines après l'injection intraveineuse chez la souris à une dose de 5 mg de Gd / kg, et aucune preuve de changement pathologique n'a été identifiée dans les images colorées H&E (Fig. 25 supplémentaire). La coloration H&E du rein de lapin a également été réalisée et aucune toxicité rénale aiguë n'a été observée (Fig. 26 supplémentaire). Trois jours et 3 semaines après l'injection intraveineuse d'ACNC chez la souris, toutes les valeurs des paramètres hématologiques et biochimiques étaient conformes à la plage standard et à nos groupes témoins (Fig. 27 supplémentaire). Pour tester plus avant chez le chien beagle de grande taille à une dose élevée (9 mg Gd / kg pc), il n'y avait pas de différence évidente de paramètres hématologiques et biochimiques entre les groupes témoins et expérimentaux après injection intraveineuse (Fig. 28 supplémentaire), ce qui suggère que physiologique les fonctions n'étaient pas altérées par l'ACNC.

L'amélioration des performances de l'IRM pondérée en T1 de l'ACNC a été confirmée par l'angiographie IRM chez le rat, le lapin et le chien beagle. Après l'injection intraveineuse d'un bolus d'ACNC à faible dose (3 mg/kg de poids corporel), la jugulaire, la carotide, l'aorte et la veine cave caudale peuvent être clairement identifiées (Fig. 5a–c), et la posologie est <1/5 de la valeur typiquement employée en clinique. Les images d'angiographie du corps entier du rat, du lapin et du haut du corps du chien beagle présentaient un meilleur contraste angiographique et plus de détails par rapport à celui du groupe témoin Gd-DTPA. Pendant ce temps, l'analyse semi-quantitative a clairement montré que les intensités de signal dans les groupes ACNC ont une amélioration remarquable par rapport à celles des groupes Gd-DTPA (Figs. 29, 30 supplémentaires). Comme le montre la figure 5d, l'amélioration du contraste de l'ACNC in vivo a été davantage reflétée quantitativement par la valeur moyenne du rapport signal-bruit (SNR) sur le lapin et le chien beagle, respectivement34.

a, b Images d'angiographie IRM à contraste amélioré (ARM) du corps entier sur un rat et un lapin b immédiatement après l'injection en bolus de (i) Gd-DTPA et (ii) ACNC. c Images ARM du haut du corps sur un chien beagle immédiatement (IM) et 20 s après l'injection en bolus de (i) Gd-DTPA et (ii) ACNC, respectivement. (C) et (S) représentent respectivement le plan coronal et le plan sagittal. d Mesure quantitative du SNR des ROI dans (i) l'artère tronc brachiocéphalique, (ii) l'artère sous-clavière gauche, (iii) l'artère carotide commune gauche, (iv) la branche droite de l'artère olfactive du chien beagle, et celle dans (v) l'aorte descendante , (vi) arc aortique, (vii) aorte ascendante de lapin, respectivement. Le temps de mesure quantitative du SNR des ROI était dans la période "IM" (n = 3 expériences indépendantes). Les données montrent signifie ± SD. P a été calculé à l'aide du test t de Student bilatéral (** P < 0,01, *** P < 0,001).

Récemment, la traduction clinique de biomatériaux nanométriques a attiré une grande attention, promettant le développement d'outils nanomédicaux nouveaux et spécifiques pour le diagnostic et la thérapie16,35,36,37,38. La majorité des nanomatériaux administrés sont séquestrés par le foie et la rate, qui deviennent ainsi les barrières biologiques majeures à la traduction des nanomédicaments39. Pour éviter le risque potentiel in vivo, la clairance rénale est la voie d'excrétion souhaitable et préférée pour les agents médicaux pour un catabolisme et une exposition corporelle minimaux. Cependant, par rapport aux petits agents de contraste moléculaires, les agents de contraste MR nanométriques, en particulier les injections d'oxyde de fer nanométrique approuvées par la FDA, souffrent de leur mauvaise excrétion rénale en raison de leur grande distribution de taille (> 20 nm)40. Le foie est la cible primaire ou secondaire de transmission des nanoparticules ayant accès au système circulatoire, entraînant une accumulation inévitable de nanoparticules dans le foie. Les nanoparticules retenues dans le foie pourraient être éliminées du foie par clairance hépatobiliaire41. Outre l'élimination conventionnelle du foie (Fig. 31 supplémentaire), la clairance rénale rapide de l'ACNC des vaisseaux sanguins a été observée dans les images ARM après injection intraveineuse (Fig. 32 supplémentaire). De plus, la vessie du chien beagle a également été éclaircie en 20 minutes sur l'image T1w (Fig. 33 supplémentaire). De plus, comme le montre la courbe concentration sanguine-temps chez la souris et le chien beagle mesurée par ICP-AES, il pourrait être efficacement éliminé des vaisseaux sanguins en 6 h et il y a rarement une teneur résiduelle en gadolinium après 24 h (Fig. 6a , b et tableau supplémentaire 6). Dans l'urine de rat collectée après l'injection intraveineuse d'ACNC, la teneur en gadolinium a été détectée par ICP-AES et a démontré une efficacité de clairance rénale d'environ 13% ID à 24 h (Fig. 34 supplémentaire), comparable à celle de l'or nanoclusters de diamètres similaires42. Des agrégats amorphes SAED abondants ont pu être observés dans les images TEM d'urine dialysée (Fig. 6c), et la cartographie EDS a révélé une distribution correspondante des éléments de gadolinium, de calcium, de carbone et d'oxyde dans ces agrégats correspondant à l'ACNC (Fig. 6d, e) . La stabilité physicochimique et physiologique en synergie avec une faible dose d'injection et une clairance partielle par le rein a conduit à une biocompatibilité in vivo et à une capacité de traduction potentielle de ces amas de carbonate amorphe à base de gadolinium.

a, b La distribution en fonction du temps de l'ACNC dans le plasma de souris a et de chiens beagle b en 24 h (n = 5 animaux biologiquement indépendants). Les données montrent signifie ± SD. c TEM, d Résultats EDS et e Image HAADF-STEM et cartographie EDS de l'ACNC observée dans l'urine de rat recueillie 12 h après l'injection. Une image représentative de trois expériences individuelles est montrée. L'encart de c est le modèle SAED relatif. Les expériences ont été répétées trois fois indépendamment.

Un certain nombre d'agents de contraste à base de gadolinium ont été conçus et approuvés dans le monde entier pour l'imagerie IRM T114. En raison d'une densité élevée d'électrons libres dans la bande de valence et d'une fonctionnalisation polyvalente pour interagir avec des biomolécules in vivo, les nanomatériaux inorganiques servant d'agents de contraste dans diverses modalités d'imagerie devraient permettre la traduction clinique de la nanomédecine15,43. Par conséquent, les scientifiques ont étudié sans relâche l'inclusion de diverses méthodes de fabrication et la pharmacocinétique de compensation afin d'étudier la traduisibilité des nanoparticules inorganiques à base de Gd16. Compte tenu du danger provenant de la libération d'ions Gd libres, un objectif spécifique était de réduire la dose de nanoparticules injectées via l'amélioration des performances.

Le niveau d'hydratation joue un rôle important dans la détermination des performances de contraste d'un agent de contraste MR14. Malheureusement, la teneur en hydratation des nanocristaux à base de Gd est limitée par les procédés traditionnels de synthèse à haute température15. Il convient de mentionner que la teneur élevée en humidité, y compris l'eau intérieure et l'eau structurelle profondément localisée, est la caractéristique la plus distinctive de l'ACC7,8,9,10,11. Cependant, l'application potentielle d'ACC hydraté instable est largement ignorée. Fait intéressant, le rayon ionique de l'ion gadolinium est très proche de celui de l'ion calcium, ce qui implique une interaction possible entre les ions gadolinium et les ions calcium que nous pouvons exploiter.

En résumé, notre étude confirme les effets mutuels entre l'ion gadolinium de lanthanide paramagnétique et le carbonate de calcium amorphe, ce qui est bénéfique pour maximiser la teneur en eau dans les nanoclusters composites amorphes obtenus. Le matériau est synthétisé par un processus simple en un seul pot à température ambiante, permettant une production à grande échelle et rentable. Il est important de noter que cette teneur élevée en eau contribue à l'amélioration contrastée transparente de l'IRM des nanoclusters à base de gadolinium. En combinaison avec leur faible toxicité, leur clairance rénale partielle et leur potentiel facile de production de masse, nos travaux permettent une identification plus approfondie du potentiel biomédical des composites ACC, et nous prévoyons qu'ils pourraient conduire à une prochaine génération d'agents de diagnostic plus efficaces sur la base de nanoclusters amorphes dans le futur.

Le chlorure de calcium anhydre, le carbonate de sodium anhydre et l'alcool éthylique ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai). Le chlorure de gadolinium hexahydraté (GdCl3·6H2O, 99,95 %) a été acheté auprès de Yutai QingDa Fine Chemical Co., Ltd. (Shandong, Chine). Le poly(acide acrylique) (PAA, Mw ≈ 1800) a été acheté chez Aldrich. Tous les réactifs ont été utilisés tels que reçus sans autre purification. Le Gd-DTPA utilisé dans le commerce a été produit par Guangdong Consun Pharmaceutical Group, Chine (spécification : 20 mL).

Dans une procédure typique pour synthétiser du carbonate de calcium amorphe sans additif (ACC), 10 ml de solution aqueuse de Na2CO3 (0,1 mol·L-1, 10 ml) ont été versés dans des solutions aqueuses de chlorure de calcium (0,1 mol·L-1, 10 ml) sous agitation magnétique vigoureuse pendant 15 s. La suspension aqueuse après addition de 20 mL d'éthanol a été centrifugée à 850 × g pendant 2 min immédiatement, puis les précipités ont été lavés par de l'éthanol, centrifugés pendant 5 min à 5000 × g deux fois.

Dans une procédure typique pour synthétiser l'ACNC, du chlorure de calcium anhydre (CaCl2, 0,1 mol·L−1), du chlorure de gadolinium hexahydraté (GdCl3, 0,02 mol·L−1) et du PAA (0,45 g) ont été dissous dans 10 ml de DIW avec une solution magnétique. agitation. Du carbonate de sodium anhydre (Na2CO3, 0,1 mol·L-1, 10 mL) a été versé dans la solution ci-dessus sous agitation magnétique vigoureuse pendant 1 min. 20 ml d'éthanol ont été ajoutés pour terminer la réaction. Le mélange a été immédiatement centrifugé pendant 2 min à 850 × g, et les précipités ont été remis en suspension par DIW, centrifugés pendant 5 min à 5000 × g deux fois. Pour la synthèse à l'échelle du litre, le volume de réaction a été multiplié par 50 et s'est déroulé sous une agitation mécanique robuste.

Pour la synthèse d'ACC stabilisé par du PAA (ACC-PAA), 0,45 g de PAA ont été utilisés dans le processus de synthèse sans addition de sel de gadolinium, et le produit a été lavé à l'éthanol. Pour la préparation de l'ACC-Gd, le PAA était absent du processus de synthèse et du CaCl2 anhydre (0,1 mol·L-1) et du GdCl3 (0,02 mol·L-1) ont été mélangés dans 10 ml de DIW. Ensuite, l'ACC-Gd obtenu a été lavé avec de l'éthanol.

Dans une procédure typique pour synthétiser du carbonate de gadolinium amorphe (AGC) et de l'AGC-PAA, du Na2CO3 (0,1 mol·L−1, 10 mL) a été versé dans 10 mL de solution aqueuse de GdCl3 (0,067 mol·L−1, mol[GdCl3] : mol[Na2CO3] = 2:3) sous agitation magnétique vigoureuse pendant 15 s, puis 20 ml d'éthanol ont été versés dans la suspension aqueuse. Après avoir centrifugé à 850 × g pendant 2 min immédiatement, les précipités ont été lavés par de l'éthanol, centrifugés pendant 5 min à 5000 × g deux fois. De plus, en présence de 0,45 g de PAA dans la solution aqueuse de GdCl3, l'AGC-PAA a été préparé selon la même procédure.

Des microscopies électroniques à transmission (MET) ont été réalisées sur H7700 (Hitachi, Japon) avec une tension d'accélération de 100 KV. La microscopie électronique à cryotransmission (cryo-TEM) a été réalisée sur la cryo-microscopie électronique à transmission Tecnai F20. Un balayage TEM annulaire à champ sombre à angle élevé (HAADF-STEM), un spectromètre à dispersion d'énergie (EDS) et une cartographie EDS ont été réalisés sur un microscope électronique à transmission à haute résolution à émission de champ (FEI, Talos F200X). Les diagrammes de diffraction des rayons X sur poudre (XRD) ont été réalisés sur un diffractomètre à rayons X à anode tournante (SmartLabTM 9 kW). La spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) a été réalisée sur un spectromètre photoélectronique (ESCALAB, 250Xi, Thermo Fisher, USA). La résonance magnétique nucléaire (RMN) du 13C a été réalisée sur un spectromètre de résonance magnétique nucléaire à semi-conducteurs WB de 400 MHz (Bruker AVANCE III 400 WB). Les spectres FT-IR ont été enregistrés avec un spectromètre Thermo Nicolet 8700 FT-IR à température ambiante. Les spectres Raman ont été enregistrés à l'aide d'un spectromètre Raman Evolution haute résolution (HR) Horiba LabRAM. La source lumineuse du microscope a été transférée à un laser à diode (780 nm). Les spectres ont été scannés pour 3 × 100 s44,45. L'analyse thermogravimétrique (TGA), le calorimètre différentiel à balayage (DSC) et l'analyse thermogravimétrique couplée à la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (TG-FTIR) ont été enregistrées à une vitesse de chauffage de 10 K min−1 sous flux d'azote sur un analyseur thermique TGA (NETZSCH STA 449F3). L'investigation magnétique a été effectuée sur un magnétomètre à dispositif d'interface quantique supraconducteur (SQUID) (Quantum Design SQUID-VSM). Les ICP-AES ont été réalisées sur un instrument Optima 7300 DV. Les spectres UV-vis ont été mesurés sur un spectrophotomètre Shimadzu UV-2600 à température ambiante.

Une analyse de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) a été réalisée sur un SAXSpoint 2.0 (Anton Paar). La fonction de distribution de taille telle que déterminée par SAXS a été évaluée à l'aide du logiciel GIFT (transformation indirecte généralisée de Fourier) avec condition préalable de sphères homogènes pondérées par le nombre. Il est calculé selon les formules suivantes46 :

Des mesures de spectroscopie d'absorption des rayons X (XAS) à la limite K du calcium (4,0381 keV) ont été effectuées au synchrotron Elettra Italie, fonctionnant à une énergie de 2 GeV et un courant de 300 mA. Les échantillons ont été broyés dans un mortier d'agate, dilués avec de la poudre de graphène et compactés en fines pastilles. Une épaisseur d'échantillon optimale d'environ 300 μm et une concentration optimale de calcium après une dilution optimale avec de la poudre de graphène ont été préparées pour chaque échantillon, y compris les normes ACNC, ACC-Gd et ACC. Trois balayages complets par échantillon de la structure d'absorption des rayons X près du bord (XANES) et de la structure fine d'absorption des rayons X étendue (EXAFS) ont été collectés en mode transmission à l'aide d'un détecteur de chambre d'ions FMB-OXFORD, par pas de 5 eV dans le pré -région de bord (de 3738,43 à 4028,53 eV) et 0,2 eV dans la région de bord (de 4061,51 à 4061,71 eV), augmentant progressivement à 2,6 eV dans la région post-bord (de 4061,71 à 4589,30 eV) jusqu'à k = 13. Alignement, l'étalonnage de l'énergie et le déglitching ont été effectués à l'aide des fonctionnalités intégrées du progiciel Athena47. La première couche de coordination autour du calcium (Ca–O) a été ajustée en générant une seule voie de diffusion de Ca–O basée sur les données cristallographiques de la calcite. L'analyse des voies de diffusion simples a été entreprise de 1,3 à 2,53 Å dans l'espace R sur des données pondérées k2 transformées de Fourier de 3 à 9,1 Å. Les erreurs standards associées à l'ajustement des données EXAFS sur la gamme k utilisée ici sont de 15 % pour le numéro de coordination de la première coque, de 0,03 Å pour la distance radiale et de 15 % pour les facteurs Debye-Waller.

Les points de données indépendants ont été déterminés par la règle de Stern définissant la limitation fondamentale de la quantité d'informations pouvant être déterminées par XAFS. Selon la règle de Stern, le nombre de paramètres (Npar) utilisés pour l'ajustement doit être strictement inférieur au nombre de paramètres indépendants (Nind) défini comme 2∆k∆R/π + 2, où ∆k et ∆R sont les valeurs ajustées gamme dans l'espace k et R, respectivement48,49. Si Nind < Npar, le modèle ne peut pas être considéré comme une preuve de l'environnement de coordination car l'ensemble de données est sous-déterminé par le niveau de complexité du modèle. Dans ce cas, Nind = 7,5 pour la norme ACC, ACC-Gd et l'échantillon ACNC, Nind = 8,16 pour ACC-PAA et Npar = 4 en tant que tel que Nind > Npar. Le modèle multi-composants donnant le meilleur ajustement des données expérimentales est considéré comme raisonnable et peut donc être considéré comme une représentation probable pour caractériser l'environnement de coordination du calcium. La combinaison linéaire a été réalisée sur la région XANES et quasi-EXAFS (de 30 Å−1 avant à 80 Å−1 après saut de bord). Les échantillons ACC-Gd, ACNC et PAA-Gd/Ca ont été comparés aux échantillons standards ACC-PAA et PAA-Ca.

Les mesures de l'ASC ont été effectuées sur un Optima XL-A modifié (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, États-Unis) en utilisant une optique d'absorbance et une optique d'interférence Rayleigh avancée développée par Nanolytics (https://www.nanolytics-instruments.de/ interférence_optique_aida). Des pièces maîtresses en titane à double secteur de 12 mm de longueur avec des fenêtres en saphir (Nanolytics, Potsdam, Allemagne) ont été utilisées pour toutes les expériences. Pour la mesure de l'échantillon ACNC, l'échantillon ACNC d'origine a été pré-sédimenté sur une centrifugeuse UNIVERSAL 320 Hettich (Hettich, Tuttlingen, Allemagne) pendant 20 min à 9 000 tr/min, correspondant à une force centrifuge à 6 000 × g. 360 µL de solution d'ACNC prétraitée ont été utilisés dans le secteur de l'échantillon et 360 µL d'une solution de pré-réaction PAA-Ca/Gd diluée à 1:175 (avec 0,154 M de NaCl) (mélange aqueux comprenant du PAA, du chlorure de calcium et du chlorure de gadolinium) dans le secteur de référence. Pour la mesure de l'échantillon de PAA comme référence, 10 mg de PAA (1800 Da) ont été dissous dans 1 mL de solution de NaCl 0,154 M. Tous les échantillons ont été étudiés à 20 °C et 60 000 tr/min, correspondant à une force centrifuge jusqu'à 290 000 × g.

Les données de vitesse de sédimentation ont été évaluées avec Sedfit et UltraScanIII. Dans Sedfit (Schuck, PP SEDFIT version 16.1c. http://analyticalultracentrifugation.com/download.htm), les modèles ls-g*(s) et continu c(s,ff0) ont été utilisés. Pour le calcul des distributions des coefficients de sédimentation g(s) avec le modèle des moindres carrés g*(s)50, les données ont été ajustées avec une régularisation de Tikhonov-Phillips en utilisant un niveau de confiance (F-ratio) de 0,683 et une résolution de 100 grille points. Pour la détermination de la densité des particules de sédimentation51 avec l'analyse c(s,ff0)52, les données ont été ajustées avec une régularisation d'entropie maximale en utilisant un niveau de confiance (rapport F) de 0,683 et une résolution de 100 points de grille en s et 10–20 grille points en f/f0. Les distributions 2D c(s,ff0) ont été tracées à l'aide du logiciel MATLAB version R2017b, 64 bits de MathWorks. Pour le calcul de la densité d'échantillon à partir de distributions 2D, un script de masque MATLAB développé par Quy Khac Ong a été utilisé (Institut des matériaux, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Station 12, 1015 Lausanne, Suisse. E-mail : quy.ong @epfl.ch). Pour la caractérisation de l'anisotropie, UltraScanIII (Demeler, B. UltraScan version 4.0, release 2783. A Comprehensive Data Analysis Software Package for Analytical Ultracentrifugation Experiments. The University of Lethbridge, Department of Chemistry and Biochemistry. http://www.ultrascan3.aucsolutions. com/download.php) a été utilisé pour effectuer l'analyse spectrale bidimensionnelle (2DSA)53. Les analyses 2DSA-Monte Carlo (MC) ont été réalisées avec 50 itérations sur un supercalculateur.

La fonction définissant la forme, la flexibilité et le degré de solvatation (par l'eau, les ions de sel et toute autre molécule de solvant) de la macromolécule est la fonction de friction translationnelle de Perrin, P (voir l'équation suivante). Ce degré d'association de l'eau est appelé l'hydratation du soluté, δ, et est défini comme la masse en grammes de solvant associé par gramme de soluté anhydre54.

où f/f0 est le rapport de frottement (qui est le rapport sans dimension du coefficient de frottement translationnel observé f à celui d'une molécule sphérique équivalente de même masse anhydre et densité f0), \(\bar{v}\) est le partiel volume spécifique (cm3/g) du soluté et \({\bar{v}}_{s}\) est le volume spécifique hydraté (le volume occupé par le soluté et le solvant associé par unité de masse du soluté anhydre) et \({\bar{v}}_{{{{{\rm{H2O}}}}}}}\) = volume spécifique d'eau donné comme :

Si tout excès de frottement est dû à l'hydratation et que le soluté est une sphère, alors P vaut 155 et l'hydratation peut être calculée comme suit :

Les moles de molécules d'eau par mole de CaCO3 ont ainsi été calculées en fonction du résultat de la spectroscopie d'émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES), de l'analyse TG et de la mesure volumétrique du titrage Karl Fischer. La mesure de titrage a été effectuée sur un titrateur d'humidité Karl Fischer (V10S, titrateur volumétrique KF, Mettler Toledo). La teneur en hydrate a été attribuée à la perte de poids à partir du pic endothermique jusqu'à 300 °C, tandis que la teneur en ions Ca2+ et Gd3+ a été déterminée par ICP-AES. Le rapport molaire entre l'eau et les ions Ca2+ dans l'ACC peut ainsi être calculé selon les rapports précédents20,56,57.

La détection des fuites d'ion gadolinium a été réalisée selon une méthode rapportée précédemment29,30. Les ACNC ont été dispersés dans une série d'environnements physiologiques simulatifs comprenant une solution saline normale, du sérum humain et du sérum humain additionné d'une concentration supplémentaire de phosphate de 10 mmol/L. L'ACNC a été dispersé avec une concentration finale de 1 mmol (Gd)/L. La dialyse de l'ACNC a été réalisée à 37 ° C pendant 7 jours à l'aide d'un sac de dialyse (MWCO 1000 Da). La concentration de gadolinium dans les dialysats collectés à différents moments a été mesurée à la fois par le test chromogénique médié par Arsenazo III et l'ICP-AES. Dans le test chromogénique, les dialysats collectés ont été mélangés avec de l'Arsenazo III (0,05 mM) dissous dans une solution tampon d'acide chloroacétique-hydroxyde de sodium (pH 2,8) et l'absorption à 658 nm a été détectée. Une solution saline normale et une solution de GdCl3 ont été utilisées comme contrôles négatifs et positifs, respectivement.

Les échantillons ACNC, Gd-DTPA et PAA-Ca/Gd ont été fraîchement préparés. A t = 0, chaque échantillon (Gd 2,5 mM) et une solution aqueuse de ZnCl2 (250 mM, 20 μL) ont été mélangés dans un tampon phosphate de 2 mL. Ensuite, 1 ml de solution mixte a été contenu dans une bouteille chromatographique pour la mesure. Les mesures ont été effectuées à 37 °C sous un système d'analyse et d'imagerie RMN 0,5 T NMI20-Analyst. TR/TE = 100/5,6 ms. Les temps de relaxation longitudinale ont été mesurés à différents moments dans le temps28. Le taux de relaxation à t = 0 (noté R1(0)) a été calculé par la formule R1 = (1/T1). Les taux de relaxation à d'autres moments ont tous été respectivement calculés et enregistrés comme R1(t) correspondant, dans le but d'évaluer la transmétallation de 2 jours en surveillant le rapport R1(t)/R1(0).

1 ml de solution aqueuse d'ACNC (5 mM Gd) a été ajouté dans 1 ml de solution de DTPA (5 mM) et la solution homogène a été prise pour la mesure. Par rapport au Gd-DTPA commercial, la concentration des solutions de Gd-DTPA était identique à celle des solutions d'ACNC à 5 mM de Gd. Les mesures et les calculs étaient cohérents avec l'étude de transmétallation.

1 mL de solution aqueuse d'ACNC (1 mg (Gd)/mL) a été introduit dans des sacs de dialyse (MWCO : 1000 KD). Les sacs ont ensuite été placés dans 50 mL de tampons PBS ou acétate avec différents pH et incubés sous agitation à 50 tr/min à 37 °C. Nous avons collecté toutes les solutions PBS ou acétate environnantes à chaque intervalle de temps pour analyse, puis les avons remplacées par des tampons PBS ou acétate frais de 50 mL. Afin d'éviter d'éventuelles interférences que les ions métalliques libres générés par la dégradation précipitent avec les ions phosphate dans le tampon PBS, 1 mL d'acide chloroazotique fraîchement préparé (HNO3/HCl = 3:1) a été ajouté à la solution environnante de PBS ou d'acétate recueillie. , conduisant à un environnement fortement acide (pH < 3,0) de la solution mixte. En fin de compte, les concentrations d'ions Gd dans les solutions environnantes ont été déterminées par ICP-AES.

Des cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HK-2) et des lignées cellulaires de kératinocytes immortels humains (HaCaT) ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco. La viabilité cellulaire a été réalisée par la méthode MTT standard. En bref, les cellules ont été étalées à une densité d'environ 1 × 104 cellules par puits dans une plaque à 96 puits et incubées pendant 12 h. Ensuite, du milieu de culture DMEM avec ACNC a été ajouté et les cellules ont été exposées à ACNC à différentes concentrations pendant 24 h et 48 h. Ensuite, 10 μL de solution MTT (5 mg/mL dans du PBS) ont été ajoutés à chaque puits pour une incubation supplémentaire de 4 h à 37 °C. Après avoir retiré le milieu, 150 μL de DMSO ont été ajoutés pour dissoudre les cristaux de formazan formés dans chaque puits, et la densité optique de la solution a été mesurée à 570 nm à l'aide de Microplate Reader (BioTek Instruments, USA). La cellule HK-2 a été utilisée pour le test des potentiels de membrane mitochondriale (MMP), le test dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) médié par TdT et le test 5-Ethynyl-2′-désoxyuridine (EdU). Kit d'analyse du potentiel de membrane mitochondriale avec agrégats J (JC-1) (Beyotime, Shanghai, Chine), kit d'analyse d'apoptose TUNEL en une étape (Beyotime, Shanghai, Chine) et kit de prolifération cellulaire EdU avec Alexa Fluor 555 (Beyotime, Shanghai , Chine) ont été employés.

Le sang pour l'expérience a été prélevé professionnellement sur des volontaires par des professionnels de la santé du service de transfusion sanguine du premier hôpital affilié à l'université médicale d'Anhui. Les études sanguines ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le comité d'éthique de l'Université des sciences et technologies de Chine et de l'Université médicale d'Anhui (numéro de licence : 20170267, 20170268).

Des souris BALB/c exemptes d'agents pathogènes spécifiques (SPF) (mâles, 6 semaines), des lapins néo-zélandais (mâles, 2 kg) et des chiens Beagle (mâles, 6 kg) ont été achetés à l'Université médicale d'Anhui. Les études animales ont été réalisées conformément aux recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health. Les études de compatibilité in vivo et les études IRM in vivo étaient conformes aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université médicale d'Anhui (LLSC20170299, LLSC20170300) et le premier hôpital affilié de l'Université des sciences et technologies de Chine (2021- N(A)-041).

Des solutions salines normales d'ACNC ont été injectées par voie intraveineuse à des souris (via la veine de la queue) à une dose de 5 mg de Gd/kg de poids corporel et à des chiens Beagle (via la veine des membres postérieurs) à une dose de 9 mg de Gd/kg de poids corporel. Pour l'évaluation de l'indice sanguin et de l'indice biochimique, les souris ont été sacrifiées par des anesthésiques pendant 3 jours et 3 semaines après l'injection intraveineuse, respectivement. Du sang de chiens Beagle a été prélevé toutes les deux semaines via la veine des membres postérieurs. Des échantillons de sang ont été prélevés par les tubes de prélèvement sanguin anticoagulant et les tubes de gel séparateur. L'examen de l'indice sanguin et de l'indice biochimique a été effectué sur Sysmex XE2100 et Vitros 5600, respectivement.

Des solutions salines normales d'ACNC ont été injectées par voie intraveineuse à vingt souris (mâles, 20 g) à 3 mg Gd/kg de poids corporel (0,5 mg Gd/mL, 120 µL) par injection manuelle rapide pour une étude d'injection bolus simulée. Ces souris ont été réparties au hasard en quatre groupes et divers organes ont été réséqués des souris dans chaque groupe 1, 7, 15 et 30 jours après l'injection intraveineuse, respectivement. Les échantillons d'urine ont été prélevés 12 h après l'injection iv d'ACNC chez le rat à 5 mg de Gd/kg de poids corporel, suivie d'une dialyse à 25 °C. Après 24 h, les dialysats dans des sacs de dialyse (MWCO = 1000 Da) ont été collectés pour une caractérisation plus poussée.

L'ACNC et le Gd-DTPA dispersés dans une solution saline normale à des concentrations de gradient dans des microtubes de 5 ml ont été placés sur un support immergé dans une solution de NiSO4. Les concentrations de gadolinium ont été mesurées par ICP-AES. La carte MR T1 a été acquise à l'aide d'une séquence de récupération d'inversion sur un scanner 3,0 Tesla MR (Trio Tim, Siemens) équipé d'une bobine de tête. Les paramètres d'imagerie étaient les suivants : temps de répétition (TR) = 4000 ms, temps d'écho (TE) = 14 ms, temps d'inversion (TI) de 25 à 3500 ms (TI inclus 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 , 300, 350, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 ms), champ de vision (FOV) = 220 × 144 mm2. La relaxivité longitudinale (r1) a été calculée comme suit selon une équation rapportée précédemment avec un gradient de concentration de 0,05 à 0,4 mM d'ion gadolinium. L'inverse du temps de relaxation (1/T1, s−1) a été tracé en fonction de la concentration de gadolinium, et la pente du tracé était la relaxivité de l'agent (mM−1 · s−1)58,59. Les mesures sur un système de scanner MR à faible champ ont été effectuées à l'aide d'un instrument 0,5 T LF-NMR à 32 ° C fourni par Suzhou Niumag Analytical Instrument Corporation.

Après anesthésie intraveineuse complète, les animaux ont été fixés sur différents supports de taille adaptée. Ensuite, des ACNC dispersés dans une solution saline normale ou du Gd-DTPA dilué par une solution saline normale ont été injectés par voie intraveineuse. Le rat a reçu une injection de la veine caudale à l'aide d'une aiguille à demeure à une dose de 2,5 mg de Gd/kg. Des injections bolus chez le lapin et le chien beagle ont été réalisées à une dose de 3 mg Gd/kg à partir des veines des membres antérieurs par un injecteur mécanique à haute pression (Optistar LE, Mallinckrodt, USA). La séquence FLASH 3D a été utilisée pour collecter les données angiographiques. Les paramètres détaillés de l'angiographie RM du rat étaient les suivants : Une bobine de genou a été utilisée. TR = 3,95 ms, TE = 1,9 ms, FOV : 210 × 280 mm2. Le temps d'acquisition (TA) était de 24,62 s. L'angle de retournement (FA) était de 20. La matrice d'acquisition était de 288p * 512. Le nombre d'acquisitions et le nombre de moyennes étaient tous deux de 1. Les paramètres détaillés de l'angiographie IRM du lapin étaient les suivants : une bobine locale tête et cou a été utilisée. TR = 3,6 ms, TE = 1,65 ms, FOV : 210 × 280 mm2. Le temps d'acquisition (TA) était de 23,4 s. L'angle de retournement (FA) était de 18. La matrice d'acquisition était de 288p * 512. Le nombre d'acquisitions et le nombre de moyennes étaient tous deux de 1. Les paramètres détaillés de l'angiographie IRM du chien beagle étaient les suivants : une bobine locale de la tête et du cou, une bobine de la colonne vertébrale et une radiofréquence bobine de transmission du corps ont été utilisés. TR = 3,19 ms, TE = 1,28 ms, FOV : 240 × 320 mm2. Le temps d'acquisition (TA) était de 20,74 s. L'angle de retournement (FA) était de 16. La matrice d'acquisition était de 288p * 512. Le nombre d'acquisition et le nombre de moyennes étaient tous deux de 1. Les images ont d'abord été traitées par la station de travail Siemens Syngo MR.

Le rapport signal-bruit (SNR) a été calculé dans une seule image (κ) basée sur deux régions d'intérêt (ROI) distinctes. Un dans le vaisseau d'intérêt (ROIvessel) a été mesuré en plaçant un signal au même ROI dans la même tranche à la fois dans le groupe Gd-DTPA et ACNC, qui a été enregistré comme les intensités moyennes du signal du vaisseau (Svessel). L'un dans le fond de l'image (ROIbackground) était situé dans une zone homogène sans artéfact, qui a été définie comme le signal de fond (Sbackground)34. Le SNR correspond au rapport entre Svessel et Sbackground a été calculé à l'aide de l'Eq. (5):

Trois ROI ont été sélectionnées dans l'aorte descendante, l'arc aortique et l'aorte ascendante chez le lapin, et quatre régions dans l'artère tronc brachiocéphalique, l'artère sous-clavière gauche, l'artère carotide commune gauche et la branche droite de l'artère olfactive ont été mesurées chez le chien beagle, respectivement.

Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± SD. Le test t de Student bilatéral a été utilisé pour l'analyse statistique de la comparaison entre deux groupes, et l'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour l'analyse statistique de la comparaison entre plusieurs groupes. Une valeur de P < 0,05 était considérée comme une différence statistique (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001). La signification statistique a été déterminée à l'aide des statistiques SPSS 17.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que les données générées dans cette étude sont fournies dans l'article et les informations supplémentaires, ou disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Subventions 51732011 et U1932213 à SHY ; 22122502 et 51972090 à YL ; 51702309 à LD ; 81801831 à HQW), le National Key Research and Development Program of China (Subventions 2021YFA0715700 et 2018Y FE0202201) à SHY, les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (WK9110000062 à YJX ; WK2060190056 à LD), le programme d'innovation de synergie universitaire de la province d'Anhui (subvention GXXT-2019-028) à SHY, projet majeur de science et technologie de la province d'Anhui (201903a05020003 ) à SHY, la Fondation des sciences naturelles de la province d'Anhui (2008085J06 à YL ; 1708085ME114 à YJX), la Fondation des sciences postdoctorales de Chine (2015M570540) à LD, le programme majeur/innovant de la Fondation de développement du Centre Hefei pour les sciences physiques et la technologie (2016FXZY005 ) à YL Les auteurs tiennent à remercier Mei Sun, Yan-Wei Ding, Cheng-Min Wang, Yu-Song Wang, Guan-Yin Gao, Han-Bao Chong, Yu-Feng Meng, Yang-Yi Liu de l'Université des sciences et technologie de Chine, Hao Ding à Suzhou Niumag Analytical Instrument Corporation, Yong-Hong Song, Wen-Shu Wu à l'Université de technologie de Hefei, Hai-Shen Qian à l'Université médicale d'Anhui, He Chen, Li Zhang et Hui Wang à The First Affiliated Hôpital de l'Université médicale d'Anhui, Kun Liu de l'Université de Xiamen, Duo An de l'Université Cornell et Ye-Ping Li d'Anton Paar Chine pour l'aide utile de ce manuscrit, et Luca Olivi, Giuliana Aquilanti et Simone Pollastri dans la ligne de lumière XAFS à Elettra Synchrotron pour leur aide. DG est professeur à la Leibniz Universität Hannover. JA est financé dans le cadre du SFB 1214 (Centre de Recherche Collaborative financé par la Fondation Allemande pour la Recherche, DFG, projet A02). HC remercie le centre d'analyse des particules de la SFB 1214 pour l'équipement AUC.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Liang Dong, Yun-Jun Xu, Cong Sui.

Département de chimie, Institut des matériaux biomimétiques et de la chimie, Laboratoire d'ingénierie des matériaux biomimétiques d'Anhui, Division des nanomatériaux et de la chimie, Centre national de recherche Hefei pour les sciences physiques à l'échelle microscopique, Institut de l'énergie, Centre scientifique national complet Hefei, Université des sciences et de la technologie de Chine, Hefei, 230026, Chine

Liang Dong, Cong Sui, Yang Zhao, Li-Bo Mao, Huai-Ling Gao, Zhao Pan et Shu-Hong Yu

The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital), Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences, Hangzhou, Zhejiang, 310022, Chine

Liang Dong et Zhao Pan

Anhui Province Key Laboratory of Advanced Catalytic Materials and Reaction Engineering, School of Chemistry and Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, 230009, Chine

Liang Dong, Ya-Dong Wu, Xu Yan, Fei Li et Yang Lu

Département de radiologie, Hôpital provincial d'Anhui, Premier hôpital affilié à l'Université des sciences et technologies de Chine, Hefei, 230001, Chine

Yun-Jun Xu

Institut de chimie inorganique, Leibniz Universität Hannover, Callinstr. 9, 30167, Hanovre, Allemagne

Denis Gebauer

Chimie physique, Département de chimie, Université de Constance, Universitätsstr. 10, Constance, D-78457, Allemagne

Rose Rosenberg et Helmut Cölfen

Scientifique - Center for X-ray Analytics, Empa - Laboratoire fédéral suisse pour la science et la technologie des matériaux, Lerchenfeldstrasse 5, 9014, Saint-Gall, Suisse

Jonathan Avaro

Département de transfusion sanguine, Premier hôpital affilié à l'Université médicale d'Anhui, Hefei, 230022, Chine

Hui Qin Wen

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SHY et YL ont conçu l'idée, conçu les expériences et supervisé la recherche, LD, CS, YL, YZ, LBM, DG, HC, RR, YDW et FL ont réalisé l'expérience synthétique et l'analyse. DG, JA, HC et LD ont travaillé sur la mesure et l'analyse EXAFS. LD, YZ, HLG, ZP, HQW, XY et FL ont traité l'évaluation biocompatible. LD, YJX, YDW, YL, HLG, ZP, XY, FL et CS ont travaillé sur les expériences animales, LD, YJX, YL, FL et CS ont étudié les performances de l'IRM, LD, YJX, CS, DG, YL, HC , et SHY a rédigé l'article, tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit.

Correspondance avec Yang Lu, Helmut Cölfen ou Shu-Hong Yu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Peng Huang et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Dong, L., Xu, YJ., Sui, C. et al. Nanoclusters de carbonate de calcium amorphe paramagnétique hautement hydratés comme agent de contraste IRM. Nat Commun 13, 5088 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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Reçu : 06 juin 2021

Accepté : 08 août 2022

Publié: 29 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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