Validation de la méthode analytique pour la détermination du cannabidiol et du tétrahydrocannabinol dans les produits infusés à l'huile de chanvre par RP

Mar 09, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12453 (2022) Citer cet article

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Une méthode quantitative simple de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) a été développée et validée pour la détermination du cannabidiol et du tétrahydrocannabinol dans les produits infusés à l'huile de chanvre. La méthode RP-HPLC a été développée et optimisée pour la composition de la phase mobile, le débit, la sélection de colonne et la longueur d'onde du détecteur. Une élution isocratique des échantillons a été réalisée sur une colonne SOLAS 100 Å C18 150 mm × 4,6 mm, 5 μm avec une phase mobile contenant 75/25 acétonitrile/eau v/v, avec un débit de 1,5 mL/min en utilisant un ultraviolet– détecteur visible (UV/Vis) fonctionnant à 214 nm. La méthode RP-HPLC a été validée pour répondre aux exigences réglementaires qui couvrent la spécificité, l'exactitude, la plage, la linéarité, la précision, l'adéquation du système et la robustesse. La méthode de test de dosage validée a été appliquée avec succès pour quantifier le cannabidiol et le tétrahydrocannabinol dans des produits commerciaux infusés à l'huile de chanvre tels que des comprimés, des gélules molles, des huiles d'extraits de plantes, des gouttes orales, des teintures et des exhausteurs de boissons. Tous les résultats des tests ont été jugés acceptables selon les directives de l'ICH, ce qui a confirmé la faisabilité de cette méthode pour son utilisation prévue dans le contrôle de qualité régulier et le dosage du cannabidiol et du tétrahydrocannabinol dans les produits infusés à l'huile de chanvre.

À mesure que le marché des produits infusés au chanvre se développe, les consommateurs sont de plus en plus conscients des normes de qualité auxquelles ces produits sont testés. De plus, pour le cannabis médical, des tests précis sont importants car les patients exigent des effets thérapeutiques spécifiques. C'est pour cette raison que l'industrie du chanvre/cannabis s'efforce de plus en plus d'effectuer des tests pour quantifier la force et la pureté de ces produits. Le cannabis est une plante appartenant à la famille des Cannabaceae et contient divers constituants naturels. Au total, 565 composés ont été isolés et identifiés à partir de l'espèce C. sativa dont 120 appartiennent à la catégorie des cannabinoïdes1,2. Les cannabinoïdes appartiennent à un groupe de composés terpénophénoliques à 21 atomes de carbone et sont ensuite divisés en 11 sous-groupes en fonction de leur structure chimique. Cela constitue 7 composés de Cannabidiol (CBD), 16 composés de Cannabigerol (CBG), 23 composés de ∆9-tétrahydrocannabinol (∆9-THC), 5 composés de ∆8-tétrahydrocannabinol (∆8-THC), 11 composés de Cannabinol (CBN), 9 composés de cannabichromène (CBC), 5 composés de cannabielsoïne (CBE), 2 composés de cannabinodiol (CBND), 3 composés de cannabicyclol (CBL), 9 composés de types cannabitriol (CBT) et les 30 composés restants appartiennent à type divers3. Le CBD, le THC, le CBG, le CBN et le CBC sont des cannabinoïdes neutres et sont synthétisés par une réaction de décarboxylation de leurs formes acides naturelles respectives (CBDA, THCA, CBGA, CBNA et CBCA). Sur 120 cannabinoïdes, le CBD et le THC sont les deux principaux biomarqueurs dans les échantillons d'huile de chanvre commerciale4. CBD (Fig. 1a), l'ingrédient pharmaceutique actif (API) trouvé dans les produits à base d'huile de chanvre médicinal et il présente plusieurs propriétés curatives telles que anti-psychotique, anti-anxiété, antiémétique, stimulant l'appétit, analgésique, ainsi que relaxant musculaire effets5. D'autre part, le THC (Fig. 1b) est le principal constituant psychoactif du cannabis, et c'est la raison pour laquelle le cannabis est utilisé comme drogue récréative5. Selon le US Farm Bill 2018, le chanvre est défini comme « la plante Cannabis sativa L. et toute partie de cette plante, y compris les graines de celle-ci et tous les dérivés, extraits, cannabinoïdes, isomères, acides, sels et sels d'isomères, qu'ils soient en croissance ou non, avec une concentration en delta-9 tétrahydrocannabinol ne dépassant pas 0,3 % sur une base de poids sec »6. Cela rend le besoin d'une méthode quantitative pour la détermination simultanée du CBD et du THC dans les produits à base de chanvre d'une importance vitale. La composition des niveaux de CBD et de THC a une forte influence sur la légalité et les effets physiologiques du produit final.

(a) Cannabidiol et (b) Tétrahydrocannabinol—représentation structurelle du CBD et du THC. Formule : C21H30O2 ; Masse moléculaire : 314,464 g/mol.

Une étude approfondie de la littérature a révélé qu'il existe plusieurs méthodes analytiques pour quantifier les cannabinoïdes dans les extraits de plantes de cannabis et que les méthodes les plus couramment utilisées utilisent la chromatographie en phase gazeuse (GC) couplée à des détecteurs de spectrométrie de masse (MS)7,8,9,10,11,12,13 ,14. La méthode GC limite la quantification des analogues acides en raison de la décarboxylation due aux conditions d'entrée et de four chaudes. De plus, le processus de décarboxylation s'est avéré incomplet et a généré des difficultés d'analyse quantitative. En GC, la détermination des cannabinoïdes acides nécessite de nombreuses étapes de dérivatisation15 qui peuvent être longues et coûteuses pour les laboratoires commerciaux. Pour la quantification des cannabinoïdes acides et neutres, les méthodes basées sur la chromatographie liquide à haute performance (HPLC)16, la chromatographie sur couche mince (TLC)17, la HPLC couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS)18, la chromatographie en phase liquide supercritique à ultra haute performance ( UHPSFC)19, la chromatographie liquide couplée à la SM (LC-MS)20,21,22,23 et les techniques de chromatographie de partage centrifuge24 ont été rapportées. Des méthodes montrant la détermination quantitative du CBD dans un isolat pur ont également été publiées plus tôt25. De toutes les méthodes, les méthodes HPLC ont été identifiées comme les plus simples car elles permettent la détermination des formes acides et neutres et même le système ne nécessite pas de détecteurs MS coûteux. Plusieurs méthodes ont été publiées qui utilisent HPLC26,27,28,29,30,31 et la plupart de ces méthodes utilisent des phases mobiles tampon et des techniques d'élution par gradient32,33. De plus, ces méthodes démontrent la séparation du mélange de cannabinoïdes où il comprend plusieurs cannabinoïdes en dehors du CBD et du THC28,34,35,36,37. Les méthodes HPLC les plus simples utilisent des techniques d'élution isocratique où la phase mobile se compose uniquement de modificateurs organiques ont également été signalés38,39. L'industrie du chanvre exige le développement de méthodologies analytiques simples, robustes, précises et efficaces pour la quantification des principaux constituants tels que le CBD et le THC, afin de suivre l'évolution rapide des exigences réglementaires de cette industrie. L'huile de chanvre est actuellement utilisée pour formuler plusieurs nouveaux biens de consommation et compléments alimentaires. Des exemples de tels produits comprennent des exhausteurs de boissons, des chocolats, des capsules, des topiques, des produits de boulangerie, ainsi que des médicaments sans ordonnance sous forme de comprimés, de teintures, de capsules, de gouttes orales et de gouttes sublinguales.

Ici, nous démontrons la faisabilité de la méthode HPLC en phase inverse (RP-HPLC) pour une détermination quantitative fiable et rapide du CBD et du THC dans les produits à base d'huile de chanvre. Cette méthode utilise l'élution isocratique qui rend la méthode réalisable dans n'importe quel système HPLC standard. En outre, la méthode fonctionne bien dans des conditions de température ambiante et utilise uniquement une phase mobile de modificateur organique. La spécificité, la linéarité, l'exactitude, la plage, la précision et la robustesse de la méthode d'analyse ont été déterminées conformément aux exigences de validation de la méthode d'analyse spécifiées dans la directive qualité Q2(R1) du Conseil international d'harmonisation (ICH), "Validation of Analytical Procedures: Test and Methodology " pour la quantification du CBD et du THC par chromatographie liquide40.

L'analyse RP-HPLC a été réalisée sur un Jasco Extrema (JASCO, Inc., 28600 Mary's court, Easton, Maryland 21601, USA) connecté à un échantillonneur automatique intégré (AS-4150), une pompe quaternaire (PU-4180) avec un sur- dégazeur de ligne, four à colonne (CO-4061), détecteur UV/Vis (UV-4075) et un boîtier d'interface LC-NetII/ADC. Les données chromatographiques ont été collectées et analysées à l'aide du logiciel ChromNAV Ver.2. Un deuxième système HPLC (série Agilent 1100) équipé d'un détecteur à longueur d'onde variable (G1314A VWD), d'un échantillonneur automatique (G1313A) et d'un système de pompe isocratique (G1310A). Ce système automatisé avec un logiciel Chemstation (Agilent technologies) et qui a été utilisé pour les tests de précision intermédiaire (répétabilité) et la collecte de données. Les séparations chromatographiques ont été réalisées en utilisant une colonne SOLAS 100 Å C18 150 mm × 4,6 mm 5 µm (Glantreo limited, Irlande). Différentes colonnes HPLC telles que SOLAS ODS C18 150 mm × 4,6 mm 5 µm, SOLAS ODS C18 150 mm × 4,6 mm 3 µm, SOLAS BDS C18 150 mm × 4,6 mm 5 µm, SOLAS BDS C18 150 mm × 4,6 mm 3 µm et EIROSHELL C18 150 mm × 4,6 mm 2,6 µm (Glantreo limited) ont été utilisés à des fins de développement de méthode. Chaque produit chimique et les échantillons de test ont été pesés avec précision à l'aide d'une balance analytique (Adventurer Pro AS214, Ohaus corporation, Pine Brook, NJ USA).

Tous les réactifs et produits chimiques de HPLC ou de qualité analytique ont été utilisés, y compris l'acétonitrile d'Alfa Aesar (Thermo Fisher Scientific, Lancashire, Royaume-Uni) et l'eau distillée de l'installation interne. Les étalons de référence de cannabidiol (CBD) et de Δ9-tétrahydrocannabinol (Δ9-THC ou THC) ont été achetés dans le commerce auprès de Cerilliant (Cerilliant Corporation, Round Rock, Texas, États-Unis). Le mélange de phytocannabinoïdes 10 a été acheté auprès de Cayman Chemical (Cayman Chemical Company, 1180 East Ellsworth Road, Ann Arbor, Michigan 48108 USA). Prism Science LLC, 30403 Kings Valley Dr., Conifer, CO 80433 a aimablement fourni des comprimés CBD (Santeer LUV 5 mg CBD Tablets-Medium) et des comprimés placebo pour les tests. Les filtres à membrane Millex-LCR PTFE 0,45 um ont été achetés auprès de Merck Millipore Ltd., Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, Irlande.

Une phase mobile d'acétonitrile et d'eau 75/25 v/v avec un débit isocratique de 1,5 mL/min a été utilisée. La température de la colonne a été maintenue à 25°C et la détection a été faite à 214 nm. 10 µL de solutions standard et d'échantillons ont été injectés dans le système HPLC, où un temps d'exécution de 10 min pour le standard CBD et de 20 min pour l'adéquation du système et les échantillons de dosage ont été utilisés. Pour le développement de la méthode, 20 µL de solution standard de travail du mélange de phytocannabinoïdes 10 ont été injectés dans le système HPLC.

Des solutions étalons mères de 100 µg/mL CBD et 100 µg/mL THC ont été préparées en dissolvant 1,0 mL d'étalons de référence CBD et THC dans 10 mL d'acétonitrile dans des flacons volumétriques séparément. 1,0 mL de solution standard de stock de THC a été dilué par 10 mL d'acétonitrile et a été utilisé comme stock standard final contenant 10 µg/mL de THC.

Pour optimiser les paramètres de la méthode chromatographique, solution standard de travail de 10 µg/mL de CBD, préparée en diluant 1,0 mL d'étalon de stock de CBD à 10 mL avec de l'acétonitrile. Une solution standard de travail de mélange de phytocannabinoïdes de 25 µg/mL-10, préparée en diluant 1,0 mL de solution standard de 250 µg/mL à 10 mL avec de l'acétonitrile a été utilisée. Des phases mobiles variant de 60/40 v/v à 80/20 v/v acétonitrile/eau ont été considérées et des débits de 1,5 mL/min et 2,0 mL/min ont été étudiés. Après optimisation des paramètres de phase mobile et de débit, les tests ont été effectués dans différentes longueurs d'onde (214 nm, 228 nm, 230 nm, 240 nm, 280 nm et 305 nm). Des colonnes chromatographiques de 150 × 4,6 mm avec différentes granulométries et chimies de colonne ont été testées. Les colonnes considérées étaient SOLAS C18 5 µm, SOLAS ODS 5 µm et 3 µm, SOLAS BDS 5 µm et 3 µm et EIROSHELL C18 2,6 µm. La colonne chromatographique qui a montré une meilleure efficacité de séparation a été choisie pour le test final.

Un volume de 1,0 mL de solutions étalons mères de CBD et de THC a été dilué par 10 mL d'acétonitrile dans une fiole jaugée (mélange standard de concentration 10 µg/mL CBD et 1 µg/mL THC chacun) et utilisé pour la méthode de dosage. Cette solution a été utilisée pour les tests d'adéquation du système où six injections ont été effectuées en HPLC et ont déterminé le nombre de plaques, le facteur de traînée, la résolution et la reproductibilité (pourcentage de RSD du temps de rétention, de la surface du pic et de la hauteur pour six injections).

La linéarité du test a été démontrée en préparant cinq solutions standard dans la plage de 50 à 150 % de la concentration nominale de l'échantillon (0,1 mg/mL). Chaque solution a été préparée par dilution en série à partir d'un stock unique (5 à 15 µg/mL pour le CBD et 0,5 à 1,5 µg/mL pour le THC) et a été injectée en triple exemplaire. Une analyse de régression linéaire a été effectuée sans considérer l'origine comme un point de données.

Pour plus de spécificité, préparation de solutions placebo non dopées en pesant l'équivalent d'un placebo d'un poids de comprimé de mélange placebo (pesé 20 comprimés et calculé le poids moyen) et transféré dans une fiole jaugée de 50 ml, ajouté 35 ml d'acétonitrile et soniqué pendant 20 min. Dilué au volume avec de l'acétonitrile et bien mélangé (stock placebo non dopé). Diluer 1,0 ml de cette solution à 10 ml avec de l'acétonitrile, bien mélanger, filtrer dans un flacon d'échantillonneur automatique après avoir jeté 2,0 ml de filtrat à l'aide d'une unité de filtre Millex PTFE de 0,45 µm. La préparation placebo a été injectée en double. Préparation de deux solutions dopées distinctes contenant l'actif à 100 % en préparant séparément un stock de placebo non dopé et dilué 1,0 à 10 ml avec de l'acétonitrile, ajouté 1,0 ml de standard de stock de CBD et 1,0 ml de solutions standard de stock final de THC, bien mélangé, filtré dans flacon d'échantillonneur automatique après avoir jeté 2,0 mL de filtrat à l'aide d'un filtre Millex PTFE de 0,45 µm. (Concentration dopée : CBD—10 µg/mL et THC—1 µg/mL chacun). Injecter les échantillons dopés deux fois pour confirmer la spécificité.

La plage de la méthode de dosage a été démontrée en analysant des solutions placebo dopées dans une plage comprise entre 50 et 150 % de la concentration nominale de l'échantillon de la méthode de CBD (10 µg/mL) et de THC (1 µg/mL). Trois poids ont été préparés à chacun des cinq niveaux de concentration et chaque solution a été analysée en triple. Une analyse de régression linéaire a été effectuée sans considérer l'origine comme un point de données.

La précision et la récupération de la méthode de dosage ont été validées en analysant les données obtenues à partir de solutions de placebo enrichies pendant la partie plage de la validation. Le pourcentage de récupération de chaque poids d'échantillon individuel et la moyenne à chaque niveau de concentration ont été déterminés.

Pour plus de précision, les solutions d'échantillons de dosage sont préparées comme suit :

Cinq comprimés (minimum) ont été pesés avec précision, le poids moyen des comprimés a été calculé, puis les comprimés ont été broyés en poudre fine. Un échantillon pesé équivalent à 5 mg de CBD transféré dans une fiole jaugée de 50 ml, environ 35 ml d'acétonitrile a été ajouté et la solution résultante a été soniquée pendant 15 min avec agitation intermittente. Les échantillons ont ensuite été dilués au volume avec de l'acétonitrile et bien mélangés. 1,0 ml de cette solution a été dilué à 10 ml avec de l'acétonitrile, bien mélangé et filtré une partie à travers le kit de filtration d'échantillon Millex PTFE 0,45 µm dans des flacons HPLC après avoir jeté les 2 ml initiaux de solution d'échantillon. Suite à cette procédure, l'échantillon a été calculé pour contenir 10 µg/mL de CBD. 10 µL des solutions d'échantillon ont ensuite été injectés dans le système HPLC.

Pour la précision de la méthode (répétabilité), six échantillons de test préparés et le pourcentage d'indications sur l'étiquette pour le CBD et le THC ont été déterminés pour chaque échantillon. La précision intermédiaire de la méthode a été démontrée en effectuant à nouveau l'expérience de répétabilité avec un deuxième analyste. Cet analyste a utilisé différentes préparations de solutions, réactifs, conditions opératoires, colonnes et systèmes HPLC et a effectué des tests à des jours différents à partir du premier analyste.

La robustesse de la méthode a été établie par la variation des paramètres chromatographiques pour indiquer la fiabilité de la méthode analytique proposée lors d'une utilisation normale. Les paramètres chromatographiques considérés étaient la variation de la composition de la phase mobile, la température du four à colonne et le débit de la phase mobile. Dans la composition de la phase mobile, le composant principal a augmenté de 5 % et 10 %, la température du four à colonne a été augmentée et réduite de 5 °C et le débit a augmenté et diminué de 10 % et 25 % par rapport à la condition de la méthode proposée. La solution standard d'adéquation du système a été injectée en double à chaque changement de paramètre.

La méthode de test a été développée et validée conformément aux directives de l'ICH en ce qui concerne l'adéquation du système, la linéarité, la spécificité, l'exactitude, la plage, la précision (répétabilité et précision intermédiaire) et la robustesse.

L'objectif de notre recherche était de développer une nouvelle méthode analytique pour la détermination simultanée du CBD et du THC dans les produits infusés à l'huile de chanvre. De plus, la méthode proposée ici peut être utilisée dans les laboratoires commerciaux d'essais de médicaments, les industries pharmaceutiques et les laboratoires de recherche en tant que procédure de contrôle qualité standard. L'optimisation des conditions chromatographiques joue un rôle majeur dans la détection et la quantification précises des analytes dans les techniques HPLC. Des phases mobiles contenant différents pourcentages d'acétonitrile (60, 70, 75 et 80 %, v/v) ont été examinées et le temps d'élution pour le CBD et la résolution entre le CBD et le CBG ont été notés. Lors des tests pour différentes compositions de phase mobile, un débit de 2,0 ml/min et une longueur d'onde de détection de 214 nm ont été utilisés. Une longueur d'onde de détection de 305 nm a été utilisée pour identifier le CBN dans le mélange de phytocannabinoïdes car le CBN génère un fort pic à 305 nm. Les résultats des tests nous amènent à recommander une concentration en phase mobile de 75/25 v/v acétonitrile/eau. Des débits de 1,5 ml/min et de 2,0 ml/min ont été comparés et ont finalisé le débit à 1,5 ml/min où le CBD s'élue avec une meilleure efficacité. Différentes longueurs d'onde (214 nm, 228 nm, 230 nm, 240 nm, 280 nm et 305 nm) ont été vérifiées et l'intensité maximale du CBD a été notée. Différentes colonnes chromatographiques avec des dimensions de colonne de 150 mm × 4,6 mm ont été testées pour leur capacité à séparer le CBD et le THC d'autres cannabinoïdes. Toutes les colonnes testées ont été fabriquées par Glantreo limited à l'aide de leur plate-forme technologique de silice interne et comprennent SOLAS 100 Å C18 5 µm, SOLAS ODS 5 µm et 3 µm, SOLAS BDS 5 µm et 3 µm et EIROSHELL C18 2,6 µm. Tous les résultats des tests ont été tabulés et présentés dans les tableaux 1a à c.

D'après le tableau 1a, il ressort clairement qu'une phase mobile d'acétonitrile/eau 75/25 v/v avec un débit de 1,5 ml/min permet au pic de CBD de s'éluer avec une meilleure efficacité et également, avec une séparation comparativement meilleure du CBG. Le tableau 1b a montré que les longueurs d'onde du détecteur de 214 nm et 228 nm convenaient car, dans les longueurs d'onde plus élevées, une réduction significative de la force de l'intensité maximale du CBD a été observée. Dans cette méthode, 214 nm a été considéré comme une longueur d'onde optimale, car dans cette longueur d'onde, le CBD s'élue avec une intensité de pic plus élevée et une meilleure efficacité (tableau 1b). Le tableau 1c indique que la colonne SOLAS C18 150 mm × 4,6 mm 5 µm a démontré une séparation des puits pour le mélange de phytocannabinoïdes 10 avec une résolution supérieure entre CBG et CBD par rapport aux colonnes SOLAS ODS 5 µm, BDS 5 µm et EIROSHELL 2,6 µm C18. De plus, la colonne SOLAS C18 150 mm × 4,6 mm 5 µm a démontré une plus grande efficacité en termes de nombre de plateaux théoriques pour le CBD et également, avec une symétrie de pic CBD ≤ 1,5.

Un test d'adéquation du système a été effectué pour un mélange standard contenant 10 µg/mL de CBD et 1 µg/mL de THC et six injections répétées ont été effectuées dans les deux systèmes HPLC (Agilent 1100 et Jasco Extrema HPLC). Les valeurs RSD observées pour le temps de rétention, la surface du pic et la hauteur du pic se situent bien dans les limites fixées des critères d'acceptation de moins de 1 %. Les plaques théoriques (N), le facteur de queue USP (T), le facteur de capacité, la résolution USP (Rs) entre le CBD et le THC et le temps de rétention relatif (RRT) du THC ont été déterminés pour le dosage. Les résultats sont résumés dans le tableau 2a et tous les résultats sont dans la limite acceptable définie mentionnée dans le tableau 2a. Un chromatogramme typique d'adéquation du système est illustré à la Fig. 2.

Chromatogramme d'adéquation du système du mélange standard CBD et THC (10 µg/mL CBD et 1 µg/mL THC) pour le dosage.

La linéarité de la réponse de la zone de pic pour le CBD et le THC a été déterminée pour la méthode de dosage en analysant le mélange standard avec des dilutions en série de 50 à 150 % de la concentration de la méthode (10 µg/mL pour le CBD et 1 µg/mL pour le THC). Une analyse de régression linéaire a été effectuée sans considérer l'origine comme un point de données. Pour le CBD et le THC, le pourcentage de RSD pour la zone de pic pour les injections en triple s'est avéré inférieur à 1,0 % et présente des réponses linéaires avec r2 > 0,999 (tableau 2b). Un graphique de la concentration en fonction de la réponse de la zone de pic (intensité) est illustré à la Fig. 3. Un graphique des résidus en fonction de la concentration de l'analyte est illustré à la Fig. 3.

Diagrammes de linéarité et de tracé résiduel pour la validation de la méthode de dosage du CBD et du THC (a) Tracé résiduel pour le CBD (b) Tracé résiduel pour le THC (c) Tracé de linéarité du dosage pour le THC et (d) Tracé de linéarité du dosage pour le CBD.

Les échantillons de placebo ont été préparés en pesant une quantité appropriée de placebo (le placebo reste à 100 % de la concentration de la méthode), par rapport à la concentration spécifiée dans la méthode en cours de validation. La préparation placebo a été injectée en double. Préparé deux solutions enrichies distinctes contenant l'actif à 100 %. Les échantillons dopés ont été injectés deux fois pour confirmer la spécificité. Des exemples de chromatogrammes de blanc de diluant, de placebo non dopé et de préparations de placebo dopé sont présentés sur la figure 4. La figure 4 a démontré la sélectivité de cette méthode car aucun pic interférant du diluant et du placebo n'a été observé. De plus, un solvant d'échantillon à blanc (acétonitrile) a été injecté après chaque 10e injection d'échantillon (avant l'injection standard de contrôle) et à la fin de chaque séquence chromatographique afin d'évaluer la présence de transfert puisque cette méthode suit une élution isocratique. Ces injections de solvant d'échantillon vierge ont également été incorporées dans la séquence chromatographique de l'analyse d'échantillon infusé d'huile de chanvre de routine par précaution pour minimiser l'effet des impuretés à élution tardive accumulées dans la colonne, le cas échéant. Les chromatogrammes de ces injections de solvant d'échantillon vierge ont montré l'absence de tout pic lié aux métabolites cannabinoïdes ou à toute impureté inconnue aux temps de rétention du CBD et du THC, ce qui prouve à son tour l'absence d'accumulation sur la colonne de tout composé non retenu.

Chromatogrammes de spécificité de (a) blanc de diluant (b) placebo non dopé et (c) échantillons placebo dopés de dosage CBD et THC.

Des solutions de placebo dopées avec une concentration d'échantillon allant de 50 à 150 % de la concentration de la méthode ont été préparées en triple exemplaire. Trois injections ont été faites à partir de chaque préparation, et une analyse de régression linéaire a été effectuée sans considérer l'origine comme un point de données. Les normes CBD et THC montrent une excellente réponse linéaire (r2> 0,999 (tableau 2b). De plus, le pourcentage de RSD pour les réponses de surface moyenne pour les injections en triple et pour chaque niveau de concentration (n = 9, où n est le nombre d'injections effectuées) était trouvé inférieur à 2,0 % (tableau 2b). Un graphique de la concentration par rapport à la réponse de la zone est présenté à la figure 5. Un graphique des résidus par rapport à la concentration de l'analyte est présenté à la figure 5.

Graphique de concentration par rapport à la réponse de surface de (a) CBD et (b) THC pour les tests de précision et de plage pour le dosage.

Le pourcentage de récupération de chaque échantillon placebo dopé individuel et la moyenne à chaque niveau de concentration ont été calculés. Les résultats ont été présentés dans le tableau 2b. Le pourcentage de récupération des placebos dopés s'est avéré être de 100 à 105 % pour le CBD et de 98 à 100 % pour le THC (critères d'acceptation : 90 à 110 % selon les directives de l'ICH40) pour la moyenne de chaque ensemble de trois poids. Chaque récupération d'échantillon individuel a également été trouvée dans la plage de 90 à 110 %. Les données de récupération montrent la grande efficacité d'extraction du CBD et du THC de cette méthode.

La précision de la méthode (répétabilité) a été réalisée en préparant six solutions d'échantillon à partir des comprimés pour une concentration de 10 µg/mL de CBD où l'équivalent de 5 mg de CBD a été pesé. Chaque préparation a été injectée deux fois et les valeurs de dosage calculées. Les résultats, y compris les valeurs de pourcentage RSD de CBD et de THC pour la répétabilité et la précision intermédiaire, sont présentés dans le tableau 2b. Les valeurs en pourcentage de RSD pour le CBD et le THC sont inférieures à 2,0 %. Les chromatogrammes d'un étalon typique et de solutions d'échantillon (5 mg) ont été présentés à la Fig. 6. Le chromatogramme de l'échantillon a été comparé aux chromatogrammes de l'étalon, du placebo et du blanc. Comme le CBG semblait se chevaucher légèrement avec le CBD dans le chromatogramme de l'échantillon d'huile de chanvre, la séparation était toujours distincte pour permettre une intégration correcte. La précision intermédiaire de la méthode a été démontrée en répétant l'expérience de répétabilité avec un deuxième analyste. Cet analyste a utilisé différentes préparations de solutions, réactifs, conditions opératoires, colonnes et systèmes HPLC et a effectué des tests à des jours différents à partir du premier analyste. Tous les critères d'acceptation ont été remplis (le pourcentage de RSD des valeurs de test ne doit pas être supérieur à 2,0 %. Le pourcentage de RSD des valeurs de test combinées des deux analystes ne doit pas dépasser 3,0 % conformément aux directives de l'ICH).

(a) Standard et (b) échantillons de chromatogrammes provenant de tests de précision pour la validation des méthodes de dosage du CBD et du THC.

La robustesse de la méthode a été prouvée par la variation de la composition de la phase mobile, de la température et du débit, à partir des paramètres spécifiés dans la méthode proposée. Une norme d'adéquation du système (10 µg/mL de CBD et 1,0 µg/mL de THC) a été préparée et injectée en double à chaque changement de paramètre. Cette solution a été utilisée pour effectuer la robustesse du dosage et chaque changement de paramètre a été testé un facteur à la fois. Le temps de rétention (RT), les plaques théoriques (N), le facteur de traînée (T), le facteur de capacité (k), la résolution entre le CBD et le THC (Rs) et le temps de rétention relatif (RRT) pour le THC sont indiqués dans le tableau 3. L'examen des résultats du tableau 3 suggère que la variation de la concentration de la phase mobile est un paramètre critique, car une diminution de 5 % et 10 % du composant principal (acétonitrile) en volume dans la composition de la phase mobile entraîne une élution du THC non comprise dans l'exécution de la méthode temps. En outre, une augmentation de 5 % et 10 % du composant principal dans la composition de la phase mobile entraîne une faible efficacité (valeurs de plaque théoriques réduites, voir le tableau 3). Les variations de température du four à colonne ne montrent aucune variation dans aucun des paramètres d'efficacité du système ou de la colonne.

De plus, la stabilité de la solution a été établie pendant 48 h en testant deux fois l'adéquation du système des solutions standard en utilisant un standard fraîchement préparé, les solutions conservées à température ambiante pendant 24 h, les solutions conservées à 0–8 ° C pendant 24 h et la solution conservée à température ambiante pendant 48 h. Les résultats montrent une variation négligeable des valeurs d'absorbance de la zone de pic et ont prouvé la stabilité de la solution standard de 48 h à température ambiante. De plus, une ancienne colonne où > 500 injections ont été effectuées a été testée et a trouvé une traînée et une contre-pression plus élevées par rapport à la nouvelle colonne indiquant la durée de vie approximative de cette colonne HPLC (SOLAS 100 Å C18, 150 mm × 4,6 mm 5 µm) est inférieure à 500 injections .

L'adéquation de cette méthode validée a été étudiée à l'aide d'une large gamme de comprimés infusés d'huile de chanvre fournis par Prism Science LLC, 30403 Kings Valley Dr., Conifer, CO 80433. Les échantillons comprenaient des comprimés Santeer LUV 2,5 mg, 5 mg et 10 mg PET. , les comprimés Santeer FOCUS et RENEW 5 mg CBD et les comprimés Santeer DREAM 10 mg CBD. Ensuite, cette méthode a été appliquée pour quantifier le CBD et le THC dans divers produits infusés à l'huile de chanvre et présentée dans un article publié par Analakkattillam et al.41. Les échantillons testés comprenaient des comprimés, des gélules, de la teinture, des gouttes orales, des exhausteurs de boissons et des huiles d'extraits de plantes. De plus, cette méthode s'est avérée appropriée pour quantifier le CBD et le THC dans des matrices complexes telles que les chocolats infusés à l'huile de chanvre où les cannabinoïdes ont été extraits à l'aide de la méthode d'extraction QuEChERS42,43. De plus, Glantreo limited utilise actuellement cette méthode de dosage pour tester des échantillons commerciaux infusés d'huile de chanvre comme procédure de contrôle de la qualité.

La pertinence de l'efficacité de cette méthode pour quantifier le CBD et le THC a été comparée en tenant compte des données de récupération du CBD et du THC rapportées dans différents articles publiés où la technique HPLC était utilisée (tableau supplémentaire S1). Le tableau supplémentaire S1 a clairement montré que 10 des 17 méthodes utilisaient une élution en gradient4,26,28,29,30,31,32,35,36,37 et pour les 7 méthodes restantes, une élution isocratique, quatre méthodes utilisent un acide ou une base ou sel contenant une phase mobile16,27,33,34. Une méthode d'élution isocratique utilise une température de four à colonne de 40 °C et était à l'origine une méthode de chromatographie liquide à ultra haute performance25, tandis que dans l'autre méthode isocratique, une température de four à colonne de 55 °C et un thermostat d'échantillonneur automatique de 4 °C ont été utilisés39. La seule méthode qui s'est avérée simple utilisait 85% de méthanol comme phase mobile et avec une durée d'exécution réduite de 10 min, mais la méthode a montré une récupération de CBD de 97,1% et une récupération de THC de 99,3% alors que notre méthode a montré une récupération de 105,2% pour CBD et 100,2 % de récupération pour le THC41. De plus, lors de la réalisation des tests de dosage pour les échantillons mentionnés dans l'article publié41, l'acétonitrile a d'abord été utilisé comme solvant d'extraction. Pour les échantillons où la teneur en CBD s'est avérée très faible par rapport à son étiquette, l'analyse a été effectuée en utilisant du méthanol comme solvant d'extraction. Pour les échantillons où le CBD n'a pas été détecté, une extraction supplémentaire a été effectuée à l'aide de la méthode d'extraction QuEChERS42,43 afin de confirmer l'efficacité d'extraction de l'acétonitrile et/ou du méthanol. Les résultats des tests de dosage étaient comparables pour les extractions à l'acétonitrile et au méthanol où l'acétonitrile s'est avéré plus approprié.

La quantification précise de composés comme les cannabinoïdes lorsque les produits contiennent des molécules psychotiques telles que le THC, exige que les laboratoires disposent de procédures validées abordables et facilement applicables. La quantité de THC dans un produit détermine la restriction légale pour ledit produit. La méthode de test de dosage validée et présentée ici permet la détermination quantitative et simultanée du CBD et du THC dans les produits infusés à l'huile de chanvre en 20 min de temps d'exécution. La méthode utilise une seule longueur d'onde de 214 nm et les tests peuvent être effectués à l'aide de n'importe quel détecteur standard traditionnel RP-HPLC et UV-visible. De plus, la méthode utilise uniquement des solvants organiques pour l'étalon et la préparation, et pour la phase mobile, un seul modificateur organique a été impliqué sans ajustement du pH et le test suit une élution isocratique. En raison de sa simplicité et de sa cohérence, cette méthode peut être utilisée par tout analyste ayant des connaissances de base en HPLC. La méthode s'est avérée sélective, précise, linéaire et exacte dans la plage de 50 % à 150 % de la concentration nominale pour les teneurs en comprimés. La méthode s'est avérée robuste avec les paramètres établis comme critiques tels que les changements de concentration de la phase mobile et le débit.

Les auteurs confirment que les données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant, le Dr Eric Moore ([email protected]).

Chromatographie liquide haute performance en phase inverse

Cannabidiol

Tétrahydrocannabinol

Écart-type relatif

Contrôle de qualité

Conseil international d'harmonisation

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Ce travail a été soutenu par l'Irish Research Council dans le cadre de la bourse du programme de troisième cycle basée sur l'emploi (Project ID: EBPPG/2019/38). S. Analakkattillam remercie Glantreo limited, ERI Building, Lee Road, Cork, Irlande pour avoir permis de mener la recherche dans leur organisation.

Glantreo Limited, ERI Building, Lee Road, Cork, T23 XE10, Irlande

Sandhyarani Analakkattilam, Victor K. Langsi et John P. Hanrahan

École de chimie, University College Cork, Cork, T12 YN60, Irlande

Sandhyarani Analakkattilam, Victor K. Langsi et Eric Moore

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Tous les auteurs ont contribué à la conception et à la conception de l'étude. Contribution de l'auteur selon la taxonomie CRediT décrite ci-dessous : SA : Méthodologie, validation, analyse formelle, enquête, rédaction—ébauche originale, visualisation, conservation des données, acquisition de financement. EM : Supervision, rédaction-revue et édition. JH : Conceptualisation, supervision (mentor d'emploi), rédaction-révision et édition, administration de projet. VL : Méthodologie, validation, ressources.

Correspondance à Eric Moore.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Analakkattillam, S., Langsi, VK, Hanrahan, JP et al. Validation de la méthode analytique pour la détermination du cannabidiol et du tétrahydrocannabinol dans les produits infusés à l'huile de chanvre par RP-HPLC. Sci Rep 12, 12453 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13737-6

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Reçu : 17 janvier 2022

Accepté : 04 mai 2022

Publié: 21 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-13737-6

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