Un dérivé spécifique de la dispiropipérazine qui arrête le cycle cellulaire, induit l'apoptose, la nécrose et les dommages à l'ADN

Jan 13, 2024

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8674 (2023) Citer cet article

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Les composés de dispiropipérazine sont une classe de molécules connues pour conférer une activité biologique, mais celles qui ont été étudiées en tant que régulateurs du cycle cellulaire sont peu nombreuses. Nous rapportons ici la caractérisation et la synthèse de deux dérivés de la dispiropipérazine : la spiro[2′,3]-bis(acénaphtène-1′-one)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazine (SPOPP-3, 1), et son isomère précédemment non décrit, le spiro[2′,5′]-bis(acénaphtène-1′-one)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazine ( SPOPP-5, 2). SPOPP-3 (1), mais pas SPOPP-5 (2), s'est avéré avoir une activité anti-proliférative contre un panel de 18 lignées de cellules cancéreuses humaines avec des valeurs IC50 allant de 0,63 à 13 µM. L'analyse par cytométrie en flux a révélé que SPOPP-3 (1) était capable d'arrêter le cycle cellulaire à la phase G2/M dans les cellules cancéreuses humaines SW480. L'analyse Western blot a en outre confirmé que l'arrêt du cycle cellulaire est en phase M. En outre, il a été démontré que SPOPP-3 (1) induisait l'apoptose, la nécrose et des dommages à l'ADN, ainsi que perturbait le positionnement du fuseau mitotique dans les cellules SW480. Ces résultats justifient une étude plus approfondie de SPOPP-3 (1) en tant que nouvel agent anticancéreux, en particulier pour sa capacité potentielle à sensibiliser les cellules cancéreuses à la mort cellulaire induite par les rayonnements, à améliorer l'immunothérapie contre le cancer, à surmonter la résistance aux médicaments liée à l'apoptose et pour une utilisation possible. dans les traitements du cancer par létalité synthétique.

L'utilisation de produits chimiques et de radiations pour induire des dommages à l'ADN est la méthode la plus couramment utilisée pour le traitement du cancer. Récemment, il y a un intérêt accru pour la manipulation du cycle cellulaire pour induire une catastrophe mitotique en tant que nouvelle stratégie thérapeutique anticancéreuse1,2,3,4,5. La catastrophe mitotique est caractérisée par des cellules qui seraient normalement arrêtées en phase G2/M en raison de dommages dans l'ADN ou le fuseau mitotique, mais procèdent faussement à la mitose en raison de points de contrôle défectueux du cycle cellulaire6. Le résultat final est la sénescence ou la mort cellulaire par apoptose, nécrose ou autophagie7. Cette stratégie repose sur l'utilisation d'agents endommageant l'ADN ou de radiations en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle du cycle cellulaire. En effet, plusieurs inhibiteurs du point de contrôle de la phase G2/M1,2,3,4,5, dont l'irinotécan, un médicament chimiothérapeutique actuellement utilisé pour le cancer colorectal métastatique, ont montré un potentiel de sensibilisation des cellules tumorales aux rayonnements ionisants. Ainsi, la découverte de nouveaux composés qui provoquent l'arrêt du cycle cellulaire G2/M reste un domaine important de la recherche sur le cancer8,9,10.

Il existe actuellement peu de dérivés de dispiropipérazine biologiquement actifs connus. L'un d'eux est le chlorure de prospidium. Ce composé, également connu sous le nom de prospidine, possède des propriétés cytostatiques, anti-inflammatoires et immunosuppressives11,12,13. Il a été classé comme composé antinéoplasique en raison de sa capacité à inhiber la mitogenèse des lymphocytes T et B au cours de la transformation lymphoblastique11 et à réduire les volumes tumoraux des tumeurs mammaires induites par des carcinogènes chez le rat12. Actuellement, le chlorure de prospidium est utilisé comme médicament anti-rhumatismal dans la polyarthrite rhumatoïde réfractaire14.

Malgré des rapports antérieurs sur des composés de dispiropipérazine biologiquement actifs, d'autres dérivés chimiques n'ont pas été suffisamment explorés. Ici, nous rapportons pour la première fois l'activité anti-proliférative de la spiro[2′,3]-bis(acénaphtène-1′-one)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazine (SPOPP -3, 1), un dérivé de dispiropipérazine précédemment synthétisé. SPOPP-3 (1) a une activité anti-proliférative contre un panel de lignées cellulaires cancéreuses humaines et est capable d'arrêter le cycle cellulaire en phase G2/M, d'induire l'apoptose, la nécrose et des dommages à l'ADN ainsi que de perturber le positionnement du fuseau mitotique.

Un rapport récent a démontré la synthèse de deux dérivés de la dispiropipérazine, la spiro[2′,3]-bis(acénaphtène-1′-one)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazine (appelée ici SPOPP-3, 1) et spiro[2′,5]-bis(acénaphtène-1′-one)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazine, par une réaction de cycloaddition d'ylure d'azométhine à l'aide d'acénaphtènequinone (AcQ) et l-proline comme substrats15. Nous avons effectué une réaction similaire avec de légères modifications comme décrit dans "Matériels et méthodes" pour obtenir SPOPP-3 (1) (Fig. 1). De manière surprenante, nous avons également obtenu une petite quantité de spiro[2′,5′]-bis(acénaphtène-1′-one)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazine (appelée ici SPOPP -5, 2) (Fig. 1 et Fig. Supplémentaires. S2, S3, S6–S11), un isomère qui n'a pas été isolé auparavant en raison de sa voie de formation défavorable prédite15,16. Ici, nous rapportons pour la première fois la pureté (Fig. S2 supplémentaire) et la structure de SPOPP-5 (2) telles que déterminées par FTIR (Fig. S3 supplémentaire), RMN (Fig. S6-S10 supplémentaires) et X-ray analyses de diffraction (Fig. S11 supplémentaire).

Synthèse des dérivés de dispiropipérazine SPOPP-3 (1) et SPOPP-5 (2).

À notre connaissance, aucune bioactivité n'a été signalée pour SPOPP-3 (1). Ici, nous montrons pour la première fois que SPOPP-3 (1) a réduit de manière significative la viabilité cellulaire dans les cellules cancéreuses du côlon humain (Fig. 2). Pour SPOPP-3 (1), l'IC50 était de 5,06 ± 1,43 µM, 5,42 ± 0,96 µM et 2,44 ± 0,83 µM dans les cellules cancéreuses du côlon humain SW480, HT29 et HCT116 respectivement (tableau 1). En revanche, son isomère SPOPP-5 (2) n'a eu aucun effet significatif, avec IC50 > 100 µM (Fig. 2 ; Tableau 1). Pour déterminer si SPOPP-3 (1) et SPOPP-5 (2) ont des effets différents sur différents types de cellules cancéreuses, nous les avons évalués sur 15 lignées cellulaires cancéreuses humaines supplémentaires comprenant 8 autres types différents de cancers humains. La doxorubicine a été utilisée comme contrôle positif sur les lignées cellulaires et le résumé est présenté dans le tableau 1. SPOPP-3 (1) reste inhibiteur avec des valeurs d'IC50 allant de 0,63 ± 0,17 µM dans la lignée cellulaire lymphoblastoïde T humaine CEM à 13,0 ± 1,96 µM dans lignée cellulaire d'hépatome humain HepG2. Encore une fois, SPOPP-5 (2) a montré une activité insignifiante dans quatre lignées cellulaires cancéreuses supplémentaires (MiaPaca-2, Panc-1, SKOV3 et MDA-MB-231) (tableau 1). Sur la base des résultats indiquant que SPOPP-5 (2) n'avait aucun effet anti-viabilité cellulaire significatif sur 7 lignées cellulaires cancéreuses, il n'a pas été évalué davantage sur les autres lignées cellulaires. L'effet anti-prolifératif de SPOPP-3 (1) était plus important contre les lignées cellulaires de leucémie humaine (IC50 de 0,63 à 3,60 µM), les lignées cellulaires de glioblastome humain (IC50 de 2,95 à 6,30 µM), les lignées cellulaires de cancer du côlon humain (IC50 de 2,44 à 5,42 µM), des lignées cellulaires humaines de cancer du col de l'utérus (IC50 de 4,23 µM), des lignées cellulaires humaines de cancer de l'ovaire (IC50 de 6,30 µM) et des lignées cellulaires humaines de cancer du sein (IC50 de 4,00 à 6,17 µM). SPOPP-3 (1) a une activité anti-proliférative légèrement plus faible contre la lignée cellulaire du cancer du foie humain (IC50 de 13,03 µM), les lignées cellulaires du cancer du pancréas humain (IC50 de 8,62 à 9,17 µM) et la lignée cellulaire du cancer de la prostate humaine (IC50 de 9,80 µM ). Dans l'ensemble, les résultats ont montré que SPOPP-3 (1) a un effet anti-prolifératif relativement fort sur un panel de lignées cellulaires cancéreuses humaines. Pour comprendre le mécanisme par lequel SPOPP-3 (1) exerce son effet anti-prolifératif sur les cellules, les études suivantes ont été menées.

SPOPP-3 (1) a inhibé la viabilité des cellules cancéreuses du côlon humain. La viabilité cellulaire dans les cellules de cancer du côlon humain SW480, HT29 et HCT116 a été évaluée à l'aide du test MTT. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de SPOPP-3 (1) ou SPOPP-5 (2) pendant 48 h. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences distinctes. Les barres d'erreur sont SEM.

Pour déterminer le mécanisme par lequel SPOPP-3 (1) diminue la viabilité cellulaire, une cytométrie en flux a été réalisée pour l'analyse du cycle cellulaire. Comme le montre la figure 3, le traitement avec 20 µM de SPOPP-3 (1) a provoqué un arrêt du cycle cellulaire dans la phase G2/M (figure 3b). Aucune activité n'a été observée pour SPOPP-5 (2). Pour étudier plus avant si SPOPP-3 (1) induit un arrêt en phase G2 ou M, nous avons effectué une analyse Western blot pour détecter la phospho-histone H3, un marqueur mitotique sensible établi17. En effet, le niveau de phospho-histone H3 était clairement augmenté dans les cellules SW480 traitées avec SPOPP-3 (1) mais pas SPOPP-5 (2) (Fig. 4), indiquant que SPOPP-3 (1) arrête les cellules SW480 en phase M. du cycle cellulaire. Pour étudier plus avant les effets de SPOPP-3 (1) sur le cycle cellulaire, nous avons effectué des expériences d'immunofluorescence pour étudier l'activation de la cycline B1. La cycline B1 est l'un des facteurs clés du contrôle de l'entrée en mitose18,19 avec son expression rapidement augmentée en phase G2 et culminant à la fin de G2 ou au début de la phase M20,21. Comme le montre la figure 5, la population de cellules tétraploïdes dans les cellules traitées par SPOPP-3 (1), comme indiqué par les cellules ayant un signal DAPI doublé, a été significativement augmentée par rapport au témoin DMSO. Cela confirme les résultats de la cytométrie en flux selon lesquels SPOPP-3 (1) a provoqué l'arrêt du cycle cellulaire dans la phase G2/M où les cellules n'ont pas réussi à se diviser en cellules filles. Dans les cellules témoins, la plupart des cellules tétraploïdes présentaient une coloration à la cycline B1 significativement plus élevée que les cellules tétraploïdes traitées avec SPOPP-3 (Fig. 5b). Ainsi, nos résultats indiquent que le traitement SPOPP-3 (1) est associé à une activation défectueuse de la cycline B1.

SPOPP-3 (1) a arrêté le cycle cellulaire en phase G2/M dans les cellules SW480. ( a ) Les cellules SW480 ont été traitées avec 2% de DMSO, 20 µM SPOPP-3 (1) ou 20 µM SPOPP-5 (2) pendant 24 h, après quoi les cellules ont été récoltées et soumises à une analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux. (b) Les résultats de (a) et de deux autres répétitions biologiques supplémentaires (n = 3) ont été combinés et exprimés comme indiqué. Les pourcentages de cycle cellulaire ont été calculés sur la base du modèle Watson Pragmatic. Une ANOVA à deux facteurs a été réalisée : *p < 0,0001.

SPOPP-3 (1) a induit la phospho-histone H3 dans les cellules SW480. ( a ) Immunoblots montrant l'expression de la phospho-histone H3 et de la GAPDH lors d'un traitement avec 2% de DMSO, 20 µM SPOPP-3 (1) ou 20 µM SPOPP-5 (2) pendant 24 h. (b) Les résultats de (A) et de deux autres répliques biologiques (n = 3) ont été moyennés et exprimés comme indiqué. Le test t a été utilisé : *p < 0,05.

Induction défectueuse de la cycline B1 dans les cellules traitées par SPOPP-3, comme le montrent les expériences d'immunofluorescence. Les cellules SW480 ont été traitées avec 40 µM de SPOPP-3 ou 2 % de DMSO pendant 24 h avant la fixation et l'immunocoloration avec l'anticorps anti-cycline B1 et le DAPI. ( a ) Image représentative de cellules traitées avec SPOPP-3 (images inférieures) montrant une grande population de cellules tétraploïdes (indiquées par des flèches) sans coloration à la cycline B1. En revanche, les cellules traitées au DMSO ont une population relativement petite de cellules tétraploïdes qui expriment toutes la cycline B1. ( b ) Les cellules tétraploïdes (avec signal DAPI doublé) (à gauche) et le pourcentage de cellules tétraploïdes positives pour la cycline B1 (à droite) ont été quantifiés dans chaque groupe et présentés en moyenne ± SD. Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée : * p < 0,05. Barre d'échelle 20 mm.

Pour déterminer l'effet possible de SPOPP-3 (1) sur la mort cellulaire qui a conduit à la diminution observée de la viabilité cellulaire, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour analyser l'apoptose et la nécrose. Les colorants couramment utilisés pour détecter la nécrose et l'apoptose sont respectivement le 7-AAD et l'annexine V-PE. Après traitement avec SPOPP-3 (1), SPOPP-5 (2) ou 2% de DMSO pendant 24 h, les cellules ont été doublement colorées avec du 7-AAD et de l'annexine V-PE. Comme le montre la figure 6a, les cellules traitées avec SPOPP-3 (1) sont passées à un état plus nécrotique (Q1 ; 32,64 %) par rapport aux cellules traitées au DMSO (Q1 ; 0,5 %), ce qui est statistiquement significatif (Fig. 6b). SPOPP-3 (1) a également induit de manière significative l'apoptose (Q2 + Q4) dans les cellules SW480 (Fig. 6). D'autre part, SPOPP-5 (2) n'a eu aucun effet significatif sur l'apoptose ou la nécrose par rapport au témoin.

SPOPP-3 (1) a induit l'apoptose et la nécrose dans les cellules SW480. ( a ) Les cellules SW480 ont été traitées avec 2% de DMSO, 20 µM SPOPP-3 (1) ou 20 µM SPOPP-5 (2) pendant 24 h, après quoi les lysats cellulaires ont été isolés et soumis à une analyse de mort cellulaire par cytométrie en flux. (b) Les résultats de (a) et de deux autres répétitions biologiques supplémentaires (n = 3) ont été combinés et exprimés comme indiqué. Une ANOVA à deux facteurs a été utilisée : *p < 0,005, **p < 0,0001.

Des études d'immunofluorescence ont été menées pour étudier la fonction potentielle de SPOPP-3 (1) en tant que toxine microtubulaire. Deux médicaments, la vinblastine et la colchicine, bien connus pour perturber les microtubules, ont été utilisés comme témoins positifs. La vinblastine, qui appartient à la famille des alcaloïdes de la pervenche, se lie à la tubuline à un site spécifique et inhibe la formation du fuseau mitotique entraînant une perturbation du cycle cellulaire22,23. Lorsqu'elle est utilisée à des concentrations élevées, la vinblastine est connue pour provoquer la formation de paracristaux en raison d'agrégats de tubuline étroitement emballés24. En effet, lorsque les cellules SW480 ont été traitées avec 50 nM de vinblastine, des paracristaux ont été observés (Fig. 7). La colchicine, en revanche, a perturbé les microtubules et provoqué une coloration diffuse de l'α-tubuline dans toutes les cellules (Fig. 7). En revanche, des fuseaux mitotiques ont pu être observés dans les cellules traitées avec SPOPP-3 (1). Cependant, les positions des fuseaux mitotiques semblaient être perturbées par rapport aux cellules témoins traitées avec du DMSO (Fig. 7). Le déplacement des fuseaux mitotiques était également associé au manque d'alignement des chromosomes à l'équateur de la cellule (Fig. 7). En résumé, ces résultats suggèrent que bien que SPOPP-3 (1) ne perturbe pas la formation des microtubules, le positionnement du fuseau mitotique semble être affecté.

SPOPP-3 (1) ne provoque pas de perturbation des microtubules. Les cellules SW480 ont été traitées avec 50 nM de vinblastine, 1 µM de colchicine ou 40 µM de SPOPP-3 (1) pendant 24 h avant la fixation et l'immunocoloration avec l'anticorps α-tubuline et le DAPI. Des fuseaux mitotiques ont été clairement observés dans les cellules traitées par SPOPP-3 (1) tandis que la colchicine et la vinblastine ont induit une perturbation des microtubules via différents mécanismes. Une coloration diffuse de l'α-tubuline dans le cytoplasme et la formation de para-cristaux (flèches) peuvent être observées avec un traitement à la colchicine et à la vinblastine respectivement. Barre d'échelle 5 mm.

Sur la base des découvertes selon lesquelles SPOPP-3 (1) provoque un arrêt G2/M associé à la régulation négative de la cycline B1 et au déplacement du fuseau mitotique, il est possible que l'activité de SPOPP-3 (1) se fasse via des dommages à l'ADN19,25. Pour étudier cette possibilité, nous avons utilisé la méthode basée sur la qPCR (LORD-Q) pour détecter les lésions de l'ADN26. Étant donné que cette méthode peut détecter les dommages à l'ADN quel que soit le type de lésion de l'ADN, nous estimons qu'il s'agit de la méthode la plus appropriée. Comme le montre la figure 8, bien que les données n'aient pas atteint une signification statistique en raison de la grande variation des données, l'effet de SPOPP-3 (1) sur les dommages à l'ADN peut être détecté dès 1 h après le traitement. Cependant, un tel effet était très réduit après 20 h de traitement (Fig. 8).

SPOPP-3 (1) a induit des dommages à l'ADN. Quantification des lésions d'ADN à l'aide de LORD-Q dans des cellules SW480 traitées avec 40 µM de SPOPP-3 (1) pendant les périodes indiquées. Des amplicons courts et longs amplifiés à partir du gène de l'ADNmt ont été utilisés dans la quantification des lésions dans l'ADN mitochondrial. Les données présentées sont moyennées à partir de trois répétitions biologiques ± SEM (n = 3).

Dans cette étude, nous rapportons la synthèse de SPOPP-3 (1) et montrons pour la première fois qu'il a une forte activité anti-proliférative contre 18 lignées cellulaires cancéreuses humaines (tableau 1). À notre grande surprise, en utilisant la procédure de synthèse rapportée précédemment15,16, nous avons également obtenu l'isomère structurel SPOPP-5 (2), un nouveau composé. Nous pensons que SPOPP-5 (2) a été formé entre nos mains parce que nous avons utilisé 35 ° C et 3 h pour la synthèse alors que Haddad et al.15 ont reflué leur réaction de synthèse à 65 ° C pendant 2 h. Une température de synthèse plus basse pendant les réactions de cycloaddition est connue pour favoriser un produit plus cinétiquement contrôlé16. Contrairement à SPOPP-3 (1), SPOPP-5 (2) n'avait pratiquement aucune activité antiproliférative (tableau 1). Nous supposons que la configuration des deux groupes carbonyle dans SPOPP-3 (1), en particulier en l'absence de composants chimiques supplémentaires entre eux, peut contribuer à son activité anti-proliférative (Fig. 1). De futures études sur la relation structure-activité devraient être menées pour tester cette hypothèse. L'effet différentiel de SPOPP-3 sur les différentes lignées cellulaires cancéreuses pourrait être lié au taux de croissance des lignées cellulaires. Par exemple, SPOPP-3 a un effet anti-prolifératif plus fort sur les lignées cellulaires de leucémie humaine à croissance plus rapide (K562, KG1a, CEM) et les lignées cellulaires de glioblastome (U251, U87), mais a un effet plus faible sur la lignée cellulaire de cancer du foie HepG2 à croissance plus lente, Lignée cellulaire du cancer de la prostate DU145 et lignées cellulaires du cancer du pancréas (MiaPaca2, Panc1) (tableau 1). Fait intéressant, cela n'est pas vrai pour la doxorubicine témoin positif qui a montré un fort effet anti-prolifératif sur les cellules à croissance plus rapide (U251, U87) et les cellules à croissance plus lente (DU145, SKOV3). De telles observations suggèrent que SPOPP-3 et la doxorubicine exercent leur effet anti-prolifératif par différents mécanismes.

L'activité anti-proliférative de SPOPP-3 (1) était associée à sa capacité à induire l'apoptose et la nécrose (Fig. 6), ainsi qu'à sa capacité à provoquer l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M (Fig. 3). En utilisant l'histone H3 phosphorylée comme marqueur de phase M, il a été montré qu'au moins certaines cellules étaient arrêtées en phase M (Fig. 4). Nos résultats ont également montré que l'expression de la cycline B1 était considérablement réduite lors du traitement par SPOPP-3 (1) (Fig. 5). Bien qu'une augmentation de l'expression de la cycline B1 à la fin de la phase G2 et de sa translocation vers le noyau soit importante pour l'initiation de la mitose, sa déplétion à l'aide de l'inactivation de l'ARNsi ne provoque pas l'arrêt des cellules uniquement en phase G2 car cela peut s'expliquer par la fonction redondante de la cycline B218,27. Nous avons également démontré à l'aide de la microscopie que, bien que les microtubules ne semblent pas affectés par le traitement SPOPP-3 (1), des défauts de la phase M, notamment le positionnement du fuseau mitotique et l'alignement chromosomique condensé, ont été observés (Fig. 7). Cela peut être dû à une diminution des niveaux de cycline B1, car on sait que la cycline B1 est normalement recrutée dans les centrosomes et les kinétochores28,29. Nous avons en outre étudié si SPOPP-3 (1) cause des dommages à l'ADN car il a été documenté que les niveaux de cycline B1 sont réduits à la suite de dommages à l'ADN30,31. En effet, nos résultats suggèrent que similaire à la bléomycine26, En effet, nos résultats montrent que SPOPP-3 (1) provoque des dommages à l'ADN à un stade précoce qui étaient détectables à 1 h mais pas à 20 h après le traitement (Fig. 8). Ceci est similaire à l'effet de la bléomycine26 et est probablement le résultat de la réponse rapide de réparation des dommages à l'ADN. qui surviennent bien plus tard.

Les propriétés anti-prolifératives de SPOPP-3 (1) ont des implications importantes dans le traitement du cancer. La létalité synthétique est une nouvelle approche dans le traitement du cancer4,5. Étant donné que SPOPP-3 (1) est un puissant inducteur de l'arrêt G2/M, il a le potentiel d'être utilisé en combinaison avec des inhibiteurs du point de contrôle G2/M pour déclencher une catastrophe mitotique qui est actuellement considérée comme une stratégie de traitement favorable pour améliorer la mort cellulaire soit par apoptose, nécrose ou autophagie1,2,3,4,5. En particulier, dans la plupart des cas de mélanome où la transition G1/S médiée par la voie cycline-CDK4 est défectueuse et a une dépendance accrue au point de contrôle G2/M pour induire l'arrêt du cycle cellulaire lorsqu'il est exposé à des dommages à l'ADN, SPOPP-3 (1) peut avoir un avantage supplémentaire en combinaison avec les inhibiteurs de G2/M4. Deuxièmement, nous avons trouvé que SPOPP-3 (1) est un inducteur de nécrose. Plusieurs lignes d'investigations ont fourni des preuves à l'appui du rôle de la nécrose dans l'amélioration de l'immunothérapie du cancer et en tant que stratégie possible pour surmonter la résistance des cellules cancéreuses à l'apoptose33,34. À cette fin, il sera important d'évaluer si SPOPP-3 (1) a une telle capacité à induire des processus pro-inflammatoires en libérant des modèles moléculaires associés aux dommages tels que la protéine de groupe 1 à haute mobilité (HMGB1), un marqueur de nécrose. . La libération de ces facteurs dans la matrice extracellulaire peut conduire à l'activation des leucocytes CD8+ et favoriser l'immunité anti-tumorale34.

Il est également important de déchiffrer davantage le mécanisme par lequel SPOPP-3 (1) arrête les cellules en phase G2/M. Par exemple, il a été démontré que les dérivés de la pipérazine génèrent des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules35. Par conséquent, il serait intéressant d'étudier si SPOPP-3 (1) peut générer des ROS conduisant à des dommages oxydatifs à l'ADN et à un arrêt ultérieur en phase G2/M. En termes de nécrose, l'un des modes de mort cellulaire détectés dans les cellules traitées avec SPOPP-3 (1), il est devenu de plus en plus clair que la nécrose n'est peut-être pas simplement un processus cellulaire incontrôlé, mais plutôt une voie régulée communément appelée nécroptose36. Il a également été rapporté que la nécroptose augmentait les métastases cancéreuses dans certaines lignées cellulaires37. La dualité de la nécroptose étant anti- et pro-tumorigène nécessite encore une enquête pour déterminer dans quel contexte la nécroptose est bénéfique. Puisque nous avons trouvé une activité anti-proliférative respectable de SPOPP-3 (1) contre un large panel de lignées cellulaires cancéreuses, il serait essentiel d'étudier plus avant le mode de mort cellulaire dans différentes lignées cellulaires.

En conclusion, nous décrivons la synthèse et la caractérisation biochimique d'un dérivé spécifique de la dispiropipérazine appelé SPOPP-3 (1) avec une forte activité anti-proliférative contre un large panel de lignées cellulaires cancéreuses humaines. SPOPP-3 (1) est capable d'induire des dommages à l'ADN, l'apoptose, la nécrose, arrête le cycle cellulaire en phase G2/M et perturbe le positionnement normal du fuseau mitotique. Cette étude a jeté les bases du développement ultérieur de SPOPP-3 (1) pour une utilisation possible comme outil chimique pour perturber et comprendre les processus cellulaires, ainsi que comme composé anticancéreux potentiel. Pour ce dernier, SPOPP-3 (1) devrait être exploré dans une approche de létalité synthétique et en tant que composé anticancéreux induisant une nécrose.

Nous avons adopté la méthode décrite précédemment pour synthétiser la spiro[2′,3]-bis(acénaphtène-1′-one)perhydrodipyrrolo-[1,2-a:1,2-d]-pyrazine (SPOPP-3, 1)15 ,16. Un mélange d'acénaphtènequinone (1,822 g, 10 mmol) et de l-proline (1,151 g, 10 mmol; Sigma-Aldrich) a été dissous dans du méthanol (200 ml) et chauffé à 35 ° C pendant 3 h. La réaction a été contrôlée par chromatographie sur couche mince (TLC) en utilisant de l'acétate d'éthyle : hexane (1 : 2 ; v/v), et les spots ont été visualisés en utilisant la lumière UV (254 nm). Typiquement, un précipité orange s'est formé pendant la première heure qui a viré à une couleur brun orangé après une heure supplémentaire et à une couleur brun foncé après la fin de la réaction. Le solvant a été éliminé sous pression réduite, laissant une poudre brun foncé (1,722 g). Le produit brut, contenant à la fois SPOPP-3 (1) et SPOPP-5 (2), a été mélangé avec 2 g de silice normale dans 200 ml de méthanol. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le mélange de silice a été chargé à sec sur une colonne. Une purification par chromatographie flash, utilisant de la silice en phase normale (50 g) et un mélange 9:1 d'hexanes et d'acétate d'éthyle à un débit de 12 mL/min, a été utilisée pour isoler un mélange de SPOPP-3 (1) et de SPOPP -5 (2). Une purification ultérieure avec trois cycles de Chromatographie éclair employant un total de 686 mg de produit brut a été effectuée. Une bande orange éluée à 530–830 ml correspondant à Rf = 0,14 avec 9:1 (hexanes:acétate d'éthyle) a été séchée sous pression réduite pour produire 280 mg de SPOPP-3 semi-purifié (1). SPOPP-3 (1) a ensuite été purifié pour des tests biologiques par HPLC en utilisant une colonne Phenomenex Luna 5u Phenyl-Hexyl 4,60 mm × 250 mm. Un gradient de 80 à 92 % d'acétonitrile pendant 6 min à un débit de 2 mL/min a été utilisé comme éluant. Pour la SPOPP-3 semi-purifiée (1), un total de 12,5 mg a été injecté dans la HPLC et 5 mg (16 %) de SPOPP-3 purifiée (1) (à une rétention de 4,08 min) ont été obtenus. Une bande de couleur jaune éluant à 320–405 ml correspondant à Rf = 0,24 (hexanes: acétate d'éthyle 9: 1) a produit 120 mg de SPOPP-5 purifié (2). SPOPP-5 (2) a été purifié en utilisant les mêmes conditions HPLC que SPOPP-3 (1). Cent vingt mg de SPOPP-5 semi-purifié (2) ont été injectés en HPLC et 21 mg (3 %) de SPOPP-5 purifié (2) (à une rétention de 6,02 min) ont été obtenus. Des analyses HPLC-MS et RMN ont été utilisées pour confirmer l'identité de SPOPP-3 (1) et SPOPP-5 (2). Les spectres RMN 1D et 2D ont été enregistrés sur un spectromètre RMN Agilent/Varian Inova 400 MHz avec un tube RMN Kimble 5 mm (Rockwood, TN, USA) à l'Université de l'Alberta ou sur un spectromètre RMN Bruker 600 MHz avec une cryosonde à l'Université de Colombie britannique. Toutes les analyses HPLC ont été effectuées sur des systèmes Agilent 1260 Infinity avec détecteur UV, et la spectrométrie de masse a été effectuée à l'aide d'Agilent 6120 Single Quad MS.

Des cristaux irréguliers orange simples de SPOPP-5 (2) (50 mg) ont été recristallisés dans de l'acétonitrile (10 ml) par évaporation lente. Des cristaux ont été obtenus au jour 7. Un cristal approprié avec des dimensions de 0,22 × 0,20 × 0,11 mm3 a été sélectionné et monté sur un diffractomètre à détecteur de zone Bruker APEX II. Le cristal a été maintenu à un T constant = 90(2) K pendant la collecte des données. La structure a été résolue avec le programme de solution ShelXT38 utilisant des méthodes doubles et Olex239 comme interface graphique. Le modèle a été affiné avec XL38 en utilisant la minimisation complète des moindres carrés sur F2.

Toutes les lignées cellulaires ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection, à l'exception de HT29 (adénocarcinome du côlon) qui a été obtenue auprès du Dr Ranjana Bird de l'UNBC. Toutes les cellules ont été maintenues dans le milieu essentiel minimal de Eagle (Lonza), à l'exception des suivantes : MiaPaca-2 et Panc-1 ont été maintenues dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (Lonza), tandis que K562, KG1a et CEM ont été maintenus dans le milieu RPMI 1640 (Lonza). Tous les milieux ont été additionnés de 10 % de sérum bovin fœtal (Life Technologies Inc.) et d'antibiotiques.

Le test cytotoxique MTT a été utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire comme décrit précédemment40. En bref, les cellules ont été étalées à une densité de 1,5 × 103 cellules/puits dans des plaques à 96 puits. Après 24 h, les cellules ont été traitées avec SPOPP-3 (1) ou SPOPP-5 (2) pendant 48 h avec une plage de concentration de 0,16 à 100 µM. Les cellules ont été traitées avec la doxorubicine témoin positif de 0,003 à 0,8 µM. Toutes les données d'absorbance ont été exprimées par rapport au témoin, 0,1 % de DMSO, pris comme 100 % de viabilité cellulaire.

Les cellules SW480 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 3,0 x 105 cellules par puits, puis traitées le lendemain avec 20 µM SPOPP-3 (1), 20 µM SPOPP-5 (2), ou 2% DMSO pour 24h. Les lysats cellulaires ont été préparés comme décrit précédemment41. Pour l'analyse par immunotransfert, les échantillons de protéines ont été résolus sur un SDS-PAGE à 10 % et transférés sur une membrane de nitrocellulose. L'anticorps phospho H3 (Ser10) (D2C8, 1:1 000, Cell Signaling) a été utilisé avec une incubation d'une nuit à 4 °C. L'anti-GAPDH (G8795, clone GAPDH-71.1, 1:20 000, Sigma) a également été utilisé. IgM-HRP anti-souris (sc-2064, 1:4000, Santa Cruz Biotechnology), IgG-HRP anti-souris (W402B, 1:4000, Promega) et IgG-HRP anti-lapin (W401B, 1:4000, Promega ) ont été utilisés comme anticorps secondaires. Tous les transferts ont été visualisés avec le système FluorChem Q (ProteinSimple). L'analyse densitométrie a été réalisée à l'aide du logiciel AlphaView Q (ProteinSimple).

Les cellules ont été étalées à raison de 2,5 x 105 cellules/puits dans des plaques à 6 puits et traitées avec des composés comme décrit ci-dessus. Les cellules ont été trypsinisées puis centrifugées et lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate. Les cellules vivantes ont été colorées avec PE Annexin V et 7-AAD conformément aux instructions du fabricant pour le kit de détection d'apoptose I (BD Pharmingen) et analysées par cytométrie en flux à l'aide d'un trieur de cellules BD FACSMelody (BD Biosciences) et du logiciel BD FACSChorus (V 1.0). Pour l'analyse du cycle cellulaire, le kit de réactifs BD cycletest plus DNA a été utilisé pour colorer l'ADN et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo.

Les cellules SW480 ont été étalées dans des chambres en verre à couvercle à 4 puits à une densité de 15 × 104 cellules par puits avec 0, 5 ml d'EMEM. Les cellules ont été traitées avec les médicaments indiqués pendant 24 h avant la fixation en utilisant du méthanol à 100 % (-20 °C) pendant 10 min. Par la suite, les cellules ont été bloquées à l'aide de PBS avec 2 % de BSA et 0,1 % de Triton-x-100, puis colorées avec un anticorps α-tubuline (1:100 ; Ab4074 ; Abcam) ou un anticorps anti-cycline B1 (D5C10, 1:200, signalisation cellulaire ). L'anti-souris-AF594 et l'anti-lapin-AF 594 (1:200; Molecular Probes) ont été utilisés respectivement comme anticorps secondaires. Tous les anticorps utilisés ont été dilués dans du PBS avec 0,5 % de BSA et 0,1 % de Triton-x-100. Toutes les étapes de blocage et d'incubation des anticorps ont été réalisées pendant 1 h à température ambiante. Après chaque étape d'incubation d'anticorps, les cellules ont été lavées 3 fois (10 min chacune) avec un tampon de lavage contenant 0,1 % de Triton-x-100 dans du PBS. Pour l'immunofluorescence de la cycline B1, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante. Pour colorer l'ADN, les cellules ont été incubées avec du dichlorhydrate de DAPI (300 nM dilué dans du PBS) pendant 5 minutes après immunocoloration avec l'anticorps secondaire. Toutes les images de fluorescence ont été prises à l'aide d'un microscope inversé Zeiss Axio Observer Z1 avec platine motorisée, caméra mono Zeiss Axiocam 503, source de lumière LED multicolore Colibri 2, Plan-Apochromat 20×/0,8 M27 ou Plan-Apochromat 63×/1,4 Oil DIC M27 comme objectifs. Pour la quantification des cellules tétraploïdes, le signal DAPI dans chaque cellule a été quantifié dans chaque image en utilisant la fonction de région d'intérêt dans le logiciel Zen. Les cellules tétraploïdes ont été distinguées avec un signal DAPI double de celui des cellules restantes dans la même image. Trois images (chacune avec au moins 36 cellules) de chaque groupe ont été quantifiées. La population de cellules tétraploïdes positives à la cycline B1 a ensuite été déterminée dans chaque image et présentée sous forme de moyenne pour chaque groupe. Le sulfate de vinblastine et la colchicine (tous deux achetés auprès de Sigma) ont été inclus comme témoins positifs pour les toxines des microtubules.

Pour évaluer si le traitement SPOPP-3 cause des dommages à l'ADN, une méthode basée sur la PCR en temps réel à long terme (LORD-Q) a été utilisée avec des modifications26. Les cellules SW480 (2,5 × 106) ont été traitées dans des plaques à 6 puits avec du DMSO (témoin) ou du SPOPP-3 40 μM pendant les périodes indiquées avant d'être récoltées pour l'isolement total de l'ADN à l'aide du kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). La méthode LORD-Q a été réalisée en utilisant les ensembles d'amorces établis pour les amplicons longs et courts pour le gène de l'ADNmt26. Les efficacités de PCR ont été calculées en utilisant 37,5, 18,75, 9,375 et 4,688 ng d'ADN comme matrice par réaction de PCR. La réaction de rtPCR (volume total de 15 μL) consistait en 0,05 × colorant ResoLight, 1 × KAPA2G Fast Hot Start ReadyMix, 500 nM d'amorce directe et inverse et les quantités susmentionnées d'ADN isolé comme matrice. Pour l'amplification d'amplicons courts comme référence, Quantabio PerfeCTa® SYBR® Green FastMix® a été utilisé. L'analyse par PCR en temps réel a été effectuée à l'aide d'un système Bio-Rad CFX96 et l'analyse des données a été effectuée à l'aide du logiciel CFX Maestro. Le nombre de lésions par 10 kb a été calculé sur la base de l'équation précédemment établie26,42. Les données présentées sont moyennées à partir de 3 répétitions biologiques ± SEM

Les tests MTT cytotoxiques ont été effectués en triple (3 puits/traitement) et la lecture de l'absorbance du contrôle respectif a été prise comme une viabilité cellulaire de 100 %. Pour l'analyse par immunoblot, la densitométrie des bandes de phospho-histone H3 a été normalisée à leurs bandes GAPDH respectives, puis exprimée par rapport au contrôle DMSO (pris comme 1,0). Une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle a été effectuée comme indiqué. Les données sont exprimées en moyenne ± SD et ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism version 8.0.2 (La Jolla, CA) ou du test t. Le test de Holm-Sidak a été utilisé pour l'analyse post-hoc. Une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Ce projet a été soutenu par le financement de la Subvention à la découverte du CRSNG (227158) au CHL, de la Fondation canadienne pour l'innovation (34711) au CHL et du BC Knowledge Development Fund (103970) au CHL. VL, MZ et JL ont été soutenus par les UNBC Research Project Awards.

Département de chimie et de biochimie, Faculté des sciences et de génie, Université du nord de la Colombie-Britannique, Prince George, BC, V2N 4Z9, Canada

Victor P. Liu, Wai-Ming Li, Jack Lofroth, Mehreen Zeb et Chow H. Lee

Département de chimie, Université de la Colombie-Britannique, Vancouver, BC, V6T 1Z1, Canada

Brian O.Patrick

Département des sciences physiques, Université MacEwan, 10700-104 Avenue, Edmonton, AB, T5J 4S2, Canada

Tina M. Bott

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VPL, WML et CHL ont conceptualisé et conçu l'étude. VPL a effectué la synthèse et les expériences pour préparer les Fig. 1, 3, 4, 6 et les Fig. S1–S11. WML a mené les expériences et préparé les Fig. 5, 7 et 8. BOP a mené les expériences de cristallographie aux rayons X et préparé la Fig. S11. VL, JL et CHL ont réalisé les tests MTT et préparé la Fig. 2 et le Tableau 1. MZ a réalisé certaines des expériences de cytométrie en flux et préparé la Fig. 6. CHL, WML et TMB ont assuré la supervision. CHL a rédigé la première ébauche du manuscrit et a géré les révisions du manuscrit. Le CHL a fourni des fonds et des installations de recherche. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Chow H. Lee.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Liu, VP, Li, WM., Lofroth, J. et al. Un dérivé spécifique de la dispiropipérazine qui arrête le cycle cellulaire, induit l'apoptose, la nécrose et les dommages à l'ADN. Sci Rep 13, 8674 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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Reçu : 16 mars 2023

Accepté : 25 mai 2023

Publié: 29 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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