Migration rhizobienne vers les racines médiée par FadL

Nov 19, 2023

The ISME Journal volume 17, pages 417–431 (2023)Citer cet article

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La migration de la rhizosphère au rhizoplane est un processus de sélection clé dans l'assemblage du microbiome racinaire, mais pas entièrement compris. Les membres de Rhizobiales sont surreprésentés dans le microbiome racinaire central des plantes terrestres, et nous rapportons ici un séquençage par transposon à l'échelle du génome des gènes de fitness du rhizoplan de Sinorhizobium fredii bénéfique sur le soja sauvage, le soja cultivé, le riz et le maïs. Il y avait peu de gènes impliqués dans la colonisation du rhizoplan à large spectre d'hôtes. Le mutant fadL dépourvu de transporteur d'acides gras présentait des taux de colonisation élevés, tandis que les mutations de l'exoFQP (codant pour les protéines membranaires dirigeant la polymérisation et la sécrétion des exopolysaccharides), mais pas celles des exogènes essentiels à la biosynthèse des exopolysaccharides, entraînaient des taux de colonisation gravement altérés. Cette variation n'était pas explicable par leur capacité de survie dans la rhizosphère et le rhizoplan, et la production de biofilm et d'exopolysaccharide associée, mais cohérente avec leur capacité de migration vers le rhizoplan, et la motilité de surface associée et le mélange d'AHL à détection de quorum (lactones N-acylées-L-homosérine) . Des preuves génétiques et physiologiques ont suggéré que FadL médiait l'absorption d'AHL à longue chaîne, tandis qu'ExoF médiait la sécrétion d'AHL à chaîne courte, ce qui affectait négativement la biosynthèse d'AHL à longue chaîne. Les mutants fadL et exoF avaient respectivement des AHL extracellulaires à longue chaîne élevés et appauvris. Un mélange synthétique d'AHL à longue chaîne imitant celui du mutant fadL peut améliorer la motilité de surface des rhizobiums. Lorsque ce mélange AHL a été repéré dans la rhizosphère, la migration vers les racines et la colonisation du rhizoplan de S. fredii ont été améliorées de manière diffusible. Ce travail ajoute de nouvelles parties gérant les AHL extracellulaires, qui modulent la migration bactérienne vers le rhizoplan. Le système FadL-ExoFQP est conservé dans les Alphaprotéobactéries et peut façonner la "vie familiale" de diverses rhizobactéries clés.

Malgré un catalogue d'espèces procaryotes de plus en plus important [1], peu de taxons sont globalement abondants dans les sols [2]. Les caractéristiques du sol jouent un rôle plus important que les génotypes végétaux dans la détermination de la composition des communautés bactériennes associées aux racines [3, 4]. Dans ce contexte, de nombreuses études ont en outre identifié un sous-ensemble de membres de la communauté qui sont associés de manière reproductible à une espèce végétale sur plusieurs sites géographiques de conditions différentes, comme le riz [5], les agrumes [6], la canne à sucre [7] et diverses légumineuses. espèce [8]. Les preuves disponibles soutiennent l'établissement d'un modèle en plusieurs étapes pour l'assemblage du microbiome racinaire, séquentiellement du sol en vrac à la rhizosphère, au rhizoplan à l'endosphère, dans lequel le rhizoplan est une porte de sélection [5, 9]. Ce schéma en plusieurs étapes a été largement décrit, mais les interactions gène-environnement sous-jacentes, qui façonnent la distribution et l'abondance des rhizobactéries dans différentes niches (sol en vrac, rhizosphère et rhizoplane), restent largement inexplorées [10, 11, 12]. Ce manque de connaissances empêche l'explication évolutive ultime de la "vie domestique" des rhizobactéries dans ces niches écologiques [12].

L'identification à l'échelle du génome des gènes de fitness du rhizoplan des rhizobactéries modèles a été considérablement accélérée par le test Tn-seq dans des conditions contrôlées [13, 14, 15, 16, 17, 18]. Cependant, les caractérisations fonctionnelles de ces gènes de fitness à différentes étapes de colonisation n'ont pas été abordées dans ces études à haut débit. Le modèle actuel de colonisation en plusieurs étapes implique une chimiotaxie vers les racines, l'attachement et la formation ultérieure d'un biofilm multicellulaire sur le rhizoplan, qui est étayé par des preuves cumulatives de génétique inverse de diverses rhizobactéries [19]. Les gradients chimiques des exsudats racinaires sont censés servir de conditions cruciales (par exemple, fonction de signalisation) et de ressources (valeur nutritionnelle), qui interagissent différemment avec les bactéries mobiles pour façonner le processus de migration vers la niche racinaire [20, 21]. Les ligands directement reconnus par les chimiorécepteurs bactériens sont pour la plupart inconnus [22], bien que la fonction chimioeffectrice ait été proposée pour les acides organiques, les glucides, les alcools de sucre, les acides aminés et les hormones végétales [23]. Lors de l'attachement au rhizoplan médié par diverses adhésines bactériennes [24], les bactéries mobiles transitent progressivement vers des formes sessiles, qui sont suivies par la croissance et la maturation de communautés bactériennes intégrées à la matrice (exopolysaccharides (EPS), eDNA, eRNA, protéines, lipides et autres biomolécules), c'est-à-dire le biofilm multicellulaire [25]. Le biofilm est le "foyer" de plusieurs cellules de la même espèce ou d'espèces différentes, qui communiquent entre elles via des signaux de détection de quorum hautement conservés N-acyl homosérine lactones (AHL) [26]. En revanche, il reste difficile de déterminer dans quelle mesure le processus de détection de quorum dépendant de la densité est impliqué dans la migration vers la niche racine [19, 27, 28]. Ceci est essentiel pour comprendre et concevoir l'assemblage du microbiome racinaire [29, 30].

Rhizobiales et Burkholderiales appartiennent au microbiome racinaire central des plantes terrestres [31, 32]. Ces ordres sont enrichis à la fois de rhizobiums bénéfiques associés aux légumineuses et de divers phytopathogènes [8], qui ont été intensivement étudiés pour leurs interactions moléculaires, post-colonisation du rhizoplan, avec les hôtes [33,34,35,36]. Les rhizobiums se caractérisent par leur infection intracellulaire et leur fixation d'azote dans les cellules nodulaires des légumineuses [33], et peuvent être considérés comme un pionnier du microbiote racinaire des légumineuses. Cette symbiose inter-règne distincte est initiée par la détection spécifique des flavonoïdes de légumineuses par le régulateur transcriptionnel rhizobial NodD et l'activation ultérieure d'autres gènes nod impliqués dans la biosynthèse des lipochitooligosaccharides (appelés facteurs Nod), qui sont à leur tour spécifiquement reconnus par le récepteur de l'hôte pour induire infection en aval et morphogénèse des nodules [36]. Les flavonoïdes ont également été proposés comme chimioeffecteur pour la rhizobium sur la base d'études antérieures [20], qui ont récemment été remises en question avec de nouvelles preuves de cosolvants habituellement utilisés pour dissoudre les flavonoïdes [37]. De plus, les rhizobiums sont signalés de manière récurrente comme endophytes de diverses espèces végétales, et leurs effets favorisant la croissance des plantes sur des céréales telles que le riz [38, 39], le blé [40, 41] et le maïs [42] ont été démontrés. Bien que les interactions moléculaires entre les rhizobiums et leurs hôtes après la colonisation du rhizoplan aient été intensivement étudiées [34, 36], on ne sait toujours pas comment les rhizobiums bénéfiques colonisent avec succès diverses plantes terrestres.

Pour étudier les machineries rhizobiennes impliquées dans la colonisation du rhizoplan à large gamme d'hôtes, nous nous sommes concentrés sur Sinorhizobium fredii qui est un microsymbionte facultatif à large gamme d'hôtes de diverses espèces de légumineuses [43, 44]. Tn-seq a été utilisé pour l'analyse à l'échelle du génome des gènes de colonisation du rhizoplan de S. fredii CCBAU25509 (ci-après SF2) sur le soja sauvage (Glycine soja W05), le soja cultivé (Glycine max cv. JD17), le maïs (Zea mays cv. ZD958) , et le riz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Cela a permis l'identification d'une liste robuste de gènes de colonisation du rhizoplan à large gamme d'hôtes. Dans cette liste, la génétique inverse a vérifié que des mutations dans fadL (codant pour un transporteur de membrane externe) et exoFQP (codant pour des protéines membranaires dirigeant la polymérisation et la sécrétion d'EPS) ont respectivement amélioré et altéré la capacité de colonisation du rhizoplan à large gamme d'hôtes. Les caractéristiques associées à la capacité de survie de la rhizosphère et du rhizoplan (EPS et production de biofilm) et à la migration vers les racines (natation et motilité de surface) ont été déterminées pour les mutants apparentés. Enfin, nous avons révélé que la compétence de colonisation du rhizoplan opposé entre les mutants fadL et exoFQP était cohérente avec leur capacité de migration contrastée vers les racines, et la motilité de surface associée et les AHL à longue chaîne de détection de quorum extracellulaires. La quantification de l'AHL nous a également permis de proposer un modèle de travail pour la migration vers les racines impliquant la modulation dépendante de FadL-ExoFQP de l'homéostasie extracellulaire de l'AHL à longue chaîne. Ce modèle a ensuite été vérifié dans une expérience de colonisation du rhizoplan en utilisant un mélange synthétique d'AHL à longue chaîne.

Les souches bactériennes et les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau S1, et les amorces sont présentées dans le tableau S2. Les rhizobiums ont été cultivés à 28 °C dans du milieu TY [45]. Les souches d'Escherichia coli ont été cultivées à 37 °C dans du milieu Luria-Bertani (LB). Agrobacterium tumefaciens a été cultivé à 28°C dans du milieu LB. Les concentrations d'antibiotiques ont été décrites précédemment [45, 46]. Le Bioscreen C (Oy Growth Curves Ab Ltd, Raisio, Finlande) a été utilisé pour déterminer les courbes de croissance des souches testées.

Pour construire des bibliothèques de mutants d'insertion de transposons saturés, le pSAM_Sf porté par le transposon marin dérivé de pSAM_Bt [47] a été introduit dans SF2 par conjugaison. Après croissance, le point d'accouplement a été gratté et remis en suspension dans une solution de NaCl à 0,85 %. Ce mélange de conjugaison (100 µL par plaque) a ensuite été étalé sur 600 plaques de gélose TY (90 × 90 mm) contenant de l'acide nalidixique (30 μg/ml), du triméthoprime (10 μg/ml) et de la kanamycine (50 μg/ml) en utilisant des billes de verre et incubées pendant 3 jours à 28 °C. Environ 600 000 colonies ont été récoltées générant la bibliothèque de mutants d'insertion de transposon d'entrée pour des expériences ultérieures. Trois bibliothèques indépendantes ont été construites et directement utilisées dans trois expériences indépendantes.

Des graines de soja sauvage, de soja cultivé, de riz et de maïs ont été traitées avec de l'éthanol à 95 % pendant 30 s et stérilisées en surface dans une solution de NaClO à 17 % (wt/vol) pendant 3 min (avec des graines de soja sauvage prétraitées par de l'acide sulfurique concentré pendant 30 s). 3 min), puis lavé cinq à sept fois avec de l'eau déionisée autoclavée et germé sur des plaques de gélose à 0,8% à 28 ° C dans l'obscurité pendant 48 h. Pour minimiser les faux négatifs dans le dépistage génétique de la condition physique, la bibliothèque d'entrée a été remise en suspension dans une solution saline à 0,85 % à OD600 = 1. La bibliothèque d'entrée a été inoculée sur le papier filtre de la boîte de culture de plantes (0,8 % d'agar ; milieu de solution nutritive à faible teneur en N [45 ]). Dans le même temps, des semis âgés de 2 jours ont été transférés dans ces boîtes de culture. Les racines ont ensuite été récoltées à 7 dpi (jours après l'inoculation), regroupées, pesées, lavées 5 fois avec une solution de NaCl à 0,85 % et mises en suspension pour 10 g dans 15 ml de solution de NaCl à 0,85 %. Après un traitement par ultrasons (50 Hz, 30 s deux fois), la suspension a été incubée dans 200 ml de milieu TY avec des antibiotiques pendant 32 h pour faciliter la construction de la bibliothèque Tn-seq pour ces échantillons de rhizoplane (WS7d, CS7d, R7d et Z7d). Les échantillons de contrôle comprenaient des cultures TY de 32 h de la bibliothèque d'entrée (TY) et les cultures TY de papiers filtres prélevés dans la boîte de culture de plantes à 1 hpi (heure après l'inoculation; F1h) ou 7 dpi (F7d). Trois bibliothèques indépendantes d'insertion de transposons marins ont été utilisées comme bibliothèques d'entrée dans trois expériences indépendantes (Fig. 1).

Trois bibliothèques indépendantes d'insertion de transposons marins de S. fredii CCBAU25509 (SF2) ont été utilisées comme inoculants d'entrée dans trois expériences indépendantes. Leurs échantillons 1h-post-inoculation (F1h) et 7d-post-inoculation (F7d) sur le filtre de la boîte de culture végétale ont été utilisés comme échantillons de contrôle pour ces échantillons de rhizoplane de quatre espèces de plantes test (CS7d, WS7d, R7d et Z7d) . Pour faciliter la construction de la bibliothèque Tn-seq, tous les échantillons de sortie ont été soumis à une culture dans le milieu riche TY pendant 32 h, et les bibliothèques d'entrée ont été cultivées dans les mêmes conditions que le contrôle (TY).

L'ADN des échantillons collectés a été extrait à l'aide d'un kit d'ADN TIANamp Bacteria (Tiangen) et soumis à une fragmentation enzymatique avec MmeI (New England Biolabs). Environ 3 μg d'ADN qualifié ont été digérés avec 3 μl (6 unités) de MmeI dans un volume total de 200 μL pendant 2,5 h à 37 °C. Ensuite, 2 ul de phosphatase alcaline intestinale de veau (CIP; New England Biolabs) ont été ajoutés et le système réactionnel a été incubé pendant 1 h à 37 ° C. Les adaptateurs double brin avec différents codes à barres ont été ligaturés aux fragments de restriction purifiés à l'aide d'un kit de purification QIAquick PCR (Qiagen) et incubés pendant une nuit à 16 ° C. Les sites d'insertion de transposons flanquant les séquences ont été enrichis par PCR à l'aide d'amorces Universal et P7-Tn et de l'ADN polymérase Q5 (New England Biolabs) (2 min à 98 ° C; 22 cycles à 98 ° C pendant 10 s, 72 ° C pendant 25 s , et 72 °C pendant 30 s ; suivi d'une extension finale à 72 °C pendant 5 min). Les produits de PCR ont été exécutés sur un gel d'agarose à 1,8 % et purifiés à l'aide d'un kit d'extraction de gel QIAquick (Qiagen). L'ADN a été quantifié avec un Nanodrop et soumis à un séquençage à une seule extrémité sur la plateforme NextSeq 550AR (ANORAD Gene Technology Co., Ltd).

Les lectures brutes ont été filtrées à l'aide de fqgrep (https://github.com/indraniel/fqgrep) pour identifier l'adaptateur et le transposon, et le transposon adjacent à l'ADN génomique a été extrait. Bowtie a été utilisé pour mapper les lectures sur le génome SF2 [48], générant un fichier de sortie .sam qui a ensuite été utilisé pour produire un fichier au format .wig de l'ADN génomique aligné à l'aide de resume_mappings.py (https://github.com/elijweiss/ Tn-seq). Les fichiers .wig résultants ont été analysés par la méthode "Resampling" de TRANSIT avec la méthode de normalisation TTR (trimmed total reads) [49]. Seules les insertions dans les ORF de 5 à 95 % ont été prises en compte pour minimiser l'effet potentiel des insertions non perturbatrices [50]. Des bibliothèques d'entrée individuelles ou des échantillons F1h ont été utilisés comme témoins.

Pour vérifier les résultats de Tn-seq, des gènes représentatifs ont été mutés par insertion de dérivés de pCM351 [51] portant un fragment interne de gènes cibles individuels avec des amorces répertoriées dans le tableau S2. Tous les dérivés de pCM351 ont été vérifiés par séquençage Sanger, puis conjugués dans SF2. Pour la suppression dans le cadre de fadL, exoF, traI, sinI et flaA dans SF2 ou divers arrière-plans, un kit de clonage d'assemblage transparent (Taihe Biotechnology, Pékin, Chine) a été utilisé pour construire des dérivés de pJQ200SK [52] comme décrit précédemment [53] , avec les amorces correspondantes répertoriées dans le tableau S2. Les plasmides modifiés corrects hébergés par des clones positifs ont été vérifiés par PCR et séquençage Sanger, puis conjugués dans des rhizobiums. Les clones à croisement unique résistants à la gentamicine ont ensuite été soumis à une contre-sélection pour les doubles recombinants en utilisant du saccharose à 5 %. Pour construire des souches mutantes complémentaires, les fragments contenant les séquences codantes correspondantes et les régions promotrices en amont ont été clonés dans pBBR1MCS-2 [54]. Les dérivés de pBBR1MCS-2 avec des séquences clonées correctes ont été introduits dans les rhizobiums par conjugaison. Pour générer des souches de S. fredii marquées GFP et mCherry, pRJPaph-bjGFP et pRJPaph-mChe [55] ont été administrés à S. fredii par conjugaison. Tous les mutants d'insertion, les mutants de délétion dans le cadre, les souches mutantes complémentaires et les souches étiquetées ont été vérifiés par PCR sur colonie et séquençage Sanger.

Pour déterminer l'occupation des nodules de rhizobium, les mutants ont été mélangés avec leurs souches parentales à 1: 1 (OD600 = 0,2) et inoculés sur des plantes hôtes cultivées dans de la vermiculite humidifiée avec le milieu de solution nutritive à faible teneur en N (les graines de luzerne ont été stérilisées en utilisant la même méthode que les graines de soja sauvage). À 30 dpi, les nodules ont été stérilisés en surface (éthanol à 95 % pendant 30 s et NaClO à 17 % pendant 3 min) et les isolats de nodules ont été identifiés par leur croissance sur des plaques TY avec les antibiotiques correspondants et par PCR avec des amorces ciblant des fragments spécifiques à la souche.

Pour l'expérience de colonisation du rhizoplan, le même système décrit pour la collecte d'échantillons de Tn-seq a été utilisé avec une densité d'inoculation réduite comme décrit ci-dessous. Les cultures de rhizobium d'une nuit ont été ajustées à une DO6oo de 0,2 dans une solution saline à 0,85 % qui a été utilisée comme inoculant. À 7 dpi, les unités formant colonies (UFC) dans les échantillons de rhizoplane ou sur le papier filtre ont été déterminées en incubant des échantillons dilués sur des plaques de gélose TY avec les antibiotiques correspondants. Pour déterminer la capacité de survie du rhizoplan des rhizobiums sur les racines de soja sauvage, des semis d'une longueur de racine de 3 cm ont été placés dans 300 µl de solution rhizobiale de DO600 = 0,2 pendant 10 s, puis séchés à l'air et transférés dans la boîte de culture de plantes. Les racines ont ensuite été récoltées à 1 hpi et 7 dpi, et les UFC dans les échantillons de rhizoplanes ont été déterminées comme décrit ci-dessus. Pour caractériser le processus de migration de la rhizosphère au rhizoplane, 2 µl de type sauvage ou mutants de DO600 = 0,8 (environ 1,6 × 106 UFC) ont été inoculés symétriquement à 1 cm, 2 cm, 3 cm et 4 cm de semis de soja sauvage dans la boîte de culture de plantes. À 7 dpi, les UFC dans les échantillons de papier filtre aux sites d'inoculation et les échantillons de rhizoplane ont été déterminés comme décrit ci-dessus. Cette procédure d'inoculation symétrique a également été utilisée pour tester l'effet diffusible des AHL à longue chaîne (2 µl de solution contenant 45 ng de 3-OXO-C12-HSL, 52 ng de C14-HSL et 1 μg de 3-OXO-C14-HSL) sur colonisation rhizoplanaire de SF2 ou de mutants (inoculant : environ 1,6 × 106 UFC), c'est-à-dire avec des positions d'inoculation des AHL et des bactéries variant à des distances symétriques des semis de soja sauvage.

La formation de biofilm a été déterminée comme décrit précédemment [56] avec des modifications. Des cultures TY d'une nuit de rhizobiums ont été centrifugées, lavées deux fois avec une solution de NaCl à 0,85 % et ajustées à DO600 = 0,1 dans TY. La culture résultante de 100 µl a été inoculée dans des plaques de microtitration en polystyrène à 96 puits (8 puits par souche) qui ont ensuite été scellées avec du parafilm et fixées pendant 48 h dans une chambre de croissance à 28 °C. La croissance bactérienne a été déterminée à OD600 sur un lecteur de microplaques. Les bactéries planctoniques ont été éliminées avec une pipette et les plaques ont été lavées 3 fois avec une solution de NaCl à 0,85 %. Les puits ont été vidés et colorés avec 150 µl de cristal violet à 0,1 % (p/v) pendant 10 min et rincés trois fois avec de l'eau distillée. La plaque de microtitration a été inversée sur les tissus pour éliminer tout excès de liquide et séchée à l'air. Le cristal violet restant a été solubilisé en ajoutant 150 µl d'éthanol à 95 % (v/v) et en incubant pendant 15 min. Enfin, 125 μl de la solution de cristal violet / éthanol de chaque puits ont été transférés dans une plaque à 96 puits et la DO590 a été mesurée avec un lecteur de microplaques.

Les exopolysaccharides (EPS) ont été purifiés et quantifiés comme décrit précédemment [57]. En bref, les bactéries ont été cultivées dans le milieu M9 pendant 5 jours et récoltées, et la DO600 a été mesurée pour la standardisation. Le surnageant contenant les EPS a été obtenu par centrifugation (2449 g pendant 30 min) et la fraction de poids moléculaire élevé (HMW) a été précipitée en ajoutant un volume de 3:1 d'éthanol froid à 95 %. Le précipité de HMW a été recueilli par centrifugation (2449 g pendant 30 min) et sept volumes supplémentaires d'éthanol ont été ajoutés au surnageant obtenu pour précipiter la fraction de faible poids moléculaire. Ces deux fractions ont ensuite été lyophilisées et pesées.

Pour évaluer la nage des rhizobiums, des colonies bactériennes ont été transférées avec un cure-dent stérile au centre de plaques d'agar nageant (TY, 0,3 % d'agar avec du rouge Congo). Pour la motilité de surface, 2 µl de culture d'une nuit (OD600 = 0,8) des souches testées ont été inoculés au centre de la plaque de gélose de motilité de surface (TY, 0,5 % de gélose au rouge Congo). Les plaques ont été incubées face vers le haut à 28 ° C pendant 7 jours, et les diamètres maximaux d'une colonie de natation ou de motilité de surface correspondante ont été déterminés.

Pour tester la motilité de surface compétitive des mutants et du SF2, des mutants marqués mCherry et du SF2 marqué GFP ont été mélangés à différents ratios (10 %, 30 %, 50 %, 70 % et 90 %) et incubés sur des plaques de motilité de surface (TY , 0,5% agar) pendant 1 semaine. Pour tester la motilité de natation compétitive du mutant flaA marqué mCherry et du SF2 marqué GFP, deux souches ont été mélangées à un rapport de 1: 1 et inoculées au centre de la plaque d'agar nageant (TY, 0, 3% d'agar). Sept jours plus tard, chaque colonie a été observée avec un stéréomicroscope à fluorescence Leica (la source de lumière d'excitation : 488 nm pour la détection de SF2 marqué par GFP et 546 nm pour la détection de mutants marqués par mCherry).

Pour analyser l'effet des AHL à longue chaîne sur la motilité de surface des bactéries, chaque souche marquée mCherry a été mélangée à un rapport de 1: 1 avec sa souche non marquée correspondante à une concentration de OD600 = 0,8, puis inoculée avec une longue chaîne AHL (2 µl de solution bactérienne contiennent 45 ng de 3-OXO-C12-HSL, 52 ng de C14-HSL et 1 μg de 3-OXO-C14-HSL) au centre de la plaque de gélose de motilité de surface (TY, 0,5 % de gélose avec Rouge Congo). Sept jours plus tard, le diamètre de la colonie a été enregistré et des photos ont été prises avec un stéréomicroscope à fluorescence Leica (source de lumière d'excitation : 546 nm).

Agrobacterium tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) [46] a été utilisé comme souche indicatrice pour détecter les AHL extracellulaires des souches de S. fredii. Les souches d'essai ont été cultivées sur des plaques de motilité de surface avec ou sans x-gal pendant 3 jours, puis KYC55 (pJZ372) (pJZ384) (pJZ410) (OD600 = 0, 1) a été mis en boucle à l'extérieur de la colonie rhizobienne. À 4 dpi de KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410), les plaques contenant x-gal ont été photographiées et les plaques sans x-gal ont été utilisées pour la quantification de l'activité β-galactosidase de KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410 ) pour refléter le contenu AHL extracellulaire des rhizobiums.

Pour mesurer les AHL intra- et extracellulaires à chaîne courte et longue, les rhizobiums ont été incubés dans le milieu TY à 28 ° C pendant 32 h (phase stationnaire). Le surnageant contenant les AHL extracellulaires a été obtenu par centrifugation (2449 g pendant 30 min). Le culot a été lavé deux fois avec du NaCl à 0,85 %, remis en suspension, soniqué, puis centrifugé pour obtenir le surnageant contenant les AHL intracellulaires. Les échantillons résultants ont été extraits deux fois avec de l'acétate d'éthyle de qualité chromatographique en volumes égaux, et la phase organique a été évaporée. Les extraits ont été dissous dans 1 mL de méthanol:eau (1:1 v/v) contenant 0,1 % (v/v) d'acide formique et microfiltrés (0,22 µm). L'échantillon résultant de 1 µL a été injecté sur le système HPLC équipé d'une colonne TACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, granulométrie 1,8 µm) (Thermo Scientific, Waltham, MA. USA). Les éluants étaient l'acide formique à 0,1 % dans l'eau (solvant A) et dans l'acétonitrile (solvant B). Le débit a été fixé à 300 μL/min, le pourcentage du mélange est passé de 40 % de solvant B à 98 % de solvant B pendant les 9 premières minutes, maintenu pendant 2 min, puis la colonne est revenue aux conditions de départ. Toutes les molécules d'AHL ont un cycle sérine lactone élevé, qui forme un fragment caractéristique avec m/z de 102 en spectrométrie de masse HPLC [58]. Selon ce principe, la méthode HPLC-Q-Exactive-PRM a été établie. Les étalons analytiques (pureté > 99 %) de C8-HSL, 3-OXO-C8-HSL, C12-HSL, 3-OXO-C12-HSL, C14-HSL, 3-OXO-C14-HSL ont été achetés auprès de Sigma (Darmstadt , Allemagne). Les solutions à 1 ug/ml ont été diluées en série à 1/4, 1/16, 1/256 et 1/1024. Les analyses par spectrométrie de masse ont été effectuées sur une spectrométrie de masse à piège quadripolaire Q Exactive HF-X (Thermo Scientific, Waltham, MA. USA). Des expériences de balayage d'ions précurseurs ont été réalisées en mode ions positifs pour surveiller m/z 102.

Ce travail s'est concentré sur SF2 hébergeant un génome multipartite typique de Sinorhizobium (chromosome, chromide et plasmide de symbiose) [59]. Pour effectuer une enquête à l'échelle du génome sur les gènes de colonisation du rhizoplan de SF2 (Fig. 1), la bibliothèque de mutants d'entrée a été inoculée sur du papier filtre de boîte de culture de plantes, et les bibliothèques de mutants de sortie ont été collectées à partir de papiers filtres 1 h après l'inoculation (F1h) et 7 jours après l'inoculation (dpi ; F7d) et du rhizoplan du soja cultivé (CS7d), du soja sauvage (WS7d), du riz (R7d) et du maïs (Z7d) à 7 dpi. Pour faciliter la construction de la bibliothèque Tn-seq, toutes les bibliothèques de mutants de sortie ont été soumises à une culture de 32 h dans le milieu riche en TY, avec des bibliothèques d'entrée cultivées dans les mêmes conditions que le contrôle (TY). Tn-seq a révélé que la densité d'insertion de transposons dans trois échantillons d'entrée et 21 échantillons de sortie variait de 57, 03 à 86, 99% (tableau S3), qui sont au-dessus du seuil de densité d'insertion de 50% pour un bon ensemble de données Tn-seq [49]. Un effet de rhizosphère reproductible a été observé dans trois expériences indépendantes (Fig. S1), c'est-à-dire que les échantillons de rhizoplane (CS7d, WS7d, R7d et Z7d) formaient systématiquement des grappes distinctes par rapport à celles de TY, F1h et F7d. Une signature considérable de trois bibliothèques d'entrée indépendantes a également été identifiée (Données S1, Données S2 et Fig. S1). Ces résultats soulignent que les variations stochastiques entre plusieurs bibliothèques d'entrée indépendantes doivent être prises en compte avant de tirer des conclusions sur la forme physique des gènes, qui a été largement négligée dans les études antérieures basées sur une seule bibliothèque d'entrée [49].

Sur la base des scores de fitness génétique des échantillons de rhizoplan (CS7d, WS7d, R7d et Z7d) par rapport aux ensembles de données F1h correspondants (Fig. S2A; Données S2), 93, 91, 127 et 206 gènes ont été identifiés comme gènes de colonisation du rhizoplan pour les plantes tests de le soja cultivé, le soja sauvage, le maïs et le riz, représentant respectivement 1,4 à 3,1 % du génome SF2 (valeurs p < 0,01). Cette gamme est similaire à celles rapportées pour les gènes de colonisation du rhizoplan chez Sinorhizobium meliloti (2%) [60], Rhizobium leguminosarum bv. viciae (2,9 %) [17], Agrobacterium tumefaciens (2,9–4 %), [18], Pseudomonas aeruginosa (1,6 %) [15], Pseudomonas simiae (2 %) [13], Pseudomonas sp. WCS365 (3,8 %) [14], Azoarcus olearius (2,2 %) et Herbaspirillum seropedicae (2,7 %) [16]. Parmi ces gènes de fitness du rhizoplan, 8, 8, 21 et 82 gènes étaient spécifiques au soja cultivé, au soja sauvage, au maïs et au riz, respectivement (Fig. S2A et Données S2.1). De plus, 43 gènes ont été identifiés de manière reproductible comme gène de colonisation du rhizoplan dans trois expériences indépendantes pour au moins une espèce de plante test (Fig. S2B et données S2.2), qui ont donc été considérées comme une liste solide de gènes de colonisation du rhizoplan pour une enquête plus approfondie. . Les échantillons de contrôle des papiers filtres (F7d) formaient un groupe distinct par rapport aux échantillons de rhizoplane dans l'analyse de groupement hiérarchique (Fig. S2B). Puisqu'un bruit notable a été observé pour c09590 dans les ensembles de données R7d.3 et Z7d.3, un mutant c09590 a été construit et co-inoculé avec SF2 à un rapport de 1: 1 dans les mêmes conditions que celles utilisées pour la collecte d'échantillons Tn-seq. De plus, un mutant pour c04390 a également été construit et utilisé comme contrôle positif dans la même expérience. Les mutants c09590 et c04390 présentaient une capacité de colonisation du rhizoplan à large gamme d'hôtes significativement altérée par rapport à SF2 (valeurs p <0, 001; Fig. S3), ce qui corrobore les résultats de Tn-seq (Fig. S2B).

Il y avait 41 gènes sur 43 apportant une contribution positive à la colonisation du rhizoplan. Ces gènes sont impliqués dans la réparation de l'ADN (UvrA) et des protéines (Pcm), la traduction (YchF et LepA), la respiration (sept protéines liées au cytochrome C), le métabolisme des phosphonates (PhnP), l'activité antioxydante (SodA), l'absorption du fer ferrique (c03990 et c04080) et oligopeptide (b57060, b57070 et b57080), fixation des lipoprotéines (c19900), sécrétion d'EPS (ExoF, ExoP et ExoQ), anabolisme du tryptophane (TrpA, TrpB, TrpD et TrpE), glutamate ( GltA, GltB et ArgD), leucine (LeuA et LeuB), méthionine (MetA), IMP (PurC et PurF), AMP (PurA) et dUMP (Dcd). Dans cette liste de gènes, des homologues de 22 gènes ont également été identifiés comme acteurs de la colonisation du rhizoplan (Données S2.2) chez S. meliloti-alfalfa [60], P. simiae-Arabidopsis thaliana [13], Pseudomonas sp. WCS365-A. thaliana [14], P. aeruginosa-maïs [15], A. olearius/H. seropedicae-Setaria viridis [16], R. leguminosarum-pois [17] ou des couples Agrobacterium tumefaciens-tomate [18]. En revanche, les gènes codant pour un facteur anti-sigma putatif (RsbU) et le seul transporteur hydrophobe connu de la membrane externe FadL [61, 62, 63, 64] ont régulé négativement la colonisation du rhizoplan de SF2, le fadL ayant un effet plus fort (Fig. S2B) . Dans une récente étude Tn-seq des gènes de colonisation d'Aquitalea magnusonii sur la plante entière flottante de la lentille d'eau, les mutants fadL ont été enrichis dans le pool de sortie indiquant un impact négatif sur la colonisation [65].

Ces 43 gènes de colonisation du rhizoplan ont une distribution biaisée des réplicons dans le génome multipartite SF2 : 81,4 % sur le chromosome, 18,6 % sur le chromide et 0 % sur le plasmide de symbiose. Ceci est cohérent avec les preuves de modélisation métabolique antérieures de S. meliloti montrant que le chromosome et le chromide de Sinorhizobium contribuent à la forme physique de la rhizosphère [66], tandis que le plasmide de symbiose codant pour les gènes est principalement impliqué dans l'établissement et le maintien de la symbiose fixatrice d'azote avec les légumineuses [59]. Néanmoins, une optimisation symbiotique par les gènes chromosomiques et chromides a été rapportée [34, 67, 68], parmi lesquels les gènes de biosynthèse EPS sur chromide ont été étudiés de manière intensive en ce qui concerne leur rôle dans l'optimisation du processus d'infection de Sinorhizobium sur les légumineuses [69, 70] et formation de biofilm in vitro [71]. Dans ce travail, parmi 8 gènes de chromides impliqués dans la colonisation du rhizoplan (Fig. S2B), exoF, exoP et exoQ codent pour des protéines membranaires dirigeant la polymérisation et la sécrétion d'EPS (Fig. 2A) [72, 73, 74, 75, 76, 77]. . Il était intuitivement inattendu que divers gènes de biosynthèse d'EPS au sein du même groupe de gènes exoF, exoP et exoQ ne soient pas essentiels à la colonisation du rhizoplan (Fig. 2B, C). Cela implique un modèle de travail selon lequel d'autres fonctions physiologiques inconnues d'ExoF, ExoP et ExoQ jouent un rôle plus important que la production d'EPS dans la colonisation du rhizoplan.

Une localisation subcellulaire prédite d'ExoP, ExoQ, ExoF et FadL. B Le groupe de gènes exo dirigeant la biosynthèse, le transport et la dégradation des exopolysaccharides dans SF2, et sa fréquence d'insertion de transposons dans trois expériences indépendantes (lignes) dans différentes conditions. Les résultats de fadL sont également présentés. C La voie prédite de la biosynthèse, du transport et de la dégradation des exopolysaccharides dans SF2. G-6-P glucose-6-phosphate, F-6-P fructose-6-phosphate, groupe Ac acétyle, Ac-CoA Acétyl-CoA, PEP phosphoénolpyruvate.

Comme décrit ci-dessus, parmi les gènes de fitness du rhizoplan à large gamme d'hôtes (données S2.2 et Fig. S2), les mutations de fadL ont conduit à des taux de colonisation du rhizoplan élevés exceptionnels, tandis que les mutations de l'exoFQP impliquaient la polymérisation et la sécrétion d'EPS, mais pas celles de exo gènes nécessaires à la biosynthèse des EPS, ont conduit à des taux de colonisation gravement altérés. Pour vérifier le rôle opposé de FadL et ExoFQP dans la colonisation du rhizoplan, des mutants de fadL, exoF, exoP et exoQ ont été construits. De plus, des mutants de cinq exogènes impliqués dans différentes étapes de la biosynthèse et de la dégradation des EPS ont été construits à des fins de comparaison : exoB (synthèse des précurseurs), exoY (amorçage de la glycosyltransférase), exoA (glycosyltransférase), exoZ (substitution) et exoK (dégradation des polysaccharides) ( figure 2C). Ces mutants ont été co-inoculés individuellement avec SF2 à un rapport de 1: 1 dans les mêmes conditions pour Tn-seq (Fig. 1). Leur capacité compétitive dans la colonisation du rhizoplan était généralement cohérente avec les résultats de Tn-seq. Le mutant fadL était plus compétitif que SF2 dans les traitements CS7d, WS7d et R7d (Fig. 3A; valeurs p <0, 001) mais impossible à distinguer de SF2 dans Z7d. En revanche, les mutants exoF, exoP et exoQ ont été surpassés par SF2 sur quatre espèces végétales (Fig. 3A; valeurs p <0, 001).

A Capacité de colonisation altérée du rhizoplan des mutants exoF, exoQ et exoP et augmentation des performances du mutant fadL. Les mutants de test ont été co-inoculés individuellement avec la souche de type sauvage SF2 à un rapport de 1: 1 dans les mêmes conditions que celles utilisées pour Tn-seq (Fig. 1; 1 ml d'inoculant de DO600 = 0, 2 ici). B Occupation altérée des nodules, sur les légumineuses cultivées dans la vermiculite, par les mutants exoF, exoQ, exoP et augmentation des performances des mutants fadL. Le SF2 de type sauvage (WT) forme des nodules efficaces sur Glycine soja (soja sauvage W05) mais pas sur Glycine max cv. JD17 (soja cultivé), tandis que son mutant rhcV peut établir des nodules efficaces sur JD17. Les mutants fadL des souches S. meliloti SM01290 (CCBAU01290 ; BioSample : SAMN02388829) et SM2011 (BioSample : SAMN02603522) ont également été testés sur leur hôte Medicago sativa (luzerne). Une différence significative dans la colonisation compétitive du rhizoplan et l'occupation des nodules entre les mutants individuels et WT est indiquée (test t pour un échantillon ; moyenne théorique = 0,5 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). Les barres d'erreur représentent le SD de trois répétitions biologiques (les nodules de plus de 15 plantes ont été analysées et le nombre de nodules de test est indiqué).

Les mutants exoY, exoA, exoZ et exoK étaient impossibles à distinguer de SF2 dans les traitements CS7d, WS7d et R7d, tandis que les mutants exoY, exoZ et exoK ont montré une capacité de compétition altérée dans Z7d (33–43 % ; valeurs de p < 0,001 ), bien que dans une moindre mesure que les mutants exoF, exoP et exoQ (27-28%). L'exception notable était le mutant exoB qui a été surpassé par SF2 ici (Fig. 3A) alors qu'aucun épuisement des mutants exoB n'a été observé dans les données Tn-seq des échantillons de rhizoplane (Fig. 2B). ExoB, codant pour une UDP-glucose 4-épimérase, synthétise l'UDP-galactose [78] qui pourrait être fourni par d'autres mutants dans le mélange de la bibliothèque de mutants. Cette hypothèse est étayée par plusieurs éléments de preuve : (1) un gène cryptique uxe chez Sinorhizobium code pour une UDP-sucre 4-épimérase bifonctionnelle, catalysant les interconversions UDP-xylose/UDP-arabinose et UDP-glucose/UDP-galactose, et sa surexpression peut remplacer fonctionnellement exoB [79] ; (2) ce gène uxe est cependant généralement réprimé par le silencieux global MucR dans les souches sauvages de Sinorhizobium [79,80,81] ; (3) un nombre considérable d'insertions de transposons ont été observées dans deux copies de mucR (c08920 et a45250 ; 377-758 insertions par gène) dans les données Tn-seq d'échantillons de rhizoplane (données S1). Le défaut drastique de colonisation du rhizoplan du mutant exoB par rapport aux mutants exoY, exoA, exoZ et exoK (Fig. 4A) peut être dû au fait que l'UDP-galactose, synthétisé par ExoB, est un précurseur de plusieurs polysaccharides contenant du galactose. (lipopolysaccharides, succinoglycane et galactoglucane) [82].

A Aptitudes à la nage (à gauche, 0,3 % de gélose) et à la motilité de surface (à droite, 0,5 % de gélose) sur la plaque TY avec du rouge Congo. *, fissures notables dans les colonies des mutants exoQ, exoF et exoP. B, C Diamètre des colonies dans des conditions de nage (B) et de motilité de surface (C) comme indiqué en (A). D Images de stéréomicroscopie à fluorescence de la capacité de motilité de surface du mutant fadL (rouge) et du mutant exoF (rouge) par rapport au SF2 de type sauvage (WT ; vert) dans un mélange d'inoculant (mélangé dans différents rapports comme suit : 1:9 , 3:7, 5:5, 7:3 et 9:1). B, C Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les moyennes (± SEM ; ANOVA suivie du test de Duncan, alpha = 0,05 ; trois expériences indépendantes).

Étant donné que la nodulation compétitive entre les inoculants rhizobiens commerciaux et les rhizobiums indigènes est un problème de longue durée dans les pratiques agricoles [83], ces mutants ont été testés plus avant pour leur capacité d'occupation des nodules sur des plantes cultivées dans la vermiculite. Le SF2 de type sauvage peut former des nodules efficaces sur de nombreuses accessions de soja sauvage et certaines variétés locales de soja, mais pas sur certains cultivars de soja modernes [67, 84]. Lorsque ces mutants ont été inoculés sur des plants de soja sauvage, seul le mutant exoB a montré des défauts significatifs de nodulation et de performance symbiotique en ce qui concerne le poids sec des pousses (tableau S4). De plus, le mutant exoB a été totalement surpassé par SF2 dans une expérience de nodulation compétitive (rapport d'inoculation 1: 1; Fig. 3B). Les mutants exoF, exoP et exoQ ont également montré un défaut significatif d'occupation des nodules (13-17 % ; Fig. 3B), tandis que seul exoK, parmi les autres mutants exo, a montré une altération de l'occupation des nodules dans une moindre mesure (36 %) . Les mutants fadL (78 %) et exoZ (63 %) occupaient plus de nodules que SF2. Comme les mutants exoY, exoA, exoZ et exoK étaient tous impossibles à distinguer de SF2 en ce qui concerne la colonisation du rhizoplan sur les plants de soja sauvage (Fig. 3A), le rôle d'ExoZ et d'ExoK dans la nodulation compétitive peut ne pas être dû à leurs fonctions prédites dans la modification et l'EPS. dégradation [73, 85].

Nous avons précédemment rapporté que des mutations dans rhcV, codant pour un composant essentiel du système de sécrétion de type trois dans SF2, permettent une nodulation améliorée et des performances symbiotiques sur certains cultivars de soja commerciaux tels que JD17 [84, 86]. Lorsque fadL a été muté davantage dans le fond mutant rhcV, le double mutant rchV fadL présentait une occupation nodulaire plus élevée (61%) que le mutant rhcV sur JD17 (Fig. 3B; p <0, 01). Nous avons en outre testé les effets de la mutation fadL dans une souche modèle SM2011 [87] et une souche inoculante SM01290 [88] de S. meliloti associée à la luzerne. Ces deux mutants fadL occupaient plus de nodules que leurs souches de type sauvage SM2011 et SM01290 (Fig. 3B; 74–78%; valeurs p <0, 001). Collectivement, la capacité d'occupation des nodules contrastée entre le mutant fadL et les mutants exoF, exoP et exoQ correspondait à leur capacité de colonisation du rhizoplan opposé.

Afin de découvrir les traits potentiels associés à la capacité contrastée de colonisation du rhizoplan des mutants de test (Fig. 2 et Fig. 3A), leurs courbes de croissance (Fig. S4A), la production d'EPS (Fig. S4B), la formation de biofilm (Fig. S4C) , la nage et la motilité de surface (Fig. 4A–C) ont été comparées. Les mutants exo et fadL n'étaient pas significativement différents les uns des autres sur leurs courbes de croissance dans le milieu riche en TY (Fig. S4A). Tous les mutants exo, à l'exception d'exoZ, ont produit moins d'EPS (compositions de poids moléculaire élevé et faible; Fig. S4B), ce qui correspondait à leur capacité de formation de biofilm (Fig. S4C). Ces résultats appuient l'idée que l'EPS est un composant matriciel important du biofilm [25]. Notamment, les mutants exoF, exoP et exoQ ne se distinguaient pas des autres mutants exo à l'exception d'exoZ, et le mutant fadL avait une production d'EPS et une capacité de formation de biofilm similaires à celles de SF2 (Fig. S4B, C). Apparemment, ces caractéristiques des courbes de croissance, de l'EPS et de la production de biofilm ne pouvaient pas expliquer la variation observée dans la compétence de colonisation du rhizoplan des mutants fadL et exo (Fig. 2 et Fig. 3A). Cela est probablement dû au fait que le biofilm est le "foyer" de plusieurs cellules [25], parmi lesquelles certains membres de la famille (tels que certains mutants exo) peuvent co-coloniser efficacement le rhizoplan avec d'autres producteurs d'EPS dans le microbiote racinaire.

Compte tenu du rôle important de la motilité dans la migration vers les racines, la nage et la motilité de surface des mutants testés ont été comparées (Fig. 4A – C). Le mutant fadL avait une capacité de motilité de surface plus élevée que SF2 (Fig. 4C; ANOVA suivie du test de Duncan, alpha = 0, 05). Tous les mutants exo présentaient une motilité de surface inférieure concernant le diamètre des colonies sur la plaque semi-solide (gélose à 0,5 % avec du rouge Congo ; Fig. 4C) tandis que les mutants exoF, exoP et exoQ présentaient des fissures radiales notables dans leurs colonies (marquées par * dans Fig. 4A), qui n'ont pas été observés pour les autres mutants exo (Fig. 4A). La variation de la capacité de nage des mutants testés n'était cependant pas cohérente avec leur capacité de colonisation du rhizoplan (Fig. 4B). Pour vérifier davantage les phénotypes de motilité de surface contrastés, les mutants fadL ou exoF marqués GFP et mCherry ont été mélangés à différents rapports 1: 9, 3: 7, 5: 5: 7: 3 et 9: 1 (Fig. 4D ), et la capacité de motilité de surface supérieure et inférieure du mutant fadL et exoF, respectivement, a été démontrée pour tous les rapports d'inoculation. La capacité de motilité de surface des mutants fadL, exoF, exoP et exoQ peut être entièrement restaurée dans leurs souches mutantes complémentaires correspondantes (Fig. S5).

La littérature disponible suggère que la motilité de surface sur la plaque semi-solide d'essai (gélose à 0,5 %) peut être un essaimage dépendant du flagelle et/ou des processus de motilité indépendants du flagelle, par exemple des contractions dépendantes du pili, un glissement dépendant de l'adhésine et un glissement entraîné par la pression de croissance. cellules et facilitée par des facteurs supplémentaires (par exemple, surfactant, EPS et protéine de surface) d'une manière dépendante de l'espèce et des ressources [89, 90]. Dans ce travail, aucun gène connu sur le flagelle, le pilus ou l'adhésine n'a été trouvé dans la liste des gènes de fitness du rhizoplan à large hôte (Fig. S2 et données S2.2). Par exemple, lorsque quatre gènes flaA codant pour des sous-unités de filaments flagellaires ont été supprimés (Fig. S6A), le mutant flaA résultant a montré une altération de la capacité de nage dépendante du flagelle comme prévu (plaques TY avec 0, 3% d'agar; Fig. S6B – D; p <0, 01 ), mais était indiscernable avec SF2 en ce qui concerne la motilité de surface (plaques TY avec 0, 5% d'agar; Fig. S6B, D) et dans le test de capacité de colonisation du rhizoplan (Fig. S7). En bref, la variation de la motilité de surface, probablement des mécanismes de glissement et/ou d'autres mouvements inconnus, correspondait à la capacité de colonisation du rhizoplan opposé entre le mutant fadL et les mutants exoF, exoP et exoQ.

Les preuves mentionnées ci-dessus (Figs. 2–4) suggèrent une corrélation entre la capacité de motilité de surface et la colonisation compétitive du rhizoplan. Ici, nous avons en outre évalué la capacité de colonisation du rhizoplan de mutants individuels de fadL, exoF, exoP et exoQ, avec les souches exoY, exoA et SF2 comme témoins. Le mutant fadL a montré une capacité de colonisation du rhizoplan significativement plus élevée sur le soja sauvage, le soja cultivé, le riz et le maïs, tandis que les mutants exoF, exoP et exoQ, mais pas les mutants exoA et exoY, ont montré une altération significative de la colonisation du rhizoplan (Fig. 5A ; valeurs p < 0,001). En revanche, ces mutants ont montré une capacité de survie similaire sur le papier filtre de la boîte de culture en l'absence de plantes (Fig. 5A ; p > 0,05). Le nombre d'unités formant colonies (UFC) sur le rhizoplan a montré un schéma global dépendant de l'hôte (Fig. 5A), cohérent avec la variation des exsudats racinaires de différentes espèces de plantes [20] et leurs effets sur l'assemblage du microbiome racinaire [21]. Néanmoins, la capacité de colonisation du rhizoplan opposé entre le mutant fadL et les mutants exoF, exoP et exoQ n'était pas dépendante de l'hôte. Par conséquent, les expériences suivantes sur les effets de la rhizosphère n'ont été réalisées que sur une seule espèce végétale (soja sauvage).

Une capacité de colonisation Rhizoplane des souches individuelles. Filtre F sans plantes, soja sauvage WS, soja cultivé CS, riz R, maïs Z. B Survivabilité du Rhizoplane des souches individuelles sur les racines WS à 7 dpi (jours après l'inoculation). Des échantillons à 1 hpi (heures après l'inoculation) ont été utilisés à des fins de comparaison. Une différence significative par rapport à la souche sauvage SF2 (WT) est indiquée (test t ; ***, p < 0,001). Les barres d'erreur représentent l'écart-type de trois répétitions biologiques (non visibles pour ces petites valeurs d'écart-type).

La variation observée dans les taux de colonisation du rhizoplan (Fig. 2, Fig. 3 et Fig. 5A) peut impliquer la capacité de survie dans la rhizosphère et sur le rhizoplan, et la migration de la rhizosphère au rhizoplan, qui n'a cependant pas été bien abordée dans les études Tn-seq publiées. des gènes de colonisation du rhizoplan [13,14,15,16,17,18]. Les mutants exo et fadL testés n'ont pas montré de défaut de croissance dans le milieu riche en TY (Fig. S4A) et de défaut de capacité de survie sur du papier filtre de boîtes de culture de plantes (Fig. 5A), mais on ne savait pas si cela serait vrai sur rhizoplane. Pour répondre à cette question, les souches d'essai ont été inoculées individuellement sur les racines des semis avant la plantation dans des boîtes de culture (Fig. 5B). Le nombre d'UFC sur rhizoplane à 7 dpi était significativement plus élevé pour le mutant fadL par rapport aux autres souches de test (SF2, exoY, exoA, exoQ, exoF et exoP ; valeurs de p <0,001), tandis que les mutants exo et SF2 n'étaient pas significativement différents les uns des autres (Fig. 5B). Ces résultats suggèrent que la capacité de survie du rhizoplan explique au moins partiellement la capacité supérieure de colonisation du rhizoplan du mutant fadL, mais n'est pas corrélée avec les défauts de colonisation des mutants exoF, exoP et exoQ.

Ces résultats ont en outre soulevé la question de savoir si la capacité de survie et la motilité de surface seraient les processus de la rhizosphère sous-jacents aux capacités contrastées de colonisation du rhizoplan parmi les mutants fadL, exoF, exoP et exoQ. Pour répondre à cette question, le mutant fadL ou exoF et SF2 ont été repérés individuellement à 1/2/3/4 cm des semis de manière symétrique (Fig. 6A). Les UFC au point d'inoculation et sur le rhizoplan ont été déterminées à 7 dpi. Pour toutes les souches, plus le site d'inoculation était éloigné des semis, plus le nombre d'UFC sur le rhizoplan était faible (Fig. 6B – E; barres grises), ce qui indiquait un schéma de décroissance de la distance pour les taux de colonisation du rhizoplan. Cela fournit une preuve directe d'un modèle spatial d'efficacité de l'interaction bactérie-racine, qui est pris pour acquis dans divers modèles d'effets de rhizosphère mais rarement testé [19, 20, 91]. Sur des sites de 1 à 4 cm, ces deux mutants n'ont montré aucune différence significative de capacité de survie par rapport à SF2 (Fig. 6B, C; valeurs p> 0, 05). Indépendamment de la capacité de survie sur ces sites, les mutants fadL et exoF avaient des UFC plus élevées (153 à 223 % de plus que SF2 ; valeurs p <0, 001 ; barres grises sur le panneau de gauche de la Fig. 6B) et plus faibles (75 à 98 % moins d'UFC que SF2; valeurs p <0, 001; barres grises sur le panneau de gauche de la figure 6C) taux de colonisation du rhizoplan, respectivement, par rapport à SF2 (barres grises sur les panneaux de droite de la figure 6B, C). Tous les phénotypes de la rhizosphère associés à ces deux mutants peuvent être restaurés dans leurs souches mutantes complémentaires correspondantes (Fig. 6D, E). Ces résultats sont cohérents avec leur capacité de motilité de surface contrastée (Fig. 4 et Fig. S5). Collectivement, la variation de la capacité de colonisation du rhizoplan parmi les mutants fadL et exoF et SF2 est principalement modulée par leur motilité de surface dans le processus de migration de la rhizosphère au rhizoplan.

Aperçu schématique AA montrant le test de capacité de survie de la rhizosphère du SF2 de type sauvage (WT ; vert) et de ses dérivés (rouge), qui ont été inoculés de manière symétrique à 1 cm, 2 cm, 3 cm et 4 cm des racines. B – E Les unités formant colonies (UFC) des sites d'inoculation (filtre) et du rhizoplan (racine) ont été testées à 7 dpi (jours après l'inoculation). Une différence significative par rapport à WT est indiquée (test t ; ***, p < 0,001). Les barres d'erreur représentent la SD de trois répétitions biologiques.

Les preuves disponibles suggèrent que l'homologue du transporteur d'acides gras à longue chaîne FadL chez S. meliloti peut favoriser l'absorption des AHL à longue chaîne (avec des chaînes acyles contenant au moins 12 carbones) [92], et que les AHL à longue chaîne peuvent fonctionner comme des biosurfactants facilitant motilité de surface de Rhizobium etli sur la plaque semi-solide (milieu mannitol extrait de levure avec 0,75% d'agar) [93]. Cependant, la mesure directe du mélange AHL du mutant fadL n'était pas encore disponible. Nous avons donc examiné le contenu extracellulaire des AHL dans SF2, des mutants de fadL et exo, et leurs souches mutantes complémentaires en utilisant une souche indicatrice AHL A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) [46] (Fig. 7A). Cette souche indicatrice, dépourvue de la capacité de biosynthèse de l'AHL, surexprime le récepteur AHL TraR qui peut activer l'expression de la fusion PtraI-lacZ lors de l'interaction avec des molécules AHL de différentes longueurs de chaîne, niveaux de saturation et états d'oxydation [46]. Sur la plaque de motilité de surface, le mutant fadL a fait A. tumefaciens KYC55 (pJZ372) (pJZ384) (pJZ410) exprimant plus de β-galactosidase que SF2 (Fig. 7B) et clivant ainsi plus de X-gal dans le produit bleu (Fig. 7A ). En revanche, les mutants exoQ, exoF et exoP avaient un niveau réduit d'AHL extracellulaires et les mutants exoY et exoA étaient similaires à SF2 (Fig. 7A, B). Les niveaux accrus et réduits d'AHL extracellulaires des mutants fadL et exoF/exoP/exoQ peuvent être restaurés dans leurs souches mutantes complémentaires dans des conditions de test (Fig. 7A, B). À notre connaissance [72, 73, 74, 75, 76, 77, 94], cela peut représenter le premier rapport sur l'implication du système de sécrétion d'EPS dans la modulation des AHL extracellulaires.

A Détection des AHL extracellulaires de rhizobia (colonie centrale) à l'aide du biocapteur A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) (cercle) sur la plaque TY (gélose à 0,5 %, rouge Congo et X-gal). B Activité β-galactosidase des cellules A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) recueillies à partir de (A). C Concentrations intra- et extracellulaires d'AHL déterminées à l'aide de l'approche HPLC-Q-Exactive-PRM-MS. NF, introuvable. Modèle de travail DA pour le transport des AHL à chaîne longue et courte via FadL et ExoFPQ intégrés dans les membranes. Une répression prédite de la biosynthèse des AHL à chaîne longue par les AHL à chaîne courte est présentée. Une différence significative entre les moyennes est indiquée en (B) (*, p < 0,05 ; ***, p < 0,001 ; test t) et (C) (différentes lettres entre parenthèses ; ANOVA suivie du test de Duncan, alpha = 0,05) basé sur trois expériences indépendantes. Les barres d'erreur représentent SEM (B) ou SD (C).

Pour mieux comprendre le mélange d'AHL associées aux mutants fadL et exoF, les AHL intra- et extracellulaires ont été déterminées à l'aide de l'approche HPLC-Q-Exactive-PRM-MS (Fig. 7C). Une petite quantité d'une AHL à chaîne courte 3-OXO-C8-HSL a été détectée à l'intérieur du mutant exoF, mais indétectable dans les cellules des autres souches testées. En revanche, aucune 3-OXO-C8-HSL extracellulaire n'a été détectée pour le mutant exoF, mais détectable pour les autres souches, parmi lesquelles la souche mutante complémentaire du mutant exoF avait plus de 3-OXO-C8-HSL extracellulaire que SF2 (ANOVA suivi du test de Duncan, alpha = 0,05). Le mutant exoF était également caractérisé par ses AHL intracellulaires inférieurs (3-OXO-C12-HSL, 3-OXO-C14-HSL et C14-HSL) et extracellulaires à longue chaîne (3-OXO-C12-HSL, C12-HSL , 3-OXO-C14-HSL et C14-HSL ; ANOVA suivie du test de Duncan, alpha = 0,05) que SF2. Sa souche mutante complémentaire avait des AHL extracellulaires à longue chaîne plus élevées que SF2 (C12-HSL, 3-OXO-C14-HSL et C14-HSL ; ANOVA suivie du test de Duncan, alpha = 0,05), tout en étant indiscernable de SF2 dans leur structure intracellulaire. AHL à longue chaîne. Collectivement, ces résultats suggèrent un modèle où ExoF est essentiel pour la sécrétion de la chaîne courte AHL 3-OXO-C8-HSL, dont l'accumulation intracellulaire dans le mutant exoF peut entraîner une régulation négative de la biosynthèse et du niveau extracellulaire de long- AHL en chaîne (Fig. 7D). Des efforts antérieurs montrent qu'un système d'efflux multidrogue MexAB-OprM de P. aeruginosa est impliqué dans la sécrétion active des AHL à longue chaîne, et que le système d'efflux BpeAB-OprB de Burkholderia pseudomallei est nécessaire pour la sécrétion d'AHL de différentes longueurs [95, 96 ]. On a émis l'hypothèse que les AHL à chaîne courte d'autres bactéries se diffusent librement à travers les membranes [97]. Apparemment, cette longue dernière hypothèse sur la diffusion passive des AHL, en particulier pour les AHL à chaîne courte, mérite des investigations plus approfondies.

Chez S. fredii, les gènes traI et sinI sont essentiels pour la biosynthèse des AHL à chaîne courte et longue, respectivement [98]. En effet, aucun 3-OXO-C8-HSL n'a été détecté à partir des mutants traI et traI exoF de SF2 (figure 8A). Les niveaux épuisés de AHL à longue chaîne intracellulaires (1, 7 à 4, 6% de SF2) et extracellulaires (25, 9 à 57, 4% de SF2) du mutant exoF (Fig. 7C) ont été considérablement restaurés par une suppression supplémentaire de traI (Fig. 8A; 58, 9 -87,7 % et 79,6-85,4 % pour les AHL intracellulaires et extracellulaires à longue chaîne, respectivement). De plus, le double mutant traI sinI, incapable de produire des AHL endogènes (Fig. 8A), a accumulé moins de 3-OXO-C8-HSL intracellulaire que le triple mutant traI sinI exoF en présence de 100 ng/ml de 3-OXO-C8 exogène. -HSL (Fig. 8B). Collectivement, ces résultats confirment le rôle important d'ExoF dans la sécrétion des AHL à chaîne courte et que l'accumulation intracellulaire d'AHL à chaîne courte module négativement la biosynthèse des AHL à longue chaîne (Fig. 7D).

A Concentrations intra- et extracellulaires d'AHL déterminées à l'aide de l'approche HPLC-Q-Exactive-PRM-MS. NF introuvable. Différentes lettres indiquent des différences significatives entre les moyennes (± SD, trois expériences indépendantes) basées sur l'ANOVA suivie du test de Duncan, alpha = 0,05. B AHL intracellulaires à chaîne courte de mutants traI sinI et traI sinI exoF en présence de 100 ng/ml de 3-OXO-C8-HSL exogène. C AHL intracellulaires à longue chaîne des mutants traI sinI et traI sinI fadL en présence de 100 ng/ml de 3-OXO-C14-HSL exogène. D–F Les AHL exogènes à longue chaîne améliorent la capacité de migration des rhizobiums vers les racines (2 μl de solution AHL à longue chaîne, contenant 45 ng de 3-OXO-C12-HSL, 52 ng de C14-HSL et 1 μg de 3-OXO-C14-HSL , selon la composition d'AHL extracellulaire détectée à partir du mutant fadL sur la figure 7C). Aperçu schématique DA de la conception expérimentale montrant l'inoculation de rhizobiums (WT/mutants) et d'AHL (ou 0,8 % de NaCl comme contrôle négatif) à des distances symétriques à la racine. E, F Les AHL à longue chaîne améliorent la colonisation du rhizoplan par WT (E), les mutants traI sinI et exoF (F). Les différences significatives entre les moyennes (± SEM, trois expériences indépendantes) sont indiquées dans (B–F) (*, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; test t).

En revanche, le mutant fadL avait un niveau intracellulaire d'AHL similaire à celui de SF2, tout en étant caractérisé par les AHL extracellulaires à longue chaîne les plus élevées (Fig. 7C; ANOVA suivie du test de Duncan, alpha = 0, 05). Les niveaux intra- et extracellulaires d'AHL à chaîne courte 3-OXO-C8-HSL étaient similaires entre le mutant fadL et SF2. Le niveau extracellulaire des AHL à longue chaîne du mutant fadL peut être restauré dans sa souche mutante complémentaire (Fig. 7C). De plus, le triple mutant traI sinI fadL présentait un défaut significatif d'absorption de 3-OXO-C14-HSL par rapport au double mutant traI sinI en présence de 100 ng / ml de 3-OXO-C14-HSL exogène (figure 8C). Ces résultats fournissent des preuves plus perspicaces pour soutenir l'hypothèse de FadL en tant que système d'absorption des AHL à longue chaîne [92] (Fig. 7D).

Apparemment, la capacité de colonisation du rhizoplan et la motilité de surface contrastées parmi les mutants fadL et exoF et SF2 sont en accord avec leurs variations dans le mélange d'AHL extracellulaires. Il a été démontré que les AHL à longue chaîne peuvent fonctionner comme des biosurfactants favorisant la motilité de surface de R. etli [93]. Nous nous sommes demandé si un mélange synthétique imitant la composition extracellulaire des AHL du mutant fadL améliorerait la motilité de surface et les taux de colonisation du rhizoplan de SF2 et de ses différents mutants. Ainsi, 3-OXO-C12-HSL (4,0 %), 3-OXO-C14-HSL (91,3 %) et C14-HSL 3 (4,7 %) ont été synthétisés et mélangés sous la forme d'un mélange d'AHL. Sur la plaque TY semi-solide (gélose à 0, 5%), ce mélange d'AHL a considérablement amélioré la motilité de surface des mutants SF2, flaA, exoF et traI sinI (Fig. S8; valeurs p <0, 001). Les mutants exoF, traI sinI et sinI (valeurs p <0, 001), mais pas les mutants flaA et traI, ont montré des taux de colonisation racinaire altérés dans les expériences d'inoculation symétriques (Fig. S7 et Fig. 6). Lorsque le mélange synthétisé d'AHL à longue chaîne a été inoculé symétriquement en tant que SF2, traI sinI et exoF à la même distance des racines (Fig. 8E, F), les taux de colonisation du rhizoplan de ces souches ont été significativement améliorés par rapport au témoin NaCl à 0, 8% (valeurs p < 0,05). Cet effet diffusible des AHL à longue chaîne était détectable à 1 cm, 2 cm, 3 cm ou 4 cm des racines (Fig. 8E, F). De plus, ce mélange AHL peut également améliorer de manière significative la capacité de survie de SF2 aux sites de 1 cm et 2 cm (Fig. S9; valeurs de p <0, 001). De même, le mutant fadL peut également améliorer la capacité de survie de SF2 lorsque ces deux souches ont été inoculées symétriquement de chaque côté des semis (Fig. 6B), bien que le mutant fadL, étant un surproducteur d'AHL extracellulaires à longue chaîne, était supérieur dans la colonisation du rhizoplan. . Notamment, le mutant sinI incapable de produire des AHL à longue chaîne (Fig. 8A) a montré un taux de colonisation du rhizoplan altéré dans l'expérience d'inoculation symétrique (Fig. S7), alors que d'abondants mutants sinI ont été identifiés sur le rhizoplan des plantes tests dans le Tn- écran suivant (Fig. S10). Le résultat Tn-seq était cohérent avec le fait que le mutant sinI était aussi compétitif que SF2 en termes de taux de colonisation du rhizoplan (sinI vs SF2 = 52% vs 48%; p> 0, 05) lorsqu'ils étaient inoculés sous forme de mélange 1: 1. Conformément à ces expériences de colonisation du rhizoplan, les mutants sinI ou traI sinI ont montré une motilité de surface altérée par rapport à SF2 et au mutant traI (Fig. S10B; valeurs p <0, 001), mais ce défaut de motilité de surface peut être récupéré lorsqu'ils ont été mélangés avec SF2 (Fig. S10C). Par conséquent, le défaut de colonisation du rhizoplan du mutant sinI n'était pas aussi important que celui du mutant dépourvu d'ExoF multifonctionnel dans un mélange inoculant contenant le SF2 de type sauvage.

L'ingénierie du microbiome racinaire pour l'agriculture durable en est encore à ses balbutiements, en grande partie en raison d'une compréhension limitée des mécanismes sous-jacents à l'assemblage du microbiome racinaire [20]. Il y a une attention croissante sur les mécanismes de colonisation du rhizoplan des espèces clés du microbiote racinaire. De récentes analyses pionnières de Tn-seq à l'échelle du génome révèlent davantage de gènes de fitness du rhizoplan [13, 14, 15, 16, 17, 18], dont les fonctions dans le processus de migration de la rhizosphère au rhizoplan n'ont pas été bien abordées. Ce travail s'est concentré sur une espèce bénéfique clé de voûte, S. fredii, et a réalisé une enquête Tn-seq à l'échelle du génome de ses gènes modulant positivement ou négativement la colonisation du rhizoplan sur le soja sauvage, le soja cultivé, le riz et le maïs (Fig. 1). Une liste robuste de gènes de colonisation à large gamme d'hôtes a été identifiée (Fig. S2). Nous nous sommes ensuite concentrés sur les fadL et exoF / exoQ / exoP exceptionnels avec des rôles négatifs et positifs, respectivement, dans la colonisation du rhizoplan à large gamme d'hôtes (Fig. 2 et Fig. 3). Les caractérisations génétiques inverses de ces quatre gènes et des exogènes associés impliqués dans la biosynthèse et la dégradation des EPS suggèrent que la capacité de colonisation du rhizoplan contrastée est médiée par la motilité de surface de la rhizosphère au rhizoplan, plutôt que par la nage, et la capacité de survie de la rhizosphère et du rhizoplan (Fig. 3 - Fig. 6 et figures S4 à S6). Avec d'autres analyses physiologiques des AHL à détection de quorum de ces souches (Fig. 7-8), nous avons révélé que FadL médie l'absorption des AHL à longue chaîne tandis que ExoF médie probablement la sécrétion des AHL à chaîne courte, et que l'accumulation de AHL à courte chaîne les AHL à chaîne dans les cellules du mutant exoF peuvent entraîner une régulation négative de la biosynthèse et un niveau extracellulaire inférieur d'AHL à longue chaîne (Fig. 7D). Par conséquent, les niveaux extracellulaires contrastés d'AHL à longue chaîne parmi les mutants fadL et exoF et SF2 sont conformes à la variation de leurs taux de colonisation du rhizoplan. Le rôle critique des AHL à longue chaîne dans le processus de migration de la rhizosphère au rhizoplane a été davantage vérifié par l'effet diffusible d'un mélange synthétique d'AHL à longue chaîne imitant celui du mutant fadL (Fig. 8E, F). Compte tenu de la large distribution des homologues FadL et ExoFQP dans les alphaprotéobactéries (Fig. S11), la régulation médiée par FadL-ExoFQP de la motilité de surface lors de la migration vers les racines peut être un mécanisme d'interaction gène-niche conservé au cours de l'évolution. Il façonne la "vie domestique" des rhizobactéries appartenant à cette classe qui comprend diverses espèces clés du microbiome racinaire. La procédure développée dans ce travail peut également être utilisée dans des études d'autres interactions bactérie-hôte. Ce travail et d'autres études à haut débit publiées sur les gènes de fitness du rhizoplan sont encore limités aux espèces clés de voûte bien connues dans des conditions de laboratoire bien contrôlées. Bien que les rôles écologiques de ces espèces clés dans les interactions sol-plante-microbiote aient été intensivement étudiés, les fonctions des gènes de fitness du rhizoplan ont rarement été testées davantage dans des conditions de sol complexes et fluctuantes qui interagissent de manière intensive et dynamique avec les plantes et le microbiote. Contrairement au cumul rapide des données métagénomiques liées à la recherche sur le microbiome racinaire, nos efforts de caractérisation fonctionnelle sont encore limités et les outils de génomique fonctionnelle à haut débit (par exemple, Tn-seq) devraient être encore améliorés et explorés dans diverses conditions de sol.

Les données de séquence brutes de notre analyse Tn-seq sont accessibles via NCBI Sequence Read Archive (PRJNA808870).

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Nous remercions le professeur Zengtao Zhong de l'Université agricole de Nanjing et le professeur Hongli Yuan de l'Université agricole de Chine pour avoir partagé et livré A. tumerfaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410). Ce travail a été soutenu par le programme national clé de recherche et de développement de Chine (numéro de subvention 2019YFA09004700), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de subvention 32070078), le projet innovant du State Key Laboratory of Agrobiotechnology (numéros de subvention 2020SKLAB1-5) et le 2115 Programme de développement des talents de l'Université agricole de Chine.

State Key Laboratory of Agrobiotechnology et College of Biological Sciences, China Agricultural University, Pékin, Chine

Yuan-Yuan Ji, Biliang Zhang, Pan Zhang, Liu-Chi Chen, You-Wei Si, Xi-Yao Wan, Can Li, Ren-He Wang, Yu Tian, ​​​​Ziding Zhang et Chang-Fu Tian

MOA Key Laboratory of Soil Microbiology, and Rhizobium Research Center, China Agricultural University, Pékin, Chine

Yuan-Yuan Ji, Biliang Zhang, Pan Zhang, Liu-Chi Chen, You-Wei Si, Xi-Yao Wan, Can Li, Ren-He Wang, Yu Tian et Chang-Fu Tian

Institut de biologie synthétique de Shenzhen (iSynBio) Institut de technologie avancée de Shenzhen (SIAT), Académie chinoise des sciences, 518055, Shenzhen, Chine

Pan Zhang

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CFT a conçu le projet. CFT et YYJ ont conçu la recherche. YYJ a réalisé toutes les expériences avec la contribution de PZ, LCC, YWS, XYW, CL, RHW et YT. YYJ et BLZ ont analysé les données Tn-seq avec la contribution de ZZ. CFT et YYJ ont préparé le document. CFT a révisé et édité le document. Tous les auteurs ont approuvé la version finale.

Correspondance à Chang-Fu Tian.

L'Université agricole de Chine a déposé une demande de brevet provisoire englobant des aspects de l'application agricole des mutants fadL sur lesquels CFT et YYJ sont répertoriés comme inventeurs.

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Réimpressions et autorisations

Ji, YY., Zhang, B., Zhang, P. et al. Migration rhizobienne vers les racines médiée par la modulation FadL-ExoFQP des AHL extracellulaires à longue chaîne. ISME J 17, 417–431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01357-5

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Reçu : 02 mars 2022

Révisé : 28 décembre 2022

Accepté : 04 janvier 2023

Publié: 10 janvier 2023

Date d'émission : Mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-023-01357-5

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