Transformation foliaire pour une intégration aléatoire efficace et une modification ciblée du génome chez le maïs et le sorgho

Nov 12, 2023

Nature Plants tome 9, pages 255–270 (2023)Citer cet article

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La transformation des espèces de graminées s'est traditionnellement appuyée sur des embryons immatures et a donc été limitée à quelques grandes cultures de Poaceae. D'autres explants de transformation, y compris le tissu foliaire, ont été explorés mais avec de faibles taux de réussite, ce qui est l'un des principaux facteurs entravant l'application à grande échelle de l'édition du génome pour l'amélioration des cultures. Récemment, la transformation des feuilles à l'aide des gènes morphogéniques Wuschel2 (Wus2) et Babyboom (Bbm) a été utilisée avec succès pour la mutagenèse médiée par Cas9, mais les applications complexes d'édition du génome, nécessitant le criblage d'un grand nombre de plantes régénérées, restent insaisissables. Ici, nous démontrons que l'expression améliorée de Wus2/Bbm améliore considérablement la transformation des feuilles dans le maïs et le sorgho, permettant la récupération de plantes avec des abandons de gènes médiés par Cas9 et une insertion de gènes ciblée. De plus, en utilisant une construction Wus2/Bbm optimisée pour le maïs, des cals embryogènes et des plantules régénérées ont été produits avec succès chez huit espèces couvrant quatre sous-familles de graminées, ce qui suggère que cela pourrait conduire à une méthode universelle à l'échelle de la famille pour la transformation et l'édition du génome à travers les Poaceae.

La transformation génétique et la régénération des plantes avec de nouveaux phénotypes ont été une percée dans la biotechnologie végétale précoce et ont suscité de grandes attentes parmi les scientifiques des plantes. Cependant, peu de temps après le premier rapport de transformation réussie de Nicotiana tabacum à l'aide d'une infection par Agrobacterium1, il est devenu évident que le tabac est l'exception et que l'exploitation du potentiel de cette technologie dans les principales cultures serait empêchée par une mauvaise transformation et/ou régénération2. Des améliorations progressives de la transformation se sont poursuivies pour diverses espèces végétales, mais pour beaucoup d'entre elles, ce processus a été limité par la réticence à la manipulation in vitro. Trouver la meilleure combinaison de méthode de transformation et de système de culture pour chaque culture a nécessité l'évaluation de différents explants allant de cellules uniques telles que des protoplastes ; aux tissus embryonnaires tels que le méristème, le scutellum ou les cotylédons ; aux tissus dérivés des semis tels que les méristèmes apicaux/axillaires, l'hypocotyle ou les feuilles ; et enfin aux alternatives in planta.

Le développement récent de technologies d'édition du génome basées sur les nucléases CRISPR (répétition palindromique courte et régulièrement espacée)-Cas (associée à CRISPR) exacerbe encore le besoin de processus de transformation améliorés et efficaces3. Les nucléases Cas guidées par l'ARN génèrent des cassures double brin ciblées dans le génome, qui sont réparées soit par des voies de jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) soit par des voies de réparation dirigée par homologie (HDR). Le NHEJ est sujet à une réparation imparfaite et entraîne souvent de petites insertions ou suppressions, tandis que le HDR peut être utilisé pour introduire des modifications prédéfinies en fournissant une matrice d'ADN donneur avec des régions d'homologie au site de rupture double brin.

Depuis les premiers rapports sur l'édition du génome par Cas9 chez le tabac, l'Arabidopsis et le riz, la liste des espèces végétales éditées n'a cessé de s'allonger4,5,6,7. Cependant, alors que la mutagenèse médiée par NHEJ et les knockouts de gènes sont désormais une pratique courante, d'autres types de modifications du génome (telles que les insertions de gènes médiées par HDR, les délétions à grande échelle, les inversions et les translocations) se produisent avec des fréquences beaucoup plus faibles, nécessitant un nombre élevé de plantes. être régénéré et criblé pour en trouver un avec la modification souhaitée. Cette limitation est vraie pour la plupart des espèces des Poacées (par exemple, le riz indica, le maïs, le blé, l'orge, le sorgho et le mil chandelle), où les méthodes de transformation reposent sur des embryons immatures et restent en général très dépendantes de l'espèce et/ou du génotype, limitant leur déploiement à grande échelle. En outre, un approvisionnement constant d'embryons immatures tout au long de l'année en tant qu'explant de transformation nécessite une infrastructure de serre qui la rend prohibitive en termes de ressources et de coûts pour la plupart des établissements universitaires. Par conséquent, les installations de services de transformation sont devenues une nécessité8. Des processus de transformation améliorés avec des fréquences de régénération élevées deviennent donc un prérequis pour ces applications complexes d'édition du génome9.

L'utilisation des gènes morphogéniques Wuschel2 (Wus2) et Babyboom (Bbm), permettant la régénération des plantes à haute fréquence à partir de génotypes de maïs récalcitrants, a constitué une percée majeure dans la transformation à base d'embryons immatures10,11. L'utilisation de Wus2/Bbm a également amélioré la transformation de trois variétés de sorgho, Tx430, Tx623 et P898012 (réfs. 12,13), et deux lignées de maïs publiques, FFMM14 et B104 (réf.15). De plus, l'expression de Wus2 seule s'est avérée efficace pour améliorer la transformation du maïs16 et l'édition du génome du sorgho17. Suite à ces rapports, d'autres gènes stimulant la division cellulaire et la formation de tissu embryogène ont été identifiés et utilisés avec des résultats similaires. Par exemple, Grf4/Gif1 (réf. 18) et Wox5 (réf. 19) ont amélioré la transformation et la régénération des embryons immatures dans une large gamme de cultivars de blé. Cependant, pour certaines espèces de graminées (telles que les bambous, Setaria, le teff et les petits millets), les graines et les embryons immatures sont tout simplement trop petits pour être isolés efficacement, tandis que d'autres cultures (telles que la canne à sucre et la banane) sont multipliées par voie végétative.

Divers groupes de recherche ont exploré des explants de départ alternatifs pour la transformation des espèces de graminées. À l'exception du riz japonica, facilement transformé via l'infection par Agrobacterium des graines matures20, ces groupes ont utilisé soit des embryons matures dérivés de graines21,22, soit des bases de feuilles dérivées de semis23,24,25,26 pour établir d'abord des cultures de cals, qui sont ensuite utilisées comme cible de l'infection par Agrobacterium. L'utilisation de Wus2 et de Bbm a élargi la liste des explants alternatifs pour la transformation, comme en témoigne la régénération de plantes transgéniques fertiles à l'aide de tranches d'embryons matures et de segments de tissus de la base des feuilles chez le maïs10. À l'aide de constructions développées par Lowe et al.10, des rapports récents ont montré une transformation de la base des feuilles chez le panic raide27 et une mutagenèse génétique réussie chez Eragrostis tef28. Cependant, d'autres améliorations sont nécessaires pour augmenter la fréquence de transformation, pour étendre la méthode au sein de la famille des graminées et pour éventuellement permettre des applications d'édition du génome plus complexes.

Nous décrivons ici une nouvelle combinaison de promoteurs régulant l'expression de Wus2 et Bbm qui stimulent la formation rapide directe d'embryons somatiques et la régénération de plantes T0 après infection par Agrobacterium du maïs et du sorgho dérivé des tissus foliaires précoces. Nous démontrons également que cette méthode améliorée de transformation des feuilles permet des modifications du génome médiées par Cas9, y compris l'abandon de gènes et l'insertion ciblée de gènes dans le maïs. Enfin, à l'aide d'un protocole de conception de vecteurs, de médias et de transformation des feuilles optimisé pour le maïs, nous démontrons la transformation des feuilles dans une variété d'espèces de graminées, notamment le riz (indica et japonica), le teff, le panic raide, le millet perlé, le millet sétaire, l'orge et le seigle.

Nos travaux précédents utilisant Wus2/Bbm ont établi à la fois le point de départ et notre nouvel objectif pour l'optimisation de la transformation des feuilles. Lowe et al.10 ont déterminé que l'utilisation de Wus2 régulé par le promoteur Nopaline synthase (Nos) et de Bbm régulé par l'ubiquitine (Ubi) produisait un cal embryogène qui après 10 à 12 semaines pouvait produire des plantes transgéniques pour les génotypes de maïs récalcitrants (notre point de départ) . Plus tard, Lowe et al.11 ont démontré qu'en fournissant une impulsion morphogénique à l'aide d'un ensemble différent de promoteurs régulant l'expression de Wus2 et Bbm (Axig1 et Pltp, respectivement), les embryons immatures produiraient rapidement (en 7 à 14 jours) des embryons somatiques qui pourraient être régénérées en plantes T0. Notre nouvel objectif pour la transformation foliaire était donc l'identification et l'évaluation de promoteurs et de conditions de culture tissulaire permettant une transformation rapide des feuilles et la régénération des plantes avec des efficacités permettant des applications complexes d'édition du génome, telles que l'insertion ciblée de gènes. Les composants génétiques utilisés dans les cassettes d'expression au sein de l'ADN de transfert (ADN-T) dans différents plasmides sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 1.

Pour évaluer les combinaisons de promoteurs dans le but d'améliorer et d'accélérer la réponse embryogène dans les feuilles, nous avons utilisé la souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 TD THY- hébergeant le plasmide auxiliaire PHP71539 (pVIR9 ; réf. 29) et un vecteur donneur binaire (voir PHP96037 comme exemple général ; Fig. 1a) pour transformer le tissu foliaire de la partie inférieure des semis de la lignée de maïs Pioneer PH1V69. La quantité de cals ou d'embryons somatiques directs produits à partir de fragments de feuilles a été utilisée comme critère pour évaluer diverses combinaisons de promoteurs régulant l'expression de Wus2 et Bbm (la notation est décrite à la Fig. 2). Les résultats de ces expériences sont résumés pour le maïs PH1V69 consanguin dans le tableau 1. En général, une expression plus faible de Wus2/Bbm n'a entraîné aucune embryogenèse dans le tissu foliaire, tandis que différentes combinaisons de promoteurs plus forts et/ou constitutifs ont produit une augmentation de la réponse de l'embryogenèse.

a, vecteurs d'ADN-T utilisés dans des expériences d'intégration aléatoire : PHP86491 est un vecteur de contrôle contenant uniquement des gènes marqueurs visibles (ZsGreen1) et sélectionnables (Hra) ; PHP96037 et PHP97334 sont des vecteurs contenant des gènes morphogéniques (Wus2 et Bbm), Cre recombinase, un gène marqueur visible (ZsGreen1) et Hra ou NptII comme gène marqueur sélectionnable, respectivement. b, vecteur d'ADN-T utilisé pour l'abandon de Wx1 médié par Cas9 contenant des gènes morphogéniques (Wus2 et Bbm), la recombinase Cre, Cas9 et deux cassettes d'expression d'ARNg, des gènes marqueurs visibles (ZsGreen1) et sélectionnables (NptII). c, Représentation de l'expérience d'insertion de gène ciblée médiée par Cas9, y compris (i) le vecteur d'ADN-T contenant les gènes morphogéniques (Wus2 et Bbm), la recombinase Cre, les cassettes d'expression de Cas9 et d'ARNg, un gène marqueur sélectionnable (Hra), le donneur cassette comprenant le second gène marqueur sélectionnable (NptII), des bras d'homologie (HR1 et HR2) flanqués de sites de coupure Cas9 (ou sites cibles (TS)) et un gène marqueur visible (ZsGreen1) ; (ii) insertion de gène ciblée via HDR lors du clivage Cas9 du site cible génomique et des deux sites cibles dans l'ADN-T pour libérer la séquence du donneur et (iii) le locus d'insertion de gène ciblé avec les positions des paires d'amorces PCR utilisées pour détecter le Jonctions HR1 (1) et HR2 (2) et le produit de PCR longue sur toute l'insertion (3). RB et LB = les séquences de bordure droite et gauche de l'ADN-T d'Agrobacterium.

Des travaux antérieurs savaient que la combinaison des promoteurs Axig1 et Pltp produisait une impulsion d'expression de Wus2 et de Bbm, respectivement, qui était suffisamment forte dans l'épithélium scutellaire de l'embryon immature pour stimuler les embryons somatiques dans les 7 à 14 jours11. Cependant, dans le tissu foliaire, cette combinaison (PHP83652) n'a produit que de petits amas de cellules fluorescentes sans croissance supplémentaire. De même, deux constructions utilisant des promoteurs régulés diurnes (Sweet 11 ou Diurnal 10) entraînant l'expression de Wus2 avec Ubi :: Bbm n'ont pas produit de réponse de croissance (PHP96730 et PHP96731, respectivement). Une réponse de croissance faible (+) a été observée avec une variété de combinaisons de promoteurs, qui comprenaient un promoteur inductible par l'auxine (8xDR5 dans PHP81855 et PHP94636) ; des promoteurs photosynthétiques tels que PepC1(PHP95073), Rubisco Ssu (PHP95205) et Cab (PHP95394) ; des promoteurs diurnes tels que Diurnal 12 (PHP95074) et Diurnal 11 (PHP96032); ou deux promoteurs viraux, le virus de la mosaïque veineuse du manioc (CSVMV) (PHP95393) et le virus bacilliforme de la canne à sucre (SCBV) (PHP95987), étant en général trop transitoires ou trop faibles pour provoquer une croissance embryogène rapide. Une réponse de croissance de callus plus cohérente (++) a été observée avec (1) Wus2 exprimé de manière constitutive avec une expression transitoire de Bbm (PHP81857), (2) Wus2 transitoire avec Bbm constitutif (PHP94715, PHP98564 et PHP98565) ou (3) nos numéros originaux : Combinaison :Wus2/Ubi::Bbm (PHP81858 ou PHP97978). Trois combinaisons de promoteurs pour piloter l'expression respective de Wus2 et Bbm (Actin/Ubi dans PHP95385, Gos2/Ubi dans PHP96031 ou Ubi/3xEnh–Ubi dans PHP97417 ; 3xEnh, trois activateurs viraux consécutifs de Figwart Mosaic Virus (FMV), Peanut Chlorotic Streak (PCSV) et Mirabilis Mosaic Virus (MMV); Tableau supplémentaire 1) ont entraîné une croissance embryogène plus rapide avec une certaine formation d'embryons somatiques dans les 14 jours. Enfin, divers promoteurs constitutifs de Wus2 (Ubi, Actin et Nos) ainsi que 3xEnh – Ubi :: Bbm (PHP93925 à PHP103735) (tableau 1) ont produit une formation rapide d'embryons somatiques dans 60 à 80 % des fragments de feuilles. La présence du promoteur 3xEnh – Ubi entraînant l'expression de Bbm (PHP97334 et PHP96277) a augmenté de manière significative les niveaux de transcription non seulement de Bbm mais également de Wus2 par rapport à PHP97978 et PHP95385 avec Ubi :: Bbm (tableau supplémentaire 2). Nous avons également observé que le fait d'avoir une cassette d'expression en amont de Wus2 réduisait la réponse de croissance, comme indiqué dans deux exemples spécifiques. Premièrement, PHP97335 avec Ubi :: NptII (néomycine phosphotransférase II) en amont de Nos :: Wus2 a produit une réponse de croissance modérée, tandis que PHP97334 (où Ubi :: NptII est en aval) a généré une forte réponse somatique rapide de l'embryon ; deuxièmement, PHP93738 avec un promoteur Heat Shock Protein17 (Hsp17) entraînant Cre en amont d'Actin :: Wus2 a entraîné une réponse modérée du cal, tandis que PHP95385 (où Hsp17 :: Cre est en aval) a produit une réponse somatique rapide de l'embryon. De toutes les constructions testées, PHP96037 et PHP97334, toutes deux avec Nos :: Wus2 et 3xEnh–Ubi :: Bbm mais deux marqueurs sélectionnables différents, ont constamment démontré une réponse de croissance forte et rapide et ont été choisies pour d'autres expériences.

Les images montrent des exemples de notation de la croissance de cellules fluorescentes et d'embryons somatiques 14 jours après l'infection par Agrobacterium. Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes. Barre d'échelle = 1 mm. NA = non applicable puisqu'aucun tissu résultant n'a poussé.

Pour évaluer le processus global de transformation des tissus foliaires (y compris la régénération des plantes T0), les vecteurs binaires contenant Wus2, Bbm, Cre, un gène marqueur fluorescent (ZsGreen1) et un gène marqueur sélectionnable (Highly-Resistant ZmAls (Hra) (PHP96037) ou NptII (PHP97334)) ont été comparés à un vecteur témoin (PHP86491) dépourvu de Wus2/Bbm (Fig. 1a). Des sites LoxP ont été introduits, permettant l'excision des cassettes d'expression Wus2/Bbm et Cre avant la régénération des plantes T0. La préparation des semis et le processus de transformation sont illustrés à la Fig. 3. Les graines stérilisées en surface ont germé sur un milieu solidifié à l'agar pendant 14 jours (Fig. 3a–c), puis environ 3 cm de tissu foliaire au-dessus du mésocotyle (Fig. 3d ) a été coupé en deux longitudinalement et haché mécaniquement dans un robot culinaire alors qu'il était immergé dans la suspension d'Agrobacterium (Fig. 3e). Les fragments de feuilles ont été répartis sur des papiers filtres et placés sur un milieu de co-culture pendant 24 heures puis sur un milieu de repos (RM) pendant 7 jours (Fig. 3f). La formation d'embryons somatiques fluorescents verts a été observée à partir des fragments de feuilles environ 7 à 10 jours après l'infection (Fig. 3g). Après trois semaines de sélection sur les papiers filtres (Fig. 3h), les plaques contenant le tissu ont été déplacées dans un incubateur à 45 ° C pendant deux heures pour induire une excision médiée par Cre, puis des morceaux individuels de tissu embryogène sain ont été transférés sur maturation. milieu (Fig. 3i) et enfin sur milieu d'enracinement (Fig. 3j), où le développement des plantules a été achevé avant le transfert dans le sol de la serre.

a, Stérilisation de surface des graines de maïs. b, Graines de maïs sur milieu de germination. c, Plants de maïs de quatorze jours utilisés comme source d'expiants. d, Préparation de segments de 3 cm du verticille de la feuille directement au-dessus du mésocotyle, suivi du découpage longitudinal du tissu (non illustré). e, Le tissu a été placé dans 100 ml de suspension d'Agrobacterium dans le mini-mélangeur Cuisinart et soumis à dix brèves impulsions pour découper davantage le tissu foliaire. Après une incubation de 20 minutes dans la suspension d'Agrobacterium, le liquide a été versé à travers un tamis métallique pour recueillir les fragments de feuilles, qui ont été brièvement buvardés sur du papier filtre sec pour évacuer l'excès d'Agrobacterium (non illustré). f, Fragments de feuilles répartis sur papier filtre sur le solide RM. g, Croissance embryonnaire somatique fluorescente observée 7 à 10 jours après l'infection par Agrobacterium (l'image est représentative de plus de 100 expériences indépendantes ; barre d'échelle, 1 mm). h, Après culture sur le RM, le tissu foliaire a été transféré dans un milieu de sélection. i, après trois semaines sur des papiers filtres sur un milieu de sélection, le tissu a été soumis à 45 ° C/70 % HR pendant deux heures (non illustré), transféré dans un milieu de maturation et cultivé pendant trois semaines supplémentaires. j, Formation de régénérants T0 après deux semaines sur milieu d'enracinement.

L'origine des embryons somatiques dans les morceaux de feuilles transformés (données étendues Fig. 1a, b) a été déduite sur la base d'observations histologiques du tissu, qui ont clairement montré des grappes multicellulaires semblant initier à partir de cellules foliaires internes (données étendues Fig. 1d-f ). Ces grappes ont continué à se développer lorsque des embryons somatiques ont finalement poussé à travers la surface de la feuille (Extended Data Fig. 1c, f).

Les résultats de la transformation des tissus foliaires pour le maïs PH1V69 consanguin à tige rigide (SS) à partir de quatre expériences utilisant le vecteur PHP96037 sont présentés dans le tableau 2a. Dans quatre répétitions, chacune commençant avec dix semis utilisés pour générer les fragments de feuilles, le nombre de plantes transgéniques T0 récupérées variait de six (expériences 1 et 4) à 14 (expérience 2), ce qui a donné une fréquence de transformation moyenne de 98 ± 43 % (calculé sur la base du nombre de régénérants T0 par plant de départ). Dans trois traitements répétés avec le vecteur de contrôle PHP86491 (Fig. 1a), une livraison d'ADN-T comparable à d'autres plasmides contenant Ubi :: ZsGreen1 a été observée, mais aucune formation d'embryon somatique fluorescent vert ne s'est produite dans ces morceaux de feuilles, et aucun T0 transgénique les plantes ont été récupérées selon le même protocole de transformation.

Ces expériences de transformation de feuilles ont produit un pourcentage élevé (de 0 % à 57 % avec une moyenne de 36 ± 25 %) de régénérants T0 de haute qualité avec une seule copie de l'ADN-T intégré (contenant des gènes marqueurs sélectionnables et fluorescents) sans séquences de squelette insérées ailleurs, telles que déterminées par PCR quantitative (qPCR). La comparaison de ce nombre d'événements transgéniques de haute qualité avec le nombre de semis de départ utilisés dans ces expériences a fourni une mesure claire de l'efficacité globale pour la production de plantes T0 à copie unique, avec une fréquence moyenne de 40 ± 29 %.

Des régénérants transgéniques à copie unique ont été cultivés jusqu'à maturité dans la serre. Le phénotype de la plante T0 était comparable à celui des plantes dérivées de graines de type sauvage (non transgéniques). Les plantes T0 ont ensuite été autopollinisées ou croisées avec des plantes de type sauvage et ont produit en moyenne 172 (11 épis) et 195 (17 épis) graines par épi, respectivement (tableau supplémentaire 3). Trente-six plantes T0 à copie unique ont également été analysées à l'aide de la technologie Southern-by-Sequencing (SbS)30 (tableau supplémentaire 4). Vingt-sept plantes (75 %) étaient 'SbS-pass', indiquant qu'une seule copie intacte de l'ADN-T intégré avec Wus2, Bbm et Cre excisés était présente, sans détection de petits fragments d'ADN non liés et ségrégeant indépendamment. Les 25% restants ont échoué en raison d'un assortiment de problèmes, notamment des polymorphismes mononucléotidiques, des fragments liés ou non liés, un squelette plasmidique ou des séquences de bordure incompatibles (tableau supplémentaire 4).

Au cours de la croissance rapide des semis, les feuilles sont souvent entrées en contact avec le couvercle du récipient de croissance, entraînant une nécrose des tissus et une production de composés phénoliques. Pour atténuer ce problème, nous avons ajouté de l'ancymidol, un antagoniste de l'allongement régulé par la gibbérelline31, au milieu de germination et de croissance des semis pour produire des semis plus courts et plus compacts. De plus, nous avons observé que le prétraitement à l'ancymidol des semis améliorait la fréquence de transformation, comme démontré en utilisant le vecteur PHP97334, qui contenait un ADN-T avec les mêmes cassettes d'expression Wus2, Bbm, Cre et ZsGreen1 que dans PHP96037, à l'exception d'un SiUbi :: NptII remplaçant le SbAls :: ZmHra en tant que gène marqueur sélectionnable (Fig. 1a).

Pour trois répétitions de cette expérience réalisée à l'aide de trois plantations distinctes de semis sur trois milieux différents (tableau 2b), les semis cultivés en l'absence d'ancymidol (témoin) ont produit une fréquence de transformation moyenne de 103 ± 6 %, tandis que les semis cultivés sur 2 mg l−1 ou 4 mg l−1 d'ancymidol ont entraîné des fréquences de transformation moyennes de 299 ± 50 % et 246 ± 9 %, respectivement. Les deux traitements à l'ancymidol ne différaient pas significativement l'un de l'autre (P = 0,32) mais étaient sensiblement plus élevés que le contrôle (P < 0,02). Les trois traitements (avec des prétraitements à 0, 2 et 4 mg l-1 d'ancymidol) ont produit des plantes T0 dans lesquelles une proportion similaire contenait une seule copie de l'ADN-T intégré.

Comme observé précédemment pour les embryons immatures32,33, le traitement thermique pourrait avoir un impact positif sur les résultats de transformation en aval. Sur la base de cette idée, un sous-ensemble de semis de PH1V69 cultivés sur des milieux additionnés de 2 mg l−1 d'ancymidol à 28 °C ont été incubés à 45 °C et 70 % d'humidité relative (HR) pendant trois heures, suivis d'une collecte de tissus foliaires. et fragmentation mécanique en présence de suspension d'Agrobacterium. Comme le montre le tableau 2c, le traitement témoin a entraîné une fréquence de transformation moyenne de 260 ± 101 %. Le prétraitement des semis à 45 °C pendant trois heures a entraîné une fréquence de transformation significativement plus élevée de 560 ± 85 % (P = 0,002).

Pour évaluer si cette méthode fonctionne dans le B104 consanguin de maïs couramment utilisé, des semis cultivés sur 2 mg l-1 d'ancymidol avec le prétraitement de trois heures à 45 ° C / 70% HR ont été utilisés comme source de tissu et la transformation a été effectuée comme décrit pour PH1V69. Pour deux répétitions commençant par sept semis pour chaque expérience, le nombre de plantes T0 produites était de 12 et 13 pour des fréquences de transformation de 171% et 186%, respectivement (tableau supplémentaire 5). Sur ces 12 et 13 plantes T0 au total, 8 et 7 avaient des insertions d'ADN-T à copie unique, respectivement, et une analyse plus approfondie a montré que quatre événements sur huit et cinq sur sept n'avaient pas de séquence de squelette plasmidique étrangère (tableau supplémentaire 5).

La méthode de transformation foliaire développée pour notre SS PH1V69 a également été testée sur quatre lignées pures de maïs Pioneer non SS (NSS) en utilisant PHP97334 (contenant Nos::Wus2 + 3xEnh–Ubi::Bbm), en commençant par 21–24 semis par génotype sans répliques. Les consanguins PH4257 et PNSS01 ont produit moins d'embryons somatiques dans les 14 premiers jours après l'infection par Agrobacterium, ce qui a entraîné un classement de réponse de transformation inférieur par rapport au PH1V69 consanguin SS (tableau supplémentaire 6). En conséquence, PH4257 n'a produit aucune plante transgénique et seules trois plantes T0 ont été régénérées pour PNSS01 (13 % par rapport au nombre de semis de départ).

En revanche, les deux autres consanguins NSS (1PYWK36 et 1PEEA63) ont démontré de fortes réponses embryonnaires somatiques précoces similaires au PH1V69 consanguin. Néanmoins, pour ces deux consanguins, la conversion de ces embryons somatiques en plantes T0 a été considérablement moins efficace, ne produisant que dix et huit plantes T0 (48 % et 38 % de fréquence de transformation, respectivement). Cependant, lorsqu'une construction différente (PHP96277) contenant Wus2 régulé par l'actine a été utilisée, le nombre de plantes T0 régénérées est passé à 20 et 40 (95 % et 190 %) pour les consanguins 1PYWK36 et 1PEEA63, respectivement. Bien que les résultats pour ces quatre consanguines n'aient pas été reproduits et soient donc préliminaires, pris ensemble, nous avons démontré que la méthode de transformation des feuilles fonctionnait pour six des sept lignées de maïs testées.

Pour tester la méthode de transformation des feuilles de maïs dans une autre culture, nous avons utilisé la même souche d'Agrobacterium, les constructions, la croissance des semis, la préparation du matériel foliaire, l'infection, la co-culture, la culture au repos, la sélection, l'excision Wus2/Bbm, la maturation somatique de l'embryon et l'enracinement. milieux de transformation des feuilles de sorgho. Même si PHP96037 contenait le gène Hra, aucune sélection n'a été utilisée dans cet ensemble d'expériences car aucune régénération de fond n'a été observée à partir du tissu foliaire dans les observations initiales en l'absence de Wus2/Bbm. De plus, dans cet ensemble d'expériences, nous avons comparé deux milieux de repos (RM) : milieu 13266P plus 50 mg l−1 de méropénème et RM + CB (sulfate cuivrique 100 μM et 0,5 mg l−1 de benzylaminopurine).

Les résultats de quatre expériences sur le sorgho (variété Tx430) sont présentés dans le tableau 2d. La transformation des feuilles de sorgho à l'aide du vecteur PHP96037 a entraîné des fréquences de régénération élevées, calculées sur la base du nombre de plantes transgéniques T0 récupérées par semis de départ, avec une fréquence moyenne de 166 ± 96 % et 297 ± 126 % pour RM et RM + CB, respectivement , sans différence significative entre les deux milieux (P = 0,15). Le traitement témoin sans Wus2/Bbm dans l'ADN-T (PHP86491) n'a pas produit de plantes régénérées. La fréquence moyenne des plants de sorgho T0 de haute qualité (copie unique d'ADN-T/sans squelette) lorsqu'ils ont été transformés avec PHP96037 était comprise entre 35 % et 37 %, sans différence significative entre les deux milieux (P = 0,87).

Vingt-trois plants de sorgho T0 à copie unique produits par transformation rapide des feuilles ont été cultivés jusqu'à maturité dans la serre. Ces plantes étaient saines, affichant un phénotype global similaire à celui des plantes Tx430 de type sauvage. L'analyse SbS a démontré que sur 23 plantes T0, 17 contenaient une seule copie de l'ADN-T intégré (tableau supplémentaire 4). Vingt et une plantes T0 (91%) étaient fertiles, avec des ensembles de graines allant de 667 à 3 255 graines par tête et une moyenne de 2 057 ± 900 graines par tête (tableau supplémentaire 3).

Pour évaluer l'efficacité de l'abandon de gène dans le tissu foliaire dérivé de semis de PH1V69 consanguin de maïs, nous avons utilisé un vecteur d'ADN-T (PHP98784, Fig. 1b) qui contenait les composants décrits précédemment complétés par Cas9 et deux cassettes d'expression d'ARN guide (ARNg). ciblant deux sites flanquant le gène endogène Wx1 comme décrit précédemment par Gao et al.34. Pour ces expériences, 2 mg l-1 d'ancymidol ont été utilisés dans le milieu de germination pour PH1V69 consanguin, et un prétraitement thermique des semis de trois heures a été appliqué avant l'infection par Agrobacterium.

Les résultats de trois expériences d'abandon Wx1 sont résumés dans le tableau 3. Des fréquences de transformation élevées de 636 %, 544 % et 363 % pour une moyenne de 514 ± 139 % ont été observées. L'analyse PCR quantitative effectuée sur les plantes T0 a démontré des fréquences d'abandon de 4,4 %, 8,1 % et 8,0 % pour ces trois expériences, respectivement, pour une moyenne de 6,8 ± 1,7 %.

Pour tester l'insertion de gènes ciblés médiée par HDR dans des cellules de feuilles de maïs, deux vecteurs d'ADN-T presque identiques ont été construits (PHP99721 et PHP103735). Les deux vecteurs contenaient Wus2, Bbm, Cre, Cas9, gRNA, une matrice donneuse contenant un gène marqueur sélectionnable (NptII) flanqué de bras d'homologie et de séquences identiques au site cible génomique (à 53,66 cM sur Chr1 (réf. 35)), un deuxième gène marqueur sélectionnable (Hra) et ZsGreen1 (PHP99721; Fig. 1c(i)). Les deux vecteurs différaient dans les séquences de bras d'homologie spécifiques aux deux génotypes utilisés (PHP99721 pour PH1V69 et PHP103735 pour le Pioneer NSS inbred PHR03). Comme indiqué précédemment36, la présence de sites cibles flanquants conduit à la libération de la matrice donneuse de l'ADN-T lors de l'expression de l'ARNg et de Cas9 (Fig. 1c (ii)). L'utilisation de deux gènes marqueurs sélectionnables différents, NptII et Hra, présents respectivement à l'intérieur et à l'extérieur de la matrice du donneur, a permis la comparaison des fréquences d'insertion ciblées en fonction de la position du gène marqueur sélectionnable (Fig. 1c (i)).

Pour ces expériences, les semis ont été cultivés sur un milieu de germination avec de l'ancymidol. Au total, cinq expériences ont été menées à l'aide de deux génotypes propriétaires différents de Pioneer. Les expériences 1 à 4 ont été réalisées sur le PH1V69 consanguin, tandis que l'expérience 5 a été menée sur le PHR03 consanguin. Dans l'expérience 1, il n'y a pas eu de prétraitement thermique des semis, tandis que dans les expériences 2 et 3, la moitié des semis ont été exposés à 45 ° C à 70% HR pendant trois heures avant l'infection par Agrobacterium et l'autre moitié n'a pas subi de prétraitement thermique. Dans les expériences 4 et 5, tous les semis ont été soumis au prétraitement thermique. Dans les expériences 1, 2, 3 et 5, NptII (à l'intérieur de la matrice du donneur) a été utilisé comme gène marqueur sélectionnable. Dans l'expérience 4, un ensemble de plantes T0 a été régénéré en utilisant G418 comme agent de sélection (pour NptII), tandis que le deuxième ensemble de plantes a été régénéré sur un milieu contenant de l'éthametsulfuron (pour Hra).

Les résultats des cinq expériences sont résumés dans le tableau 4. Dans les expériences 1 à 3, lorsqu'aucun prétraitement thermique n'a été appliqué, la fréquence de transformation (le nombre de plantes T0 par semis) était de 140 %, 262 % et 230 %, respectivement, avec un moyenne de 211 ± 63 %. En revanche, dans les expériences 2 à 4, lorsque le prétraitement thermique a été utilisé, les fréquences de transformation ont augmenté de manière significative (P = 0,001) à 560 %, 570 % et 524 %, respectivement, avec une moyenne de 551 ± 24 %. Le taux d'échappement (le nombre de régénérants sans gène marqueur sélectionnable détecté) variait de 9,0 % à 10,9 %. Les plantes T0 ont d'abord été analysées pour les événements d'insertion médiés par HDR par diagnostic qPCR jonction HR1 et HR2 (Fig. 1c (iii)) comme décrit dans les méthodes. Les plantes T0 qui étaient qPCR positives pour une jonction HR1 ou HR2 seule variaient entre 5 % et 12,6 %. Les plantes T0 qui étaient positives pour les deux jonctions (colonnes HR1 et HR2 dans le tableau 4) ont démontré que les fréquences d'insertion ciblées étaient similaires (P = 0,71) dans les quatre expériences ; 4,5 %, 6,8 % et 5,2 % sans prétraitement thermique et 7,0 %, 5,6 % et 5,0 % avec prétraitement.

En utilisant une longue PCR qui couvre l'ensemble du site d'insertion (de la séquence génomique à l'extérieur du bras HR1 à travers le donneur intégré à la séquence à l'extérieur du bras HR2 ; Fig. 1c(iii)), nous avons pu détecter la fréquence des événements d'insertion parfaite putatifs. . Pour les répliques non prétraitées à la chaleur et prétraitées à la chaleur dans les expériences 1 à 4, les fréquences étaient très similaires : 3,2 %, 2,8 % et 3,0 % et 2,7 %, 2,5 % et 2,6 %, respectivement. Ces résultats démontrent clairement que bien que le prétraitement thermique ait entraîné une augmentation substantielle de la récupération initiale des plantes T0, les fréquences d'insertion de gènes ciblées étaient très cohérentes. De plus, le nombre d'événements positifs pour la PCR longue par rapport au nombre total de plantes T0 positives pour les jonctions HR1 et HR2 fournit une indication de l'attrition associée à des insertions incomplètes et/ou complexes qui se sont produites par une combinaison de HDR et Voies NHEJ. Ces fréquences dans les expériences 1 à 3 étaient de 72 %, 41 % et 58 % pour les répliques non prétraitées à la chaleur, tandis que pour les deux répliques prétraitées à la chaleur, les valeurs étaient de 40 % et 45 %.

Les fréquences d'insertion ciblées ont également été comparées à l'aide de deux gènes marqueurs sélectionnables différents situés soit à l'intérieur de la matrice donneuse (NptII), s'intégrant donc dans le site cible, soit à l'extérieur de la matrice donneuse (Hra), auquel cas le gène marqueur sélectionnable est laissé au hasard. ADN-T intégré (expérience 4). En comparant ces deux traitements, la fréquence de transformation initiale était similaire : 524 % (avec une fréquence d'échappement de 9,8 %) lorsqu'elle était sélectionnée sur un milieu avec du G418 et 579 % (avec une fréquence d'échappement de 12,6 %) lorsqu'elle était sélectionnée sur un milieu avec de l'éthametsulfuron. Pour le traitement avec le gène marqueur sélectionnable à l'intérieur de la matrice du donneur, la fréquence des événements HR1&HR2-qPCR-positifs était de 5,0 %, similaire aux fréquences observées dans les trois premières expériences. En comparaison, lorsque le gène marqueur sélectionnable était en dehors de la matrice du donneur, la fréquence des événements d'insertion de gène ciblé était inférieure à 2,9 %. Les fréquences des événements positifs à la PCR longue pour les deux groupes étaient de 2,6 % et 1,5 %, respectivement.

L'expérience 5 a été menée pour évaluer la fréquence d'insertion de gène ciblée dans le PHR03 consanguin NSS (tableau 4). En utilisant la même conception d'ADN-T et NptII que le gène marqueur sélectionnable (situé à l'intérieur de la matrice du donneur), la fréquence de transformation était de 205 % (avec une fréquence d'échappement de 9,6 %), tandis que le taux combiné HR1 et HR2 était de 2,2 % et le long terme final. La fréquence des PCR était de 1,2 %.

Pour évaluer les schémas de transmission et de ségrégation des intégrations ciblées basées sur HDR, nous avons analysé 32 plantes T1 de trois événements d'insertion T0 de l'expérience 1 (tableau 4) en utilisant qPCR pour la présence d'insertion de gène et de composants d'ADN-T (Cas9, gRNA, Bbm , Wus2, Hra et NptII). Les résultats de cette analyse sont résumés dans le tableau supplémentaire 7. Les trois plantes T0 ont montré une transmission de l'insertion à la génération T1 avec un rapport de ségrégation d'environ 1: 1 (40%, 44% et 56%), compatible avec un héritage mendélien stable. d'un locus mono-allélique. Comme prévu, environ 50 % des plantes T1 avec insertion étaient exemptes de transgène.

Les plantes positives à l'insertion T1 ont ensuite été analysées par séquençage Sanger pour vérifier la qualité et l'intégrité de l'insertion. Les produits de PCR longs de dix plantes sélectionnées T1 (trois ou quatre plantes pour chacun des trois événements T0) ont été séquencés et assemblés en contigs. La comparaison des dix contigs n'a montré aucune variation de séquence, confirmant que chaque plante avait une insertion de gène précise, médiée par HDR.

Encouragés par nos résultats sur le maïs et le sorgho, nous avons effectué une évaluation préliminaire de la transformation des feuilles en utilisant neuf espèces de Poaceae, dont Eragrostis tef, Panicum virgatum (panic raide), Cenchrus americanus (syn. Pennisetum glaucum, millet perlé), Setaria italica (sétaire verte). millet), Triticum aestivum (blé de printemps pionnier), Secale cereale (seigle), Hordeum vulgare (orge), Saccharum officinarum (canne à sucre) et Oryza sativa (riz) (Fig. 4a). La méthode optimisée pour le maïs, mais sans l'ancymidol ni les prétraitements thermiques des semis, a été utilisée pour cette évaluation. Le tissu foliaire a été récolté à partir de la partie basale du semis et tranché manuellement en fragments de 1,5 à 3 mm (Extended Data Fig. 2). Les morceaux de feuilles ont ensuite été infectés par Agrobacterium contenant PHP97334 (Fig. 1a). Entre six et 120 semis ont été utilisés pour différentes espèces/variétés (les petits nombres chez certaines espèces étaient dus à la disponibilité limitée du matériel de départ). En utilisant la microscopie à fluorescence pour évaluer l'expression de ZsGreen1 quatre à cinq jours après l'infection, nous avons observé une bonne délivrance d'ADN-T chez toutes les espèces testées (Fig. 4b, micrographies de gauche). Une culture supplémentaire du tissu foliaire pendant quatre à cinq semaines a donné des cals embryogènes fluorescents (Fig. 4b, micrographies du centre). Après l'excision de Wus2 / Bbm, le tissu a été cultivé pendant trois semaines sur un milieu de maturation d'embryons, puis pendant deux semaines sur un milieu d'enracinement, moment auquel les plantules en régénération ont été photographiées (Fig. 4b, photographies de droite).

a, L'arbre généalogique des Poaceae indiquant les espèces utilisées dans l'expérience et les sous-familles correspondantes. Les espèces qui ont été transformées et régénérées avec succès, produisant des plantes T0, sont représentées en noir ; les espèces qui ont été transformées et ont produit du tissu calleux mais qui ne se sont pas régénérées sont indiquées en rouge. b, Résultats pour toutes les espèces de graminées transformées avec succès. Les images de gauche montrent l'expression transitoire de ZsGreen1 trois à quatre jours après l'infection par Agrobacterium (barres d'échelle, 500 µm), démontrant la livraison relative d'ADN-T dans diverses cultures ; les images du centre montrent des exemples de formation de cals embryogènes fluorescents verts trois à quatre semaines après l'infection (barres d'échelle, 1 mm) ; et les images de droite montrent des plantules récupérées avec des pousses et des racines prêtes à être transférées au sol cinq à huit semaines après l'infection. Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes.

Un cal embryogène a été produit chez toutes les espèces testées (les expériences individuelles pour chaque espèce sont résumées dans le tableau supplémentaire 8) et des plantules T0 avec des pousses et des racines saines ont été régénérées chez sept des neuf espèces (Fig. 4b). Deux espèces, le blé et la canne à sucre, n'ont pas produit de plantes T0 (Extended Data Fig. 3). Dans le cas de la variété de blé Pioneer PH456D, bien que des embryons somatiques aient été produits dans les 10 à 14 premiers jours (sur la base du phénotype de croissance précoce), le potentiel embryogène s'est détérioré et le cal est devenu non régénérable au cours des 2 à 3 semaines suivantes. Dans le cas de la canne à sucre, un cal embryogène somatique a été produit et maintenu, mais la morphologie embryogène a été rapidement perdue après exposition au traitement thermique à 45 ° C utilisé pour stimuler l'excision médiée par Cre. L'expérience avec la canne à sucre sera répétée à l'avenir, en remplaçant le promoteur thermo-inductible par un promoteur Rab17 inductible par l'acide abscisique/la dessiccation conduisant Cre pour faciliter l'excision comme décrit dans Lowe et al.10.

L'utilisation de gènes morphogéniques pour améliorer la transformation médiée par Agrobacterium et/ou l'édition de gènes médiée par Cas9 chez les espèces de graminées continue de prendre de l'ampleur. La combinaison de Wus2 et de Bbm pour améliorer la transformation des embryons immatures dans le maïs a été signalée pour la première fois pour plusieurs lignées consanguines de maïs récalcitrantes10. L'application de ces gènes a été étendue à la transformation du sorgho10,12, à l'édition du génome du sorgho37, à la transformation consanguine publique du maïs14,15,38 et à l'édition du génome du maïs15,35,36,39. Récemment, il a également été démontré que Wox5 améliore la transformation de nombreuses variétés de blé, avec une application potentielle dans d'autres céréales telles que Triticum monococcum, le triticale, le seigle, l'orge et le maïs19. De même, il a été démontré que Grf5 améliore la transformation dans la lignée consanguine de maïs A18840, et la combinaison de gènes Grf4/Gif1 stimule la croissance et la régénération d'événements transgéniques dans le blé, le riz et le triticale18. Cependant, les progrès ci-dessus continuent de s'appuyer sur la transformation d'embryons immatures, qui a été une contrainte pour de nombreuses cultures de la famille des graminées, motivant les chercheurs à explorer des explants alternatifs pour la culture et la transformation de tissus.

La base des feuilles a été un explant de culture tissulaire attrayant pendant près de quatre décennies, l'initiation et la régénération des cals ayant été démontrées chez de nombreuses espèces de Poaceae, notamment le blé41,42,43,44, l'avoine45,46, l'orge47,48, le seigle49, le maïs23, le riz50 et divers graminées apomictiques51. En conséquence, les chercheurs ont utilisé des bases de feuilles pour générer des cals embryogènes comme explant cible pour l'infection par Agrobacterium et la régénération de plantes transgéniques, par exemple, dans le maïs23, le riz indica24,52, le bambou Ma25 et la téosinte26. Cependant, à l'exception d'un rapport sur le dactyle pelotonné (Dactylis glomerata)53 où des plantes transgéniques ont été produites, les études où le tissu de la base des feuilles a été utilisé comme cible de transformation directe se sont limitées à démontrer uniquement l'expression transgénique transitoire dans le riz54, le blé55 et le maïs56.

Lowe et al.10 ont montré que l'utilisation des gènes morphogéniques Wus2 et Bbm facilitait la transformation directe médiée par Agrobacterium du tissu foliaire basal et la récupération des plants de maïs avec une intégration aléatoire des transgènes. Récemment, cette méthode a été étendue à la transformation aléatoire chez Panicum virgatum27 et à la mutagenèse médiée par Cas9 chez Eragrostis tef28, démontrant que Wus2/Bbm peut faciliter la transformation directe de la base des feuilles chez d'autres espèces de graminées. Cependant, pour soutenir le véritable potentiel de l'édition du génome médiée par Cas9, des taux de transformation nettement plus élevés sont encore nécessaires pour produire le grand nombre de plantes nécessaires pour récupérer des modifications complexes du génome, telles que l'insertion ciblée de gènes médiée par HDR et les réarrangements chromosomiques à grande échelle9.

Pour répondre à ce besoin, nous montrons que la livraison médiée par Agrobacterium de Wus2 et Bbm régulée par de nouveaux promoteurs peut considérablement augmenter la transformation de la base des feuilles chez le maïs et le sorgho. Auparavant, deux combinaisons de promoteurs ont été utilisées pour la transformation médiée par Wus2/Bbm d'embryons immatures. Dans le premier, l'utilisation des promoteurs Nos et Ubi conduisant l'expression de Wus2 et Bbm, respectivement, a stimulé le développement de cals embryogènes mais a nécessité des semaines de culture suivies d'une excision de gènes morphogéniques avant la régénération de la plante10,12. La deuxième combinaison de promoteurs, Axig1 pour Wus2 et Pltp pour Bbm, a stimulé la formation rapide d'embryons somatiques et n'a pas nécessité d'excision ultérieure11,14,15,57. Lowe et al.10 ont démontré que la transformation des feuilles de maïs à l'aide de Nos::Wus2 et Ubi::Bbm initie un cal embryogène faible qui se développe à peine dans les deux premières semaines après l'infection (tableau 1, PHP81858), et l'utilisation de Axig1::Wus2 et Pltp::Bbm, bien que conduisant à une forte expression transitoire dans les explants de feuilles, n'a pas entraîné la formation ultérieure d'embryons somatiques (tableau 1, PHP83652). Cela nous a conduit à tester de nombreuses combinaisons de promoteurs différentes, dont certaines ont produit des embryons somatiques à des taux lents (++) ou plus rapides (+++) (tableau 1). Bien que ces combinaisons de promoteurs ne soient pas optimales pour le maïs, elles peuvent s'avérer utiles dans d'autres espèces de graminées avec une expérimentation plus poussée. Les meilleurs résultats ont été obtenus pour un groupe de constructions lorsque les promoteurs Nos, Actine ou Ubi contrôlaient l'expression de Wus2 et que Bbm était régulé par un promoteur FMV::PCSV::MMV::Ubi (trois activateurs viraux en amont du promoteur Ubi). Pour le maïs et le sorgho, nous nous sommes concentrés sur Nos::Wus2 et 3xEnh–Ubi::Bbm pour un développement ultérieur de la méthode.

Les fréquences de transformation ont été encore améliorées en cultivant des semis sur l'ancymidol et en fournissant un prétraitement thermique avant la récolte des explants de feuilles et l'infection par Agrobacterium. Le bénéfice de l'exposition à la chaleur immédiatement avant l'infection est similaire à celui observé pour la transformation d'embryons immatures chez le riz58, le maïs44,58 et le sorgho32, où il a été suggéré que l'accumulation de protéines de choc thermique pourrait atténuer le stress de l'infection par Agrobacterium. Un lien entre l'exposition à l'ancymidol et l'atténuation du stress est moins clair. Au lieu de cela, une explication possible de la réponse embryogène améliorée peut être liée à l'observation que les bases de feuilles traitées à l'ancymidol accumulent des quantités notables d'amidon dans les cellules mésophylles en développement (données étendues, Fig. 4). Une corrélation entre l'accumulation d'amidon et l'amélioration de l'embryogenèse somatique a été notée dans d'autres systèmes59,60,61, avec la suggestion que l'amidon est une source d'énergie facilement métabolisable pour soutenir le développement de l'embryon somatique. En conséquence, pour PH1V69, nous avons atteint des fréquences de transformation moyennes (le nombre de régénérants T0 par semis de départ) de 260 % ​​avec l'ancymidol et de 560 % avec une combinaison d'ancymidol et de prétraitement thermique (tableau 2c). Le protocole développé pour PH1V69 a également été utilisé avec succès pour transformer le PHR03 consanguin Pioneer NSS et la ligne publique B104 avec des fréquences d'environ 200 % et 180 %, respectivement ; d'autres lignées NSS testées avaient des fréquences de transformation comprises entre 13 et 190 %. Actuellement, nous n'avons pas de métrique commune pour comparer l'efficacité de la transformation d'embryons immatures avec celle de la transformation de feuilles dérivées de semis simplement parce que les explants utilisés pour l'infection par Agrobacterium sont si différents. De plus, lors de l'utilisation du mini-Cuisinart pour la fragmentation mécanisée des feuilles, la population de morceaux de feuilles individuels produits est trop variable en nombre et en taille pour fournir un point de départ reproductible pour calculer l'efficacité. Nous avons donc eu recours au nombre de semis de départ comme dénominateur commun pour comparer les fréquences de transformation foliaire entre expériences, entre consanguines et entre espèces de graminées. Sur la base de cette mesure, nous pouvons affirmer sans équivoque que la consanguinité de maïs PH1V69 et la variété de sorgho Tx430 ont produit un nombre élevé d'événements transgéniques T0 par semis de départ et que les autres consanguines testées (comme B104) ont produit des résultats inférieurs. Pour B104 et d'autres consanguins, les fréquences de transformation des feuilles continueront probablement à s'améliorer à mesure que davantage de laboratoires travaillent avec ce tissu pour l'infection par Agrobacterium et que de nouvelles améliorations (comme un système de plasmide ternaire modifié pour la transformation d'embryons immatures médiée par Agrobacterium développé dans B104 (réf. 62 ) sont appliqués sur les tissus foliaires.

La transformation directe des feuilles offre d'autres avantages permettant l'automatisation et une meilleure manipulation du matériel de culture tissulaire. Plus précisément, la procédure fastidieuse d'isolement d'embryons est remplacée par une simple préparation de tissus foliaires dérivés de semis, la fragmentation est automatisée à l'aide d'un mélangeur (réduisant potentiellement la variabilité dans la préparation des explants) et l'infection par Agrobacterium se produit directement dans le récipient de mélange. De plus, alors que les embryons immatures sont sous-cultivés en transférant individuellement chaque embryon sur un nouveau milieu, les fragments de feuilles transformés sont placés sur du papier filtre, qui peut être déplacé facilement d'un milieu à l'autre, ce qui réduit considérablement le temps et le travail. Combinés à l'élimination du besoin de production d'embryons toute l'année en plus des variations saisonnières qui ont tourmenté les méthodes d'embryons immatures pendant des années15, ces avantages rendent la transformation plus facile, plus pratique, reproductible, ergonomique et largement applicable à une grande variété d'espèces de graminées importantes.

Dès les premiers jours de la culture et de la transformation d'embryons immatures chez les espèces de graminées, il a toujours été très clair que la formation d'embryons somatiques se produisait sur l'épithélium scutellaire63,64. Cependant, pour la culture à base de feuilles, l'origine de la réponse de la culture est restée non résolue. Malgré de nombreux rapports sur les tissus de la base des feuilles répondant aux manipulations de culture in vitro et à la production de cals dans une variété d'espèces de Poaceae24,25,43,47,50, les types de cellules spécifiques impliqués n'étaient pas clairs. Notre analyse histologique ainsi que les observations d'amas multicellulaires fluorescents cinq à sept jours après l'infection par Agrobacterium (Extended Data Fig. 1) confirment les observations antérieures de Lowe et al.10 selon lesquelles les embryons somatiques semblent se former principalement à partir des cellules intérieures des feuilles, une observation cohérente. avec la croissance d'embryons à partir de tissus foliaires dans le verger65 et avec des observations dans des feuilles de riz exprimant de manière constitutive le gène OsBbm166. Sur la base de la formation précoce abondante de grappes multicellulaires fluorescentes (Extended Data Fig. 1a – c) et de notre fréquence actuelle de récupération de plantes transgéniques à partir d'une fraction seulement de ces réponses de croissance précoces, il existe probablement un potentiel d'amélioration supplémentaire de cette méthode. en réduisant simplement le taux d'attrition pendant le processus de culture.

Nous avons également démontré que le niveau de transformation de la base foliaire atteint dans le PH1V69 consanguin SS de maïs propriétaire de Pioneer permet la récupération de plantes avec diverses modifications génomiques médiées par Cas9 (mutagenèse basée sur NHEJ, abandons de gènes et insertions de gènes ciblées facilitées par HDR) à des fréquences qui approchent celles obtenues pour les embryons immatures35,36,39. Un autre aspect important à considérer pour l'édition du génome est la contribution de la stimulation de la croissance par les gènes morphogéniques, accélérant simultanément la progression du cycle cellulaire et la division cellulaire, qui contribuent à l'efficacité globale des modifications médiées par Cas9. En conséquence, l'avantage d'utiliser Wus2/Bbm dans des embryons immatures a été démontré dans le maïs pour faciliter la récupération des abandons de gènes35,34 et des événements d'intégration médiés par HDR36,39. De plus, la fréquence des abandons de gènes récupérés dans les plantes de sorgho T0 est augmentée par Wus2 au-delà du niveau qui peut être expliqué en produisant simplement plus de plantes T017. Comme spéculé par Peterson et al.36, un avantage supplémentaire de l'utilisation de gènes morphogéniques dans les expériences de modification du génome est la stimulation de la division cellulaire, fournissant un environnement cellulaire propice à des formes complexes plus efficaces d'édition du génome, y compris les abandons de gènes et les insertions médiées par HDR. Nos résultats avec des bases de feuilles de maïs sont cohérents avec ces interprétations.

En résumé, nos résultats démontrent clairement les avantages potentiels de l'utilisation des bases foliaires comme explant de départ pour la transformation et l'édition du génome chez le maïs et le sorgho. Pour le maïs, nous avons montré le potentiel de la méthode en termes d'efficacité élevée à la fois pour la production de plantes T0 transgéniques et pour l'édition du génome. De plus, la transformation réussie des feuilles et la régénération des plantules ont été démontrées pour plusieurs lignées de maïs et un groupe représentatif d'espèces de graminées. Une seule méthode peut désormais être utilisée sur un large éventail de graminées, ouvrant la possibilité d'étendre les méthodes de transformation et d'édition du génome à l'ensemble de la famille des Poaceae.

Des graines des lignées exclusives Zea mays PH1V69, PHR03, PH4257, PNSS01, 1PYWK36 et 1PEEA63 ont été utilisées dans les expériences de transformation, en plus de la lignée publique B104. Pour Sorghum bicolor, des semences de la lignée Tx430 ont été utilisées. La transformation a été effectuée sur des espèces supplémentaires de Poaceae : Eragrostis tef (variété de teff DZ-01-354), Panicum virgatum (variété de panic raide Performer), Pennisetum glaucum (syn. Cenchrus americanus, variété de mil chandelle ICMB93333), Setaria italica (mil vulpin), Triticum aestivum (variété de blé de printemps Pioneer PH456D), Secale cereale (seigle, variétés d'hiver Emerald et Pierre), Hordeum vulgare (orge, variétés Golden promise et Morex SPDL2), Saccharum officinarum (variété de canne à sucre CPCL02) et Oryza sativa (variété indica IRV95 et japonica variété Kitaake).

Les graines matures ont été stérilisées en surface dans une solution d'éthanol à 80% pendant trois minutes, suivies d'une incubation dans une solution d'eau de Javel Clorox à 30% contenant 0,1% de Tween-20 pendant 20 minutes et enfin rincées trois fois pendant cinq minutes chacune dans de l'eau stérile autoclavée. Les graines stérilisées ont été transférées sur un milieu solide 90O pour germer (tableau supplémentaire 9). La germination in vitro et la croissance des semis ont été réalisées sous une intensité lumineuse de 80 μmol m-2 s-1 à 28 °C avec une photopériode de 16 heures de lumière/huit heures d'obscurité.

Les graines stérilisées en surface ont été semées sur un milieu de germination ne contenant pas d'ancymidol (milieu témoin 90O contenant 0 mg l-1 d'ancymidol) ou un milieu 90O plus 2 ou 4 mg l-1 d'ancymidol (Sigma Aldrich, numéro de produit A9431). La germination et la croissance des semis se sont produites sous une intensité lumineuse de 80 μmol m-2 s-1 en utilisant une photopériode de 16 heures à 28 ° C, et les semis ont été récoltés pour transformation à 14 jours pour toutes les expériences et tous les traitements répétés.

Les graines stérilisées en surface ont été semées sur un milieu de germination 90O plus 2 mg l-1 d'ancymidol. La germination et la croissance des semis se sont produites comme décrit ci-dessus. Avant la récolte des explants, des semis âgés de 12 à 18 jours ont été placés dans un incubateur à 45 °C/70 % HR pendant trois heures.

Dans des études antérieures, la combinaison du plasmide auxiliaire pVIR9 (PHP71539) dans la souche Agrobacterium LBA4404 THY- a été très efficace pour une utilisation dans la transformation du maïs29 et a fait partie intégrante de l'optimisation des méthodes Wus2/Bbm pour les embryons immatures10,11,16 et maintenant les feuilles tissu. La souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 TD THY- hébergeant le plasmide auxiliaire PHP71539 et un vecteur donneur binaire a été strié d'une aliquote congelée à -80 ° C sur un milieu 12R solide (tableau supplémentaire 10a) et cultivé à 28 ° C dans l'obscurité pendant deux jours pour faire une plaque maîtresse. Une plaque de travail a été préparée en striant quatre ou cinq colonies de la plaque maîtresse cultivée au 12R sur un milieu 810K frais (tableau supplémentaire 10b) et en incubant une nuit dans l'obscurité à 28 ° C avant de l'utiliser pour une infection par Agrobacterium. Immédiatement avant la préparation du tissu foliaire des semis, Agrobacterium a été mis en suspension et dispersé dans un milieu d'infection 700F (tableau supplémentaire 11b).

Si les semis ont été disséqués manuellement (voir ci-dessous), un petit volume de solution d'infection (700F) a été préparé en mélangeant 10 ml de milieu 700J (tableau supplémentaire 11a), 20 µl d'acétosyringone (stock 100 mM) et 0,02 % (v/ v) tensioactif (BREAK-THRU S 233, Evonik Industries GmbH) dans un tube conique de 50 ml. Agrobacterium a été collecté à partir de la plaque de travail, transféré dans le milieu d'infection dans le tube de 50 ml, puis vortexé jusqu'à ce qu'il soit uniformément en suspension. La densité optique (DO) de la suspension a été mesurée à 550 nm et ajustée à une DO de 0,6. La suspension finale d'Agrobacterium a été aliquotée dans des plaques à six puits Corning contenant des inserts de culture perméables de 0,4 pm (Falcon, références 353046 et 353090, respectivement), chaque puits contenant environ 8 ml de la suspension.

Pour la fragmentation mécanisée des feuilles dans un robot culinaire Cuisinart Mini-Prep (voir ci-dessous), le mélange d'infection (700F) a été préparé en combinant 100 ml de milieu 700J, 200 µl d'acétosyringone et 0,02 % (v/v) BREAK-THRU S 223. Environ la moitié d'une plaque de travail complète d'Agrobacterium a été transférée dans le mélange de 100 ml et ajustée à une DO de 0,6 à 550 nm.

Les semis ont été cultivés comme décrit ci-dessus. Le segment de la base de la feuille (une section d'environ 2,5 à 3,0 cm au-dessus du mésocotyle) a été récolté sur chaque semis germé in vitro âgé de 12 à 18 jours avec des ciseaux stérilisés, et la feuille extérieure a été décollée et jetée. Les cylindres de base de feuilles restants ont été coupés longitudinalement en deux moitiés longitudinales à l'aide d'un stérilet no. 10 lames de bistouri. Les moitiés de verticille de feuille coupées en deux ont ensuite été disséquées manuellement ou traitées mécaniquement dans un mélangeur.

Les segments de verticille de feuille coupés en deux ont été coupés en explants de feuilles plus petits (~ 3 mm), qui ont été transférés dans un insert de culture perméable assis dans une plaque de culture à six puits contenant 8 ml de suspension préfabriquée d'Agrobacterium (moyen 700F, tableau supplémentaire 11b) et infecté pendant 20 min à température ambiante (Extended Data Fig. 2). Après infection, l'insert de culture contenant les segments de feuilles infectés par Agrobacterium a été retiré de la plaque à six puits et placé sur un papier filtre sec autoclavé pour capter et éliminer toute solution résiduelle d'Agrobacterium. Les segments de feuilles infectés ont ensuite été transférés sur un papier filtre frais (VWR de 7,5 cm de diamètre) reposant sur un milieu de co-culture solide 710N (tableau supplémentaire 12). Des forceps ont été utilisés pour disperser uniformément les segments de feuilles sur le papier filtre et pour s'assurer qu'ils avaient suffisamment d'espace pour se développer. Les tissus foliaires infectés ont été incubés à 21 °C dans l'obscurité pendant deux jours.

Les verticilles de feuilles coupées en deux ont été directement déposées dans le bol d'un robot culinaire Cuisinart Mini-Prep (MODÈLE DLC-1SSTG, préstérilisé à l'aide d'éthanol à 70%) contenant 100 ml de milieu d'infection Agrobacterium préfabriqué (700F). Pour chaque répétition expérimentale, le nombre total de verticilles de feuilles (correspondant au nombre total de semis utilisés pour produire chaque verticille de feuille bissecté) variait ; le nombre indiqué dans le tableau des résultats est le nombre de semis de départ dans chaque répétition. Les segments de feuilles ont été hachés au réglage à basse vitesse avec dix impulsions rapides. Les tissus foliaires hachés ont été laissés dans le récipient avec la suspension d'Agrobacterium pendant 20 min et agités doucement deux ou trois fois pendant cette période d'infection. Après l'infection, tous les tissus foliaires hachés de la suspension ont été versés dans un tamis à mailles en acier inoxydable autoclavé (article Target.com n° 53142252) pour drainer la suspension d'Agrobacterium. Les tissus foliaires infectés ont été transférés sur deux couches de papiers filtres autoclavés dans une boîte de Pétri vide pour sécher par buvardage la suspension résiduelle d'Agrobacterium. Les tissus foliaires infectés d'environ un ou deux semis ont ensuite été transférés sur un papier filtre autoclavé reposant sur la surface du milieu de co-culture solide 710N et dispersés uniformément. Les tissus foliaires infectés ont été incubés à 21 °C dans l'obscurité pendant deux jours.

Après deux jours de co-culture, les papiers filtres supportant les segments de feuilles ont été transférés de 710N à 13266P RM (tableau supplémentaire 13) et cultivés pendant une semaine dans l'obscurité à 28 ° C sans sélection. Les papiers filtres sous-tendant les fragments de tissu ont ensuite été transférés sur un milieu de sélection (13266P plus 150 mg l-1 G418 pour la sélection NptII ou 0, 1 mg l-1 ethametsulfuron pour la sélection Hra; voir les tableaux supplémentaires 14a, b, respectivement). Après trois semaines de culture sur milieu de sélection, les plaques ont été placées dans un incubateur à température/humidité contrôlée (45 °C/70 % HR) pendant deux heures pour stimuler le promoteur Hsp17 et induire l'excision médiée par Cre de Wus2, Bbm et Cre cassettes de recombinase. Les plaques ont été retirées de l'incubateur et maintenues à température ambiante pendant une à deux heures jusqu'à ce que les plaques aient refroidi.

Après le traitement thermique et l'équilibrage de la température à température ambiante, des segments de feuilles avec des embryons somatiques nouvellement développés ont été transférés sur un milieu de maturation 404 (tableau supplémentaire 15) sans papier filtre, cultivés dans l'obscurité à 28 ° C pendant deux semaines, puis déplacés dans un 26 °C chambre lumineuse pendant une semaine supplémentaire. Les segments de feuilles qui supportaient maintenant de petites pousses ont été transférés sur un milieu d'enracinement 272M (tableau supplémentaire 16) pendant deux à trois semaines supplémentaires jusqu'à ce que des racines bien formées se soient développées, moment auquel les plantules étaient prêtes à être transférées dans le sol de la serre. Pour garantir que chaque plante T0 soit un événement indépendant, seule la plantule à croissance la plus vigoureuse de chaque morceau de feuille (qui a souvent développé plusieurs embryons somatiques) a été transférée dans un milieu d'enracinement et finalement dans la serre.

Des analyses moléculaires de morceaux de feuilles transformés pour les niveaux de transcription de Wus2 et Bbm ont été effectuées comme décrit précédemment67 avec quelques modifications. En bref, l'ARN total a été isolé en broyant des échantillons dans du tampon de lyse RB (Omega Bio-tek), puis en ajoutant un volume égal d'éthanol à 70 % et en les transférant sur une plaque de purification de liaison Nunc Glass (Thermo Fisher Scientific) au sommet d'une profondeur de 2 ml. -plaque bien. Les plaques ont été recouvertes d'une feuille Qiagen AirPore (Qiagen), centrifugées et lavées séquentiellement avec le tampon de lavage ARN I et II (Omega Bio-tek). L'ARN a été élué avec de l'eau sans nucléase chauffée à 95 ° C après une incubation de deux minutes dans la plaque de liaison Nunc Glass suivie d'une centrifugation pour recueillir l'ARN dans une plaque à 96 puits. L'ADN a été retiré des échantillons d'ARN à l'aide de Roche Recombinant RNase-free DNAse I (Roche Diagnostics Corp.) et l'ADN complémentaire a été synthétisé à l'aide des kits de transcription inverse d'ADNc haute capacité Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant. Une PCR quantitative a été réalisée à l'aide de sondes d'hydrolyse. Les amorces et les sondes ont été conçues à l'aide du logiciel Applied Biosystems Primer Express. La PCR basée sur une sonde d'hydrolyse a été réalisée à l'aide du mélange Bioline Sensi-fast (Bioline) sur un instrument de PCR en temps réel Applied Biosystem Viia7 en utilisant les conditions du fabricant. L'expression relative des gènes a été calculée en normalisant par rapport au gène du facteur d'initiation eucaryote 4-Gamma du maïs (n° d'accès GenBank EU967723). Une liste des amorces et des sondes utilisées pour l'analyse de la transcription est donnée dans le tableau supplémentaire 17.

Des analyses moléculaires des événements d'abandon et d'insertion de gènes médiés par HDR ont été effectuées comme indiqué dans Peterson et al.36. La PCR quantitative a été réalisée avec le QuantiTect Multiplex PCR Master Mix (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant (sauf pour la détection HR1/HR2) sur un ViiA 7 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Le tableau supplémentaire 18 répertorie les amorces et les sondes utilisées pour détecter les produits d'abandon Wx1, les jonctions HR1/HR2, les composants d'ADN-T et les mutations du site cible HDR. Pour détecter les produits d'abandon Wx1 (110 paires de bases), les sites cibles Wx1 endogènes (3,8 kilobases) ont été flanqués d'amorces/sondes. Les amorces et les sondes ont été utilisées pour caractériser les composants de la cassette d'expression de l'ADN-T (Wus2, BBM, Cas9, gRNA et Hra) pour le nombre de copies de ségrégation T1 ainsi que les composants du produit d'insertion à médiation HDR (promoteur SiUbi, NptII et terminateur SiUbi). La caractérisation qPCR T1 offre la meilleure compréhension de l'intégrité de l'événement lorsqu'elle est couplée à une PCR couvrant un long insert en utilisant LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (New England Biolabs) suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose. Les amorces génomiques (amorce directe 5′-GCGTCGTGCTTACATGATG-3′ et amorce inverse 5′-GTGCGACATTAAACAGTGTTAGTTGTAGCC-3′) qui flanquent le site cible HDR ont été conçues pour amplifier à la fois le produit d'insertion intact (~ 5,0 kilobases) et l'allèle sans insertion (1,0 kilobases). Diverses insertions ou délétions indiquées par des tailles de bande variées existent et peuvent représenter une réparation de cassure double brin via la voie NHEJ36. La détection des jonctions HR a également été complétée par une détection basée sur des sondes fluorogènes. Bien que les tests (tableau supplémentaire 18) s'étendent de la région génomique aux produits d'insertion (HR1 (600 paires de bases) et HR2 (586 paires de bases)), des modifications du protocole de cycle qPCR standard ont permis la détection numérique des produits HR. Les paramètres de cycle suivants dans une approche de cycle en trois étapes ont été utilisés : dénaturation à 95 °C pendant 15 minutes suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C/20 s, recuit à 62 °C/60 s et extension à 68 °C/30 s. Le mélange réactionnel qPCR contenait 50 ng d'ADN matrice, 900 nM d'amorces et 100 nM de sonde. Bien que le produit HR1 contienne un arrière-plan fluorescent supplémentaire, l'utilisation d'un normalisateur propriétaire (VIC) de taille similaire a fourni une prédiction du nombre de copies basée sur la qPCR pour les deux jonctions. Le bruit de fond dans la réaction HR1 a été soustrait sur la base de valeurs de quantification plus élevées. Pour les événements de ségrégation positifs pour la PCR longue T1, les produits d'insertion complets ont été séquencés par Sanger avec les amorces indiquées dans le tableau supplémentaire 18. L'analyse SbS a été effectuée comme décrit par Zastrow-Hayes et al.30.

La comparaison des moyennes pour toutes les paires a été effectuée par des tests de différence honnêtement significatifs unilatéraux de Tukey-Kramer à l'aide de la version 16.0.0 de JMP (SAS Institute Inc.). Le nombre de répétitions utilisées dans chaque expérience est soit décrit dans les légendes des figures et tableaux respectifs, soit présenté sous forme de points de données individuels dans les tableaux.

Le tissu foliaire non transformé a été collecté après que le tissu a été coupé en petits fragments et fixé pour un examen histologique (voir ci-dessous). Des morceaux de tissus foliaires transformés cinq, dix et 15 jours après l'infection ont été collectés et placés dans un fixateur fraîchement préparé, glutaraldéhyde à 2, 5% (Electron Microscopy Sciences) dans un tampon phosphate, pH 7, 0, et fixés pendant une nuit à température ambiante. Le tissu a été lavé dans trois changements de tampon phosphate (trois à cinq minutes par changement), et les morceaux de tissu ont été déshydratés dans une série graduée d'éthanol à 100 % d'éthanol. Le matériau a été infiltré avec du Technovit 7100 activé (Heraeus Kulzer GmbH), en commençant par un mélange 1:1 de 100% éthanol:Technovit 7100 pendant une heure, suivi de deux changements de 100% Technovit 7100, le premier pendant une heure et le second pendant la nuit. Les échantillons ont été polymérisés dans des moules en polytétrafluoroéthylène après addition de 1 ml de durcisseur Technovit 7100 à 15 ml de Technovit 7100 activé. On a laissé la polymérisation se dérouler pendant une nuit sous vide dans un dessiccateur à vide.

Les sections ont été coupées à 2,5 µm avec un couteau en saphir sur un microtome (Leica 2050, Leica Biosystems). Les coupes ont été mises à flotter sur des gouttes d'eau distillée sur des lames de verre (Fisherbrand SuperFrost Plus) et séchées sur les lames sur une plaque chauffante à 50°C. Les coupes ont été colorées avec le réactif de Schiff à l'acide périodique pour les polysaccharides68 suivi d'une contre-coloration de cinq minutes pour les protéines avec 0,1 % de bleu noir d'aniline (dans 7,0 % d'acide acétique)69. Les images ont été capturées sur un microscope Nikon E800 équipé d'un appareil photo Nikon DS-Ri1 (Nikon).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que toutes les données étayant les conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires et données étendues. Corteva Agriscience fournira des plasmides aux chercheurs universitaires pour la recherche non commerciale dans le cadre d'un accord de transfert de matériel applicable sous réserve de la preuve de l'autorisation de tout propriétaire tiers de tout ou partie du matériel et de considérations réglementaires gouvernementales. L'élaboration d'un plan d'intendance est également requise. Les lignées consanguines de maïs Pioneer PH1V69, PH4257, PNSS01, 1PEEA63 et 1PYWK36 décrites dans cette recherche sont propriétaires.

Horsch, RB et al. Une méthode simple et générale pour transférer des gènes dans des plantes. Sciences 227, 1229-1231 (1985).

Article CAS Google Scholar

Potrykus, I. Transfert de gènes aux plantes : évaluation des approches et résultats publiés. Annu. Rév. Plant Physiol. Plante Mol. Biol. 42, 205-225 (1991).

Article CAS Google Scholar

Nasti, RA & Voytas, DF Atteindre la promesse de l'édition de gènes végétaux à grande échelle. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 118, e2004846117 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manghwar, H. et al. Systèmes CRISPR/Cas dans l'édition du génome : méthodologies et outils pour la conception d'ARNsg, l'évaluation hors cible et les stratégies pour atténuer les effets hors cible. Adv. Sci. 7, 1902312 (2020).

Article CAS Google Scholar

Wada, N., Ueta, R., Osakabe, Y. & Osakabe, K. Édition de précision du génome chez les plantes : état de l'art en matière d'ingénierie du génome basée sur CRISPR/Cas9. BMC Plant Biol. 20, 234 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zess, E. & Begemann, M. CRISPR-Cas9 et au-delà : quelle est la prochaine étape dans l'ingénierie du génome végétal. Cellule In Vitro. Dév. Biol. Usine 57, 584–594 (2021).

Article CAS Google Scholar

Jaganathan, D., Ramasamy, K., Sellamuthu, G., Jayabalan, S. et Venkataraman, G. CRISPR pour l'amélioration des cultures : une mise à jour. Devant. Usine Sci. 9 985 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Yassitepe, JE d. CT et al. Transformation du maïs : du matériel végétal à la diffusion de variétés génétiquement modifiées et éditées. Devant. Usine Sci. 12, 766702 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Gordon-Kamm, B. et al. Stratégies d'édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 : de la livraison à la production de plantes modifiées. Dans Willmann, MR (ed) Édition du génome pour la sélection de cultures de précision. 1-36 (Burleigh Dodds Science Publishing, Cambridge, 2021).

Lowe, K. et al. Les régulateurs morphogènes Baby boom et Wuschel améliorent la transformation des monocotylédones. Cellule végétale 28, 1998–2015 (2016).

Lowe, K. et al. Transformation rapide "indépendante" du génotype de Zea mays L. (maïs) par embryogenèse somatique directe. Cellule In Vitro. Dév. Biol. Usine 54, 240–252 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mookkan, M., Nelson-Vasilchik, K., Hague, J., Zhang, ZJ et Kausch, AP Transformation indépendante des marqueurs sélectionnables du maïs récalcitrant consanguin B73 et du sorgho P898012 médiée par les régulateurs morphogéniques BABY BOOM et WUSCHEL2. Plant Cell Rep. 36, 1477–1491 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nelson-Vasilchik, K., Hague, J., Mookkan, M., Zhang, ZJ et Kausch, A. Transformation de variétés de sorgho récalcitrantes facilitée par Baby Boom et Wuschel2. Courant. Protocole Végétal Biol. 3, e20076 (2018).

Masters, A. et al. Transformation d'embryons immatures médiée par Agrobacterium de lignées consanguines de maïs récalcitrantes à l'aide de gènes morphogéniques. J.Vis. Exp. 156, e60782 (2020).

Aesaert, S. et al. Optimisation de la transformation et de l'édition génétique du maïs public B104 consanguin par une culture tissulaire améliorée et l'utilisation de régulateurs morphogéniques. Devant. Usine Sci. 13, 883847 (2022).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoerster, G. et al. Utilisation de vecteurs Zm-Wus2 non intégrateurs pour améliorer la transformation du maïs. Cellule In Vitro. Dév. Biol. Usine 56, 265–279 (2020).

Che, P. et al. Wuschel2 permet une édition très efficace du génome ciblée par CRISPR/Cas lors de la régénération rapide des pousses de novo dans le sorgho. Commun. Biol. 5, 344 (2022).

Debernardi, JM et al. Une protéine chimérique GRF-GIF améliore l'efficacité de régénération des plantes transgéniques. Nat. Biotechnol. 38, 1274-1279 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, K. et al. Le gène TaWOX5 surmonte la dépendance génotypique dans la transformation génétique du blé. Nat. Plantes 8, 110–117 (2022).

Article PubMed Google Scholar

Toki, S. et al. L'infection précoce du tissu du scutellum par Agrobacterium permet une transformation à grande vitesse du riz. Plant J. 47, 969–976 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sahoo, RK & Tuteja, N. Développement d'une technologie de transformation médiée par Agrobacterium pour les tissus calleux matures dérivés de graines du cultivar de riz indica IR64. GM Crops Food 3, 123–128 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Thakur, T. et al. Transformation génétique efficace du riz pour l'édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 et les études de surexpression stable : une étude de cas sur les gènes codant pour la lipase 1 du riz et la galactinol synthase. Agronomie 12, 179 (2022).

Article CAS Google Scholar

Ahmadabadi, M., Ruf, S. & Bock, R. Un système de régénération et de transformation basé sur les feuilles pour le maïs (Zea mays L.). Transgénique Res. 16, 437–448 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tran, TN & Sanan-Mishra, N. Effet des antibiotiques sur la régénération des cals lors de la transformation du riz IR 64. Biotechnol. Rep. (Amst.) 7, 143–149 (2015).

Article PubMed Google Scholar

Oui, S. et al. Un système efficace de régénération et de transformation des plantes de bambou ma (Dendrocalamus latiflorus Munro) a commencé à partir de jeunes pousses comme explants. Devant. Usine Sci. 8, 1298 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zobrist, JD et al. Transformation de téosinte (Zea mays ssp. parviglumis) par bombardement biolistique de tissus calleux dérivés de semis. Devant. Usine Sci. 12, 773419 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, N., Kang, M., Zobrist, JD, Wang, K. & Fei, SZ Transformation génétique du panic raide récalcitrant à l'aide de gènes morphogéniques. Devant. Usine Sci. 12, 781565 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Beyene, G. et al. La mutation tétra-allélique médiée par CRISPR/Cas9 du gène SEMIDWARF-1 (SD-1) de la « révolution verte » confère une résistance à la verse dans le tef (Eragrostis tef). Biotechnologie Végétale. J. 20, 1716-1729 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anand, A. et al. L'invention concerne un système de vecteur ternaire amélioré pour la transformation rapide du maïs médiée par Agrobacterium. Plante Mol. Biol. 97, 187-200 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zastrow-Hayes, GM et al. Southern-by-sequencing : une approche de criblage robuste pour la caractérisation moléculaire des cultures génétiquement modifiées. Génome végétal 8, eplantgenome2014.2008.0037 (2015).

Article Google Scholar

Leopold, AC Antagonisme de certaines actions de la gibbérelline par une pyrimidine substituée. Physique Végétale. 48, 537–540 (1971).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gurel, S. et al. Transformation efficace et reproductible du sorgho médiée par Agrobacterium à l'aide d'un traitement thermique d'embryons immatures. Plant Cell Rep. 28, 429–444 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hiei, Y., Ishida, Y. & Komari, T. Progrès de la technologie de transformation des céréales médiée par Agrobacterium tumefaciens. Devant. Usine Sci. 5, 628 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, H. et al. Performances supérieures sur le terrain du maïs cireux conçu à l'aide de CRISPR–Cas9. Nat. Biotechnol. 38, 579-581 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gao, H. et al. Locus de traits complexes dans le maïs activés par l'insertion de gène médiée par CRISPR – Cas9. Devant. Usine Sci. 11, 535 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Peterson, D. et al. Les progrès de la transformation d'Agrobacterium et de la conception de vecteurs permettent d'insérer des gènes ciblés à haute fréquence dans le maïs. Biotechnologie Végétale. J. 19, 2000-2010 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aregawi, K. et al. La transformation assistée par morphogène de Sorghum bicolor permet une édition plus efficace du génome. Biotechnologie Végétale. J. 20, 748–760 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Q. et al. Un nouveau système de vecteur ternaire associé à des gènes morphogéniques améliore la délivrance de CRISPR/Cas chez le maïs. Physique Végétale. 181, 1441-1448 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barone, P. et al. Ciblage génique efficace dans le maïs à l'aide de CRISPR-Cas9 inductible et d'un modèle de donneur sans marqueur. Mol. Usine 13, 1219-1227 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kong, J. et al. La surexpression du facteur de transcription GROWTH-REGULATING FACTOR5 améliore la transformation des espèces de dicotylédones et de monocotylédones. Devant. Usine Sci. 11, 572319 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wernicke, W. & Milkovits, L. Gradients de développement dans les feuilles de blé - réponse des segments de feuilles dans différents génotypes cultivés in vitro. J. Plant Physiol. 115, 49–58 (1984).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rajyalakshmi, K., Grover, A., Maheshwari, N., Tyagi, AK & Maheshwari, SC Régénération à haute fréquence des plantules à partir des bases des feuilles via l'embryogenèse somatique et la comparaison des profils polypeptidiques des cals morphogènes et non morphogènes du blé ( Triticum aestivum). Physiol. Usine. 82, 617–623 (1991).

Article CAS Google Scholar

Haliloglu, K. Système de régénération efficace à partir de segments de base de feuilles de blé. Biol. Usine. 50, 326–330 (2006).

Article CAS Google Scholar

Yu, G.-r et al. Optimisation du système de transformation d'embryons immatures à médiation par Agrobacterium tumefaciens et transformation du gène résistant au glyphosate 2mG2-EPSPS chez le maïs (Zea mays L.). J. Intégr. Agric. 12, 2134-2142 (2013).

Article Google Scholar

Chen, Z., Zhuge, Q. & Sundqvist, C. Base de feuille d'avoine : tissu avec une capacité de régénération efficace. Plant Cell Rep. 14, 354-358 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gless, C., Lörz, H. & Jähne-Gärtner, A. Mise en place d'un système de régénération hautement efficace à partir de segments de base de feuilles d'avoine (Avena sativa L.). Plant Cell Rep. 17, 441–445 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pasternak, TP, Rudas, VA, Lörz, H. & Kumlehn, J. Formation de cals embryogènes et régénération des plantes à partir des segments de base des feuilles d'orge (Hordeum vulgare L.). J. Plant Physiol. 155, 371–375 (1999).

Article CAS Google Scholar

Becher, T., Haberland, G. & Koop, HU Formation de cals et régénération des plantes dans les microexplants standard et à partir de semis d'orge (Hordeum vulgare L.). Plant Cell Rep. 11, 39–43 (1992).

Article CAS PubMed Google Scholar

Haliloglu, K. & Aydin, M. Système de régénération efficace à partir de segments de base de feuilles de seigle. Springerplus 5, 2005 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramesh, M., Murugiah, V. & Gupta, AK Régénération efficace des plantes in vitro via des segments de base de feuilles de riz indica (Oryza sativa L.). Indian J. Exp. Biol. 47, 68-74 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Yaguinuma, DH, Takamori, LM, Mendonça de Oliveira, A., Vieira, LGE & Ribas, AF Régénération in vitro à partir de segments de base de feuilles dans trois génotypes d'Urochloa spp. Culture Pâturage Sci. 69, 527–534 (2018).

Article CAS Google Scholar

Karthikeyan, A., Shilpha, J., Karutha Pandian, S. & Ramesh, M. Transformation médiée par Agrobacterium du riz indica cv. ADT 43. Plant Cell Tissue Organ Cult. 109, 153–165 (2012).

Article CAS Google Scholar

Denchev, PD, Songstad, DD, McDaniel, JK & Conger, BV Plantes transgéniques de dactyle pelotonné (Dactylis glomerata) par embryogenèse directe à partir de cellules foliaires bombardées par des microprojecticules. Plant Cell Rep. 16, 813–819 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dekeyser, RA et al. Expression génique transitoire dans des tissus de riz intacts et organisés. Cellule végétale 2, 591–602 (1990).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chugh, A. & Khurana, P. Régénération via l'embryogenèse somatique à partir des segments basaux des feuilles et transformation génétique du pain et de l'amidonnier par bombardement de particules. Culture d'organes de tissus de cellules végétales. 74, 151–161 (2003).

Article CAS Google Scholar

Kirienko, DR, Luo, A. & Sylvester, AW Transformation transitoire fiable de cellules de feuilles de maïs intactes pour la génomique fonctionnelle et l'étude expérimentale. Physique Végétale. 159, 1309-1318 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, Y., Chen, X., Song, R. & Qi, W. Mise en place d'un système de transformation génétique bivecteur dans des lignées consanguines de maïs récalcitrantes. Agriculture 11, 663 (2021).

Article Google Scholar

Hiei, Y., Ishida, Y., Kasaoka, K. & Komari, T. Amélioration de la fréquence de transformation du riz et du maïs par le traitement d'embryons immatures par centrifugation et chaleur avant l'infection par Agrobacterium tumefaciens. Culture d'organes de tissus de cellules végétales. 87, 233-243 (2006).

Article Google Scholar

Feng, M.-Q. et coll. miR156 régule l'embryogenèse somatique en modulant l'accumulation d'amidon dans les agrumes. J. Exp. Bot. 73, 6170–6185 (2022).

Article PubMed Google Scholar

Wu, G., Wei, X., Wang, X. et Wei, Y. Modifications de la biochimie et des caractéristiques histochimiques au cours de l'embryogenèse somatique chez Ormosia henryi Prain. Culture d'organes de tissus de cellules végétales. 144, 505–517 (2021).

Article CAS Google Scholar

Wang, Y., Chen, F., Wang, Y., Li, X. & Liang, H. Embryogenèse somatique efficace et régénération végétale à partir d'embryons immatures de Tapiscia sinensis Oliv., une espèce endémique et menacée en Chine. HortScience 49, 1558-1562 (2014).

Article Google Scholar

Kang, M. et al. L'invention concerne une méthode améliorée de transformation et d'édition du génome médiée par Agrobacterium pour le maïs B104 consanguin utilisant un système de vecteur ternaire et des embryons immatures. Devant. Usine Sci. 13, 860971 (2022).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Vasil, V., Lu, C.-Y. & Vasil, IK Histologie de l'embryogenèse somatique dans des embryons immatures cultivés de maïs (Zea mays L.). Protoplasme 127, 1–8 (1985).

Article Google Scholar

McCain, JW & Hodges, TK Anatomie d'embryons somatiques issus de cultures d'embryons de maïs. Bot. Gaz. 147, 453–460 (1986).

Article Google Scholar

Conger, BV, Hanning, GE, Gray, DJ & McDaniel, JK Embryogenèse directe à partir de cellules mésophylles de dactyle pelotonné. Sciences 221, 850–851 (1983).

Article CAS PubMed Google Scholar

Khanday, I., Skinner, D., Yang, B., Mercier, R. et Sundaresan, V. Un déclencheur embryogène de riz exprimé par un mâle redirigé pour la propagation asexuée par les graines. Nature 565, 91–95 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Stephenson, E. et al. La surexpression du régulateur de réponse photopériodique ZmCCT10 modifie l'architecture de la plante, le temps de floraison et la morphologie de l'inflorescence chez le maïs. PLoS ONE 14, e0203728 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Brien, TP & McCully, ME L'étude de la structure végétale : principes et méthodes choisies. (Termarcarphi Pty. Ltd., Melbourne, 1981).

Fisher, DB Localisation de l'activité endogène de l'ARN polymérase dans des coupes congelées de tissus végétaux. J. Cell Biol. 39, 745–749 (1968).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Des pousses micro-propagées de Saccharum officinarum (variété de canne à sucre CPCL02) et de Panicum virgatum (variété de panic raide Alamo) ont été fournies par les laboratoires de F. Altpeter (Université de Floride) et W. Parrott (Université de Géorgie), respectivement, pour une utilisation dans le expérience de dépistage de la transformation des feuilles.

Ajith Anand

Adresse actuelle : MyFloraDNA, Woodland, Californie, États-Unis

Corteva Agriscience, Johnston, Iowa, États-Unis

Ning Wang, Larisa Ryan, Nagesh Sardesai, Emily Wu, Brian Lenderts, Keith Lowe, Ping Che, Ajith Anand, Andrew Worden, Daleen van Dyk, Pierluigi Barone, Sergei Svitashev, Todd Jones et William Gordon-Kamm

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NO, LR, NS, EW, AA, KL, PC, PB, SS, TJ et WG-K. conçu les expériences. NW, LR, BL, AW, DvD et TJ ont mené les expériences. Tous les auteurs ont contribué à l'analyse des résultats, ainsi que NW, LR, NS, EW, BL, AW, DvD, PB, SS, TJ et WG-K. contribué à la rédaction du manuscrit.

Correspondance à William Gordon-Kamm.

NW, LR, NS, EW, BL, KL, PC, AA, AW, DvD, PB, SS, TJ et WG-K. ont des intérêts concurrents en raison de leur emploi chez Corteva Agriscience au moment où cette recherche a été menée. L'employeur des auteurs (Corteva Agriscience) a demandé et obtenu des brevets couvrant un ou plusieurs aspects de ce travail.

Nature Plants remercie Sadiye Hayta, Kirankumar Mysore et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, image de fluorescence de l'expression transitoire de ZsGreen1 quatre jours après l'infection par Agrobacterium avec PHP97334. b, foyers fluorescents indépendants en croissance lorsque les embryons somatiques commencent à se développer neuf jours après l'infection. c, Grossissement supérieur neuf jours après l'infection montrant des embryons somatiques fluorescents émergeant de la surface de la feuille. df, micrographies de coupes transversales de tissu foliaire colorées avec PAS et contre-colorées avec de l'aniline bleu noir, montrant d, de petits groupes de cellules en division représentant des embryons somatiques en développement précoce (flèches) dans des segments de feuilles cinq jours après l'infection, e, groupe de divisions cellules prêtes à émerger à travers la couche épidermique dans les segments foliaires dix jours après l'infection, et f, embryons somatiques plus grands poussant à travers la surface de la feuille (flèches) dans les segments foliaires 15 jours après l'infection. Voir la fin de la section supplémentaire pour les méthodes d'histologie. Les images sont représentatives de plus de dix expériences indépendantes.

a, suspension d'Agrobacterium aliquotée dans des inserts de culture perméables placés dans une plaque de culture à six puits. b, Semis de maïs représentant la région récoltée pour la préparation manuelle des explants. c, explants de tissus foliaires coupés manuellement dans une suspension d'Agrobacterium. d, e, Tissus foliaires dans un insert de culture perméable avec un excès de suspension d'Agrobacterium épongé, et tissus foliaires cultivés sur un papier filtre reposant sur la surface d'un milieu solide.

Expression transitoire de ZsGreen1 trois à quatre jours après l'infection par Agrobacterium (panneaux de gauche), démontrant la livraison relative d'ADN-T. Formation d'un cal embryogène fluorescent vert trois à quatre semaines après l'infection (panneaux de droite). Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes.

a,b, Sections de tissu de base de feuilles de maïs provenant de semis âgés de 14 jours cultivés en l'absence (a) ou en présence (b) de 2 mg/l d'ancymidol. Les coupes sont colorées avec de l'acide périodique Schiff pour les polysaccharides et du bleu-noir d'aniline pour les protéines. La flèche indique les amyloplastes colorés en magenta. Notez la présence importante d'amyloplastes dans le mésophylle en développement du tissu foliaire traité à l'ancymidol et l'absence générale d'amyloplastes dans les tissus cultivés en l'absence d'ancymidol. Barre d'échelle = 50 µm.

Tableaux supplémentaires 1 à 18, description des méthodes d'histologie et références.

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Réimpressions et autorisations

Wang, N., Ryan, L., Sardesai, N. et al. Transformation foliaire pour une intégration aléatoire efficace et une modification ciblée du génome chez le maïs et le sorgho. Nat. Plantes 9, 255–270 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01338-0

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Reçu : 22 août 2022

Accepté : 21 décembre 2022

Publié: 09 février 2023

Date d'émission : février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41477-022-01338-0

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