Les feuilles de cellules de fibroblastes multicouches conservées à sec sont un nouvel outil gérable pour la médecine régénérative pour favoriser la cicatrisation des plaies

Apr 03, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12519 (2022) Citer cet article

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Cette étude a examiné les effets thérapeutiques des feuilles de cellules de fibroblastes multicouches conservées à sec (feuilles sèches) sur les ulcères cutanés. Des feuilles sèches ont été préparées en séchant à l'air des feuilles de cellules de fibroblastes multicouches (feuilles vivantes) pour cesser leurs activités vitales. Avant l'application in vivo, nous avons testé la libération de facteurs de croissance dans le milieu pour examiner les mécanismes des feuilles sèches dans la cicatrisation des plaies. Le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) ont été libérés à la fois des feuilles sèches et vivantes, tandis que des niveaux élevés de facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2) et de protéine du groupe de mobilité élevée 1 (HMGB1) provenaient uniquement de feuilles sèches. Un test de prolifération des fibroblastes in vitro a révélé que l'éluat de la feuille sèche a considérablement amélioré la prolifération cellulaire et la production de VEGF et de HGF par rapport à l'éluat de la feuille vivante. Les anticorps neutralisant le FGF-2 ont significativement bloqué cette réponse proliférative. Dans les plaies créées sur des souris diabétiques, les groupes de traitement par feuille sèche utilisant des cellules autologues ou allogéniques ont montré une fermeture de plaie significativement accélérée par rapport à celle du groupe sans traitement. La stabilité au stockage de la feuille sèche était meilleure à température de réfrigération qu'à température ambiante et est restée stable pendant au moins 4 semaines. Nos données ont indiqué que les feuilles sèches allogéniques représentent un nouvel outil prometteur pour la médecine régénérative qui favorise la cicatrisation des plaies.

La technologie des feuilles cellulaires a été récemment développée pour améliorer la rétention des cellules transplantées dans la région greffée1, et la thérapie par greffe de feuilles cellulaires a été utilisée pour prévenir diverses maladies et complications postopératoires, notamment la cardiomyopathie ischémique, les fuites d'air après des opérations pulmonaires et la sténose après endoscopie sous-muqueuse. dissection de l'œsophage2,3,4. Cette technique peut également être utilisée pour traiter les ulcères cutanés.

Auparavant, nous avons développé une feuille de cellules mixtes composée de fibroblastes et de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMNC), qui augmentait la sécrétion du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) des fibroblastes par les effets synergiques de la co-culture avec les PBMNC et le traitement du préconditionnement hypoxique5 ,6. L'un des principaux mécanismes d'action des effets thérapeutiques des feuillets cellulaires implique un effet paracrine dû à la production de facteurs de croissance et de cytokines à partir des feuillets cellulaires. Il a été démontré que des feuilles de cellules mixtes réussissaient à cicatriser des plaies pour des modèles d'ulcères cutanés de souris et de lapin5,6. Dans nos travaux précédents, nous avons développé une méthode simple pour fabriquer des feuilles de cellules multicouches et signalé l'utilité de feuilles mixtes multicouches autologues, qui ont été traitées avec un préconditionnement hypoxique, dans un modèle d'ulcère cutané de souris7. En outre, dans une étude clinique dans laquelle une feuille de cellules mixtes multicouches autologues préconditionnées hypoxiques contenant des PBMNC et des cellules de fibroblastes de la muqueuse buccale humaine a été transplantée sur un ulcère de jambe, ces effets favorisant la sécurité et la cicatrisation des plaies ont été confirmés8. Cependant, trois des six cas n'ont pas abouti à une transplantation : un en raison d'un manque de croissance des cellules fibroblastiques, tandis que les deux autres ne répondaient pas aux critères de transplantation en raison d'une faible production de VEGF8. Cette étude clinique utilisant des cellules autologues a également révélé un taux élevé de mauvaise performance des fibroblastes des patients. La thérapie par feuille de cellules utilisant des cellules autologues est une méthode prometteuse avec le potentiel de traiter avec succès les patients, nécessitant un approvisionnement stable de feuilles de cellules préparées à l'aide de cellules allogéniques. Le but des PBMNC autologues dans les feuillets cellulaires mixtes était d'améliorer la capacité de sécrétion des fibroblastes. Cependant, la superposition de feuilles de cellules a suffisamment amélioré la fonction des feuilles de fibroblastes, et il y avait peu de différence entre les effets des fibroblastes seuls et des feuilles de cellules mixtes dans un modèle d'ulcère cutané chez la souris7. Nous avons confirmé que suffisamment de facteurs de croissance étaient sécrétés par les feuilles de cellules de fibroblastes multicouches et que l'effet cicatrisant des feuilles de cellules de fibroblastes multicouches allogéniques était comparable à celui des feuilles de cellules autologues dans un modèle d'ulcère de souris. Bien qu'une certaine immunité locale se produise, cela n'affecte pas négativement la cicatrisation des plaies9. Ainsi, lors de l'examen de l'application clinique de la thérapie de transplantation de feuilles de cellules, des feuilles de cellules préparées à partir de cellules allogéniques qui peuvent être fournies de manière stable peuvent représenter la meilleure approche.

Pour améliorer la commodité et l'adoption de la thérapie par feuille de cellules, il sera essentiel de développer une méthode simple de préservation des feuilles de cellules qui peut être utilisée rapidement. Une option est l'utilisation de feuilles de matrice extracellulaire (ECM), qui sont décellularisées par congélation-décongélation10. Ces feuilles présentent les avantages de la stabilité au stockage et des taux de rejet immunitaire plus faibles et agissent comme un échafaudage pour les cellules lorsqu'elles sont transplantées10,11. Cependant, ils retiennent peu de substances bioactives en raison des dommages cellulaires causés par le gel-dégel. Sinon, la conservation à sec est la méthode optimale en termes de commodité. Des études sur des feuilles de cellules épidermiques lyophilisées12,13 et des feuilles de membrane amniotique14,15 ont été menées ; cependant, il n'y a pas encore de rapports sur les feuilles de fibroblastes conservées à sec. Par conséquent, dans cette étude, nous avons cherché à développer une feuille de cellules de fibroblastes multicouches conservées à sec (feuille sèche) et à évaluer ses effets thérapeutiques à l'aide de fibroblastes allogéniques dans un modèle d'ulcère cutané de souris. Pour vérifier l'efficacité des feuilles sèches, nous les avons comparées à des feuilles de congélation-décongélation (feuilles FT), qui ne contiennent presque pas de contenu cellulaire après des cycles répétés de congélation-décongélation, et à des feuilles de cellules de fibroblastes multicouches (feuilles vivantes). Toutes les feuilles de cellules, les feuilles vivantes, sèches et FT utilisées dans cette étude ont été produites à partir de feuilles de cellules de fibroblastes multicouches préconditionnées hypoxiques, qui ont été rapportées précédemment7, car le préconditionnement hypoxique est efficace pour augmenter le pouvoir sécrétoire des fibroblastes5,6. Préalablement à l'application in vivo, la libération de facteurs de croissance dans le milieu a été testée pour étudier les mécanismes d'action des feuilles sèches dans la cicatrisation des plaies. On ne s'attend pas à ce que les feuilles sèches sécrètent des facteurs angiogéniques tels que le VEGF et le facteur de croissance des hépatocytes (HGF), qui sont sécrétés par des feuilles vivantes. Cependant, le séchage peut endommager les membranes cellulaires et la libération de substances intracellulaires lors de la réhydratation. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2)16,17,18,19,20 et la protéine HMGB1 (High Mobility Group Box 1)21,22,23,24,25,26, qui sont libérées des cellules endommagées et participent à la cicatrisation des plaies. Nous avons recherché si ces facteurs de croissance sont libérés des feuilles sèches dans le milieu et s'ils conservent leurs activités biologiques.

Des fibroblastes primaires cultivés, dérivés de peau de queue de souris (C57BL/6N), ont été ensemencés à 4,2 × 105 cellules par puits dans des plaques de culture normales à 24 puits pour former une feuille de cellules multicouches, puis les cellules ont été incubées dans des conditions normoxiques (37 °C, 5 % CO2, 20 % O2) pendant 2 jours, suivis de conditions hypoxiques (33 °C, 5 % CO2, 2 % O2) pendant 1 jour pour le traitement du préconditionnement hypoxique5,6,7. Après incubation, les feuilles de cellules de fibroblastes multicouches ont été délicatement détachées des plaques de culture après traitement à la dispase pour être utilisées comme feuilles vivantes dans cette étude. Comme le montre la figure 1a, les feuilles sèches et les feuilles FT ont été produites à partir de feuilles vivantes par séchage à l'air pendant 30 minutes ou cycles de congélation-décongélation, respectivement. De plus amples détails sont fournis dans la section "Matériel et méthodes". Les observations morphologiques de chaque feuillet cellulaire sont présentées à la Fig. 1b. La feuille vivante a rétréci à environ la moitié de sa taille attachée après détachement des plaques de culture. La feuille sèche était suffisamment dure pour être saisie par une pince à épiler, tout en conservant sa structure (Fig. S1 supplémentaire). La feuille FT était plus transparente que la feuille vivante.

Préparation et analyse histologique de feuillets cellulaires. ( a ) Schéma de principe de la fabrication de feuilles de cellules de fibroblastes multicouches, de feuilles de cellules de fibroblastes multicouches conservées à sec et de feuilles de congélation-décongélation (FT). (b) Observations morphologiques des feuilles vivantes, sèches et FT. Chaque feuille de cellules a été placée dans un puits de la plaque à 24 puits (barre d'échelle = 5 mm). ( c ) Coupes transversales des feuilles vivantes, sèches et FT avec coloration HE (barre d'échelle = 50 µm). ( d ) Coupes transversales des feuilles vivantes, sèches et FT avec coloration Azan (barre d'échelle = 50 µm). (e) Coupes transversales des feuilles vivantes, sèches et FT avec coloration immunofluorescente de collagène de type I (rouge) et DAPI (bleu) (barre d'échelle = 50 µm). ( f ) Épaisseur moyenne de chaque feuille de cellule. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (*P < 0,05, test de Tukey-Kramer, n = 6 par groupe). ( g ) Nombre moyen de couches dans chaque feuille de cellule. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (test de Tukey-Kramer, n = 6 par groupe). ( h ) Nombre moyen de noyaux dans chaque feuille de cellule. Le nombre de noyaux à moins de 100 μm le long du grand axe a été mesuré dans des sections de chaque feuille de cellules. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (** P < 0,01, test de Tukey-Kramer, n = 6 par groupe). Vivre : draps vivants ; Sec : feuilles sèches ; FT : feuilles gel-dégel.

Les coupes transversales de chaque feuille (c'est-à-dire vivante, sèche ou FT) colorées à l'hématoxyline-éosine (HE) et à l'Azan sont illustrées aux Fig. 1c, d. Toutes les feuilles étaient en couches multicellulaires. La feuille sèche (21 ± 4,2 µm) était légèrement plus fine que la feuille vivante (25,7 ± 5,1 µm) et comportait cinq à sept couches (Fig. 1f, g). Sur la feuille sèche, il y avait de légers changements morphologiques dans les noyaux cellulaires, qui ont gonflé et sont devenus plus variables en taille. Le nombre de noyaux par 100 μm de longueur de la feuille était significativement plus élevé sur la feuille sèche, probablement en raison du plus petit volume après séchage (Fig. 1h). Les changements étaient relativement importants sur la feuille FT, dans laquelle le nombre de noyaux et de chromatine était considérablement réduit. Des zones bleues (indiquant le collagène par coloration Azan) et des zones rouges (indiquant le collagène ECM de type I, tel que révélé par immunocoloration fluorescente) ont été trouvées sur les trois feuilles ; leur proéminence a été classée dans l'ordre des feuilles vivantes, sèches et FT (voir Fig. 1e).

Les feuilles de cellules ont été séchées à l'air sur un banc bio-propre dans les conditions suivantes : une température de 30,7 °C (allant de 27,6 à 31,4 °C), une humidité de 39,6 % (allant de 31,1 à 49,6 %) et une vitesse du vent allant de 0,1 à 0,4 m/s. Le changement de poids de la feuille vivante à la feuille sèche pendant le séchage à l'air a été mesuré. Le poids moyen du drap vivant était de 6,9 ​​mg. Le séchage à l'air a diminué la teneur en eau de la feuille de cellules et le poids de la feuille de cellules a atteint l'équilibre à une moyenne de 13,7 min (9, 12 et 20 min) à partir de trois expériences indépendantes. Le poids moyen d'une feuille sèche ayant atteint l'équilibre était de 0,31 mg (Fig. 2a). La surface moyenne de la feuille sèche était de 0,31 cm2/feuille et la teneur en humidité de la feuille sèche, mesurée par la méthode de Karl Fischer, était de 3,2 %. La vitesse de séchage initiale était de 7,9 mg/min.cm2.

Étude du changement de poids et de la cytotoxicité des feuillets cellulaires avec le temps de séchage. (a) Changements dans le poids d'une feuille de cellules de fibroblastes multicouches pendant le temps de séchage sur le banc bio-nettoyant. Le poids moyen d'un drap vivant était de 6,9 ​​mg. Pendant le séchage, le poids moyen était de 0,31 mg après une moyenne de 13,7 min. Trois expériences indépendantes ont été réalisées. Les lignes pleines et pointillées indiquent respectivement le poids et la vitesse de séchage initiale. ( b ) Coloration DAPI de feuilles vivantes et sèches non fixées. Des feuilles vivantes immergées dans du méthanol ont été utilisées comme contrôle positif et des feuilles de cellules attachées comme contrôle négatif (barre d'échelle = 50 µm). ( c ) Évaluation de la relation entre le temps de séchage des feuilles cellulaires et les dommages à la membrane cellulaire par test de libération de LDH en utilisant la feuille vivante immergée dans du tampon de lyse comme témoin positif et le PBS comme témoin négatif. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± ET (**P < 0,01, ns : non significatif versus contrôle positif, test de Tukey-Kramer, n = 6 par groupe). ( d ) Observation de la capacité adhésive des feuilles de cellules après 24 h de re-culture. Les feuilles vivantes (à gauche) ont adhéré à la boîte de culture et on a observé que les fibroblastes migraient depuis les bords, mais pas dans les feuilles sèches (à droite ; barre d'échelle = 50 µm). ( e ) Évaluation de l'activité métabolique cellulaire d'une feuille de cellules re-cultivées de 24 h par le réactif WST-8. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (**P < 0,01, ns : non significatif, test de Tukey-Kramer, n = 4 par groupe). Milieu : CTS AIM-V + 10 % FBS.

Pour évaluer la mort cellulaire due au séchage, des feuilles de cellules non fixées ont été colorées avec du 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour détecter les dommages à la membrane cellulaire. Seuls certains des noyaux ont été colorés au DAPI dans les feuilles vivantes (Fig. 2b). À 5, 10 et 15 minutes de séchage, les noyaux des feuilles de cellules ont été colorés avec du DAPI à partir de la périphérie de la feuille de cellules, mais il y avait des zones non colorées au centre des feuilles de cellules (Fig. S2 supplémentaire). Presque tous les noyaux des feuilles séchées pendant 30 min ont été colorés au DAPI (Fig. 2b). Cette observation suggère que la perméabilité de la membrane cellulaire a été affectée par le processus de séchage. Pour évaluer quantitativement les membranes cellulaires endommagées, un test de libération de lactate déshydrogénase (LDH) a été effectué pour étudier la relation entre le temps de séchage et la proportion de cellules endommagées. Par rapport au contrôle positif (le drap vivant traité avec du tampon de lyse), le taux de libération de LDH était de 21 % dans le drap vivant. Le taux de libération de LDH augmentait avec la durée du séchage et était de 88% à 10 min, 92% à 15 min et ≥ 98% après 30 min, correspondant à l'atteinte d'un poids sec d'équilibre (Fig. 2c).

Pour confirmer la survie des cellules, les feuillets cellulaires ont été remis en culture pendant 24 h. La feuille vivante a adhéré à la surface inférieure de la boîte de culture et les fibroblastes ont migré de la marge de la feuille, alors que dans la feuille sèche, il n'y avait pas d'adhérence à la boîte de culture ni de migration de fibroblastes (Fig. 2d). Les feuilles de cellules sèches cultivées pendant 24 h ne présentaient aucune activité métabolique et l'absorbance était comparable à celle du milieu de culture (Fig. 2e). Ces résultats démontrent que les membranes cellulaires sur la feuille sèche ont été considérablement affaiblies par le séchage et que le séchage de la feuille a irréversiblement cessé l'activité vitale, reflétant la mort cellulaire.

En prenant ces observations ensemble, le temps de séchage a été fixé à 30 min pour assurer des conditions de séchage fiables. Par conséquent, les expériences suivantes ont été réalisées en utilisant une feuille sèche qui a été séchée à l'air pendant 30 min et stockée à température ambiante (23 ° C) jusqu'à 1 semaine.

Pour évaluer les facteurs de croissance et les cytokines restant dans les feuilles sèches à l'aide des surnageants des feuilles de cellules lysées, nous avons mesuré les niveaux de VEGF, HGF, FGF-2 et HMGB1 à l'aide d'ELISA. Dans les feuilles sèches, la quantité de chaque facteur de croissance était équivalente à celle des feuilles vivantes, tandis que les feuilles FT présentaient des valeurs nettement inférieures (Fig. 3a). Nous avons ensuite examiné si ces facteurs de croissance étaient libérés des feuilles sèches dans le milieu. Chaque feuille de cellules a été immergée dans 200 µL de milieu et incubée pendant 24 h, suivie de la collecte des surnageants de la feuille de cellules immergée. Le VEGF et le HGF ont été détectés à la fois dans les éluats de feuille vivante et de feuille sèche, tandis que FGF-2 et HMGB1 n'ont été détectés que dans l'éluat de feuille sèche (Fig. 3b). Nous avons en outre étudié la localisation de FGF-2 et HMGB1 dans chaque feuille de cellules par coloration indirecte par immunofluorescence. Le FGF-2 était principalement localisé dans le cytoplasme des feuilles vivantes et sèches, mais n'a pas été détecté dans les feuilles FT (Fig. 3c). HMGB1 s'est avéré être principalement colocalisé au noyau cellulaire dans les feuilles vivantes et sèches, mais n'a pas été détecté dans les feuilles FT (Fig. 3d). De plus, les signaux d'immunocoloration pour FGF-2 et HMGB1 ont été nettement diminués dans les feuilles sèches après immersion (Fig. S3 supplémentaire). Ces observations démontrent que le FGF-2 intracellulaire et le HMGB1 dans les feuilles sèches étaient facilement libérés des cellules parce que la membrane cellulaire et l'enveloppe nucléaire étaient affaiblies par le séchage à l'air.

Facteurs de croissance et cytokines dans la feuille sèche libérée des cellules. (a) Le niveau de rétention des facteurs de croissance de chaque feuille de cellule. La concentration de VEGF, HGF, FGF-2 et HMGB1 du surnageant de chaque lysat de feuillet cellulaire telle que mesurée par ELISA. Le lysat a été préparé en immergeant la feuille de cellules dans 200 µL de tampon de lyse cellulaire 2. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (** P < 0,01, ns : non significatif, test de Tukey-Kramer, n = 3 par groupe). (b) Libérer des quantités de facteurs de croissance de chaque feuille de cellule. Concentrations de VEGF, HGF, FGF-2 et HMGB1 du surnageant des échantillons d'éluat telles que mesurées par ELISA. Les échantillons d'éluat ont été préparés en immergeant chaque feuille de cellules dans 200 µL de CTS AIM-V avec 10 % de FBS pendant 24 h dans des conditions normoxiques. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (** P < 0,01, test de Tukey-Kramer, n = 4 par groupe). Des différences significatives ont été examinées uniquement entre les feuilles vivantes, sèches et FT. Sup. de culture : Surnageant de culture au moment de la préparation de la feuille (CTS AIM-V + HFDM-1(+) + 5 % FBS), Milieu : CTS AIM-V + 10 % FBS. ( c ) Coupes transversales des feuilles vivantes, sèches et FT avec coloration par immunofluorescence de FGF-2 (rouge) et DAPI (bleu); (barre d'échelle = 50 µm). ( d ) Coupes transversales des feuilles vivantes, sèches et FT avec coloration par immunofluorescence de HMGB1 (rouge) et DAPI (bleu; barre d'échelle = 50 µm). Vivre : draps vivants ; Sec : feuilles sèches ; FT : feuilles gel-dégel.

Pour étudier la bioactivité de l'éluat de feuille sèche, nous avons examiné la prolifération cellulaire et la production de VEGF et HGF dans les fibroblastes in vitro. Les fibroblastes ont été cultivés pendant 48 h avec du milieu et de l'éluat mélangés dans un rapport de 1:1. L'éluat de la feuille sèche était 1, 75 fois plus élevé que le témoin et présentait une prolifération cellulaire significativement plus élevée que l'éluat de la feuille vivante ou FT (Fig. 4a). Ensuite, les concentrations de VEGF et de HGF dans les surnageants de culture ont été mesurées (Fig. 4b, c). Des quantités importantes de VEGF et de HGF ont été détectées dans l'éluat sec avec des fibroblastes par rapport à celles du témoin, alors que des niveaux élevés de VEGF et de HGF n'ont pas été détectés dans l'éluat sec sans fibroblastes, comme le montre la figure 3b. Cela pourrait être dû à la stabilité des facteurs de croissance pendant 48 h d'incubation. Par conséquent, les différences entre les valeurs d'éluat avec et sans fibroblastes ont été considérées comme les teneurs en VEGF et HGF nouvellement produites à partir de fibroblastes en raison de la stimulation de l'éluat et comparées en tant que rapport au témoin (Fig. 4d, e). L'éluat de feuille sèche induit des taux de production de VEGF et HGF significativement plus élevés à 1,53 et 4,64 fois ceux du témoin. Ces résultats démontrent que l'éluat de feuille sèche avait des effets biologiques sur les cellules.

Prolifération cellulaire accrue, production de VEGF et de HGF dans les fibroblastes par l'éluat de feuilles sèches. Des échantillons d'éluat ont été préparés en immergeant chaque feuille de cellules dans 200 μL de DMEM pendant 24 h, et le surnageant a été recueilli après centrifugation. ( a ) Les fibroblastes ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits à une concentration de 8000 cellules par puits dans 100 μL de DMEM avec 10% de FBS, suivis de l'ajout de 100 μL d'échantillons d'éluat ou de DMEM comme contrôle. De plus, 100 μL de l'échantillon d'éluat ont été ajoutés à 100 μL de DMEM avec 10 % de FBS par puits en tant qu'échantillon d'éluat sans fibroblastes. Après 48 h d'incubation dans des conditions normoxiques, le surnageant de culture a été collecté et le test de prolifération cellulaire par le réactif WST-8 a été effectué. Le taux de prolifération cellulaire a été calculé en utilisant des fibroblastes cultivés dans du DMEM comme contrôle. (b,c) Concentrations de VEGF et HGF dans le surnageant de culture de fibroblastes stimulés par l'éluat. ( d, e ) Rapports de production de VEGF et HGF à partir de fibroblastes lors de la stimulation de l'éluat. Les ratios ont été calculés à l'aide de la formule suivante : [(surnageant de fibroblastes cultivés avec l'échantillon d'éluat) - (surnageant de l'échantillon d'éluat sans fibroblastes)]/(surnageant de fibroblastes cultivés avec du DMEM). Des fibroblastes cultivés dans du DMEM ont été utilisés comme contrôle. ( f ) Les échantillons d'éluat ont été incubés pendant 60 min à 37 ° C avec un anti-FGF-2 ou un anticorps témoin. Les fibroblastes ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits à une concentration de 8 000 cellules par puits dans 100 μL de DMEM avec 1 % de FBS, suivi de l'ajout de 100 μL soit de l'échantillon d'éluat avec les anticorps, soit de DMEM contenant du rFGF-2 (0 ou 5 ng/mL) avec des anticorps. Après une incubation de 48 h dans des conditions normoxiques, le surnageant de culture a été aspiré et le test de prolifération cellulaire par le réactif WST-8 a été effectué. Le taux de prolifération cellulaire a été calculé en utilisant des fibroblastes cultivés dans 0 ng/mL de rFGF-2 avec l'anticorps témoin comme témoin. Les données de tous les panels sont exprimées en moyenne ± ET (*P < 0,05, **P < 0,01, test de Tukey-Kramer, n = 9 par groupe). Living : éluat de feuilles vivantes, Dry : éluat de feuilles sèches, FT : éluat de feuilles congelées-décongelées, rFGF-2 : protéine FGF-2 recombinante.

Le FGF-2 est un puissant facteur de croissance. L'éluat de la feuille sèche contenait une grande quantité de FGF-2, ce qui suggère que le FGF-2 peut affecter l'activité biologique. Par conséquent, nous avons examiné si le FGF-2 dans l'éluat affectait directement la prolifération des fibroblastes en utilisant un anticorps neutralisant contre le FGF-2 ou la protéine FGF-2 recombinante (rFGF-2). En présence d'un anticorps contrôle (Mouse IgG1 isotype control), la réponse proliférative des fibroblastes a été favorisée par l'éluat en feuille sèche ou rFGF-2. Cependant, ces réponses prolifératives ont été significativement inhibées par la neutralisation du FGF-2 (Fig. 4f). Ces résultats indiquent que l'activité biologique des feuilles sèches était principalement due à l'effet du FGF-2.

Des feuilles de cellules autologues (souris C57BL/6N) et allogéniques (souris C3H/He) ont été transplantées dans des lésions cutanées dorsales de 6 mm d'épaisseur chez des souris diabétiques (mâles, C57BL/6N), et chaque plaie a été évaluée aux jours 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 et 13 (n = 6 ; Fig. 5a,b). Le taux de fermeture des plaies était significativement plus élevé dans les groupes de traitement par feuille sèche autologue et allogénique que dans le groupe témoin sans traitement au jour 5 (groupe feuille sèche autologue et feuille sèche allogénique vs groupe témoin sans traitement : 74,2 ± 5,0 % [ P < 0,05] et 80,0 ± 4,9 % [P < 0,01] vs 51,0 ± 7,2 %), au jour 7 (feuille sèche autologue et feuille sèche allogénique vs absence de traitement : 95,8 ± 2,1 % [P < 0,01] et 90,0 % ± 4,0 % [P < 0,05] vs 72,4 ± 5,7 %) et au jour 9 (feuille sèche autologue vs absence de traitement : 99,4 ± 0,5 % [P < 0,01] vs 91,0 ± 2,4 % ; Fig. 5c ,d).

Effet thérapeutique des feuilles de cellules de fibroblastes multicouches conservées à sec. ( a ) Images macroscopiques représentatives de la plaie aux jours 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 et 13 dans la thérapie de transplantation de feuilles de cellules autologues. Des feuilles vivantes, des feuilles sèches et un groupe de feuilles FT, qui ont été préparés par des fibroblastes autologues (souris C57BL/6N), ont été transférés sur des défauts cutanés dans des modèles de fermeture de plaie cutanée dorsale de 6 mm d'épaisseur complète de souris mâles diabétiques C57BL/6N. Le contrôle indique aucun traitement. (b) Images macroscopiques représentatives de la plaie aux jours 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 et 13. dans la thérapie de transplantation de feuilles de cellules allogéniques. Des feuilles vivantes, des feuilles sèches et un groupe de feuilles FT, qui ont été préparés par des fibroblastes allogéniques (souris C3H / He) ont été transférés sur des défauts cutanés dans des modèles de fermeture de plaie cutanée dorsale pleine épaisseur de 6 mm de souris mâles diabétiques C57BL / 6N. Le contrôle indique aucun traitement. ( c ) Le taux de fermeture de la plaie de la thérapie de greffe de feuilles de cellules autologues par des feuilles vivantes (n = 6), des feuilles sèches (n = 6), des feuilles FT (n = 6) et un groupe témoin (sans traitement) (n = 6 ). Le taux de fermeture de la plaie a été calculé comme le pourcentage de la surface initiale de la plaie aux moments indiqués. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SE (*P < 0,05, **P < 0,01, test de Tukey-Kramer). ( d ) Le taux de fermeture de la plaie de la thérapie allogénique de greffe de feuilles de cellules par des feuilles vivantes (n = 6), des feuilles sèches (n = 6), des feuilles FT (n = 6) et un groupe témoin (sans traitement) (n = 6 ). Le taux de fermeture de la plaie a été calculé comme le pourcentage de la surface initiale de la plaie aux moments indiqués. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SE (*P < 0,05, **P < 0,01, test de Tukey-Kramer).

L'observation d'échantillons de tissus obtenus 30 jours après la transplantation de chaque feuille de cellules n'a montré aucune anomalie dans le tissu après la cicatrisation de la plaie dans tous les groupes de transplantation de feuilles de cellules, utilisant à la fois des cellules autologues et allogéniques, par rapport au groupe sans traitement (Fig. S4 supplémentaire) .

Nous avons étudié la position des feuilles sèches allogéniques pendant la cicatrisation. Les feuilles sèches ont été discriminées par rapport aux zones bleues au site d'application (Fig. 6b, d) car les fibres de collagène des feuilles étaient colorées en bleu par la coloration Azan (Fig. 1d). Un jour après la transplantation, un drap sec recouvrait toute la plaie (Fig. 6a,c). Les feuilles sèches étaient infiltrées de leucocytes, qui semblaient être des neutrophiles ou des macrophages. Il y avait une nette différence dans la couleur du noyau entre les leucocytes infiltrés et la feuille. Les noyaux des leucocytes infiltrés étaient clairement visibles en utilisant la coloration HE, tandis que les noyaux des cellules sèches dérivées de feuilles se coloraient faiblement et indistinctement avec le temps après la transplantation (Fig. S5 supplémentaire). À 3, 5 et 7 jours après la transplantation de feuilles sèches, la coloration Azan a montré des structures en forme de feuille "pliées" et un affaissement par rapport à 1 jour après la transplantation. La feuille sèche était présente directement sous la croûte ou l'épiderme formé, et elle n'a pas pu être confirmée à partir de la coupe transversale au jour 9. En revanche, aucune structure en forme de feuille n'a été observée dans le groupe témoin sans traitement (Fig. 6e,f ).

Analyse histologique de l'évolution du traitement après transplantation de feuilles sèches. ( a ) Coupe transversale colorée à l'HE d'une plaie cutanée de souris transplantée avec la feuille sèche les jours 1, 3, 5, 7 et 9 (barre d'échelle = 500 µm). Les flèches noires montrent le bord du néo-épithélium. ( b ) Coupe transversale colorée à l'Azan d'une plaie cutanée de souris transplantée avec la feuille sèche aux jours 1, 3, 5, 7 et 9 (barre d'échelle = 500 µm). Les flèches noires montrent le bord du néo-épithélium. (c) L'image enfermée dans le carré en (a) aux jours 1, 3, 5, 7 et 9 (barre d'échelle = 50 µm). Les flèches blanches indiquent la feuille sèche. ( d ) L'image enfermée dans le carré en ( b ) aux jours 1, 3, 5, 7 et 9 (barre d'échelle = 50 µm). Les flèches blanches indiquent la feuille sèche. HE : hématoxyline-éosine. ( e ) Coupe transversale colorée à l'HE de plaie cutanée sur des souris du groupe sans traitement les jours 1, 3, 5, 7 et 9 (barre d'échelle = 500 µm). Les flèches noires montrent le bord du néo-épithélium. ( f ) Coupe transversale colorée à l'Azan de la peau de la plaie chez les souris du groupe sans traitement les jours 1, 3, 5, 7 et 9 (barre d'échelle = 500 µm). Les flèches noires montrent le bord du néo-épithélium.

Fait intéressant, les observations histologiques ont indiqué que le traitement des feuilles sèches favorisait la cicatrisation des plaies. Au jour 3 après la transplantation, le groupe de traitement par feuille sèche allogénique a montré une augmentation significative du nombre de couches de kératinocytes et de microvaisseaux au bord de la plaie par rapport à celui du groupe sans traitement (Fig. S6a – d supplémentaire). Conformément aux observations macroscopiques de la cicatrisation des plaies (Fig. 5b, d), la longueur du néo-épithélium aux jours 5 et 7 après la transplantation a montré un allongement significatif dans le groupe de traitement par feuille sèche allogénique par rapport à celui du groupe témoin sans traitement. (Fig. S6e–h supplémentaire).

Pour étudier la stabilité au stockage des facteurs de croissance contenus dans les feuilles sèches, nous avons examiné les températures et les durées de stockage en utilisant des feuilles sèches préparées simultanément. Les feuilles sèches ont été stockées à température de réfrigération (4 °C) et à température ambiante (23 °C) pendant 1 jour et 1, 2 ou 4 semaines. Ensuite, les éluats ont été préparés en immergeant chaque feuille sèche dans le milieu pendant 24 h et conservés à - 30 °C jusqu'à la mesure. Les concentrations de VEGF et de HGF n'ont pas montré de fluctuations majeures avec la température ou la période de stockage, mais les concentrations de FGF-2 et de HMGB1 ont progressivement diminué à température ambiante pendant la période de stockage de 4 semaines (Fig. 7). Ces résultats démontrent que le stockage réfrigéré est adapté aux tôles sèches et qu'elles restent stables pendant au moins 4 semaines.

Étude de la stabilité au stockage des feuilles sèches. Les feuilles sèches préparées simultanément ont été stockées à température de réfrigération (4 ° C) et à température ambiante (23 ° C) pendant 1 jour, 1, 2 ou 4 semaines, puis les éluats ont été préparés en immergeant chaque feuille sèche dans 200 µL CTS AIM-V avec 10 % de FBS pendant 24 h dans des conditions normoxiques (37 °C, 5 % de CO2, 20 % d'O2) et stocké à − 30 °C jusqu'à la mesure. Les concentrations de VEGF, HGF, FGF-2 et HMGB1 dans le surnageant des échantillons d'éluat ont été mesurées par ELISA. 1D : Durée de stockage de 1 jour. 1 W : période de stockage de 1 semaine. 2 W : période de stockage de 2 semaines. 4 W : période de stockage de 4 semaines. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (*P < 0,05 versus 1D 4 ℃, **P < 0,01 versus 1D 4 ℃, †P < 0,05 versus 1D 23 ℃, ††P < 0,01 versus 1D 23 ℃, test de Dunnett, n = 4 par groupe).

Dans la thérapie de greffe de feuille de cellules, il est théorisé que les effecteurs les plus importants sont les cellules vivantes et que des effets thérapeutiques peuvent être obtenus en raison des facteurs qu'ils produisent. Conformément à cette théorie, des études antérieures ont montré que les feuillets cellulaires produisent divers facteurs de croissance et cytokines, notamment le VEGF, le HGF, le facteur de croissance transformant bêta1 et la protéine chimiotactique des monocytes 1, qui favorisent la cicatrisation des plaies7,9. Par conséquent, il est généralement admis que les feuilles sèches non viables ne sécrètent pas en continu des facteurs de croissance et ne peuvent favoriser la cicatrisation des plaies que dans une mesure limitée. Étonnamment, nos données ont démontré que les draps secs utilisant des cellules autologues ou allogéniques n'étaient pas significativement moins efficaces que les draps vivants et exerçaient une promotion significative de la cicatrisation des plaies par rapport au groupe témoin sans traitement (Fig. 5). Cela a probablement été induit par les substances bioactives libérées par les feuilles sèches, étant donné les différences entre les feuilles sèches et FT.

Nous avons constaté que des quantités similaires de facteurs de croissance et de cytokines, notamment VEGF, HGF, FGF-2 et HMGB1, étaient conservées dans les cellules des feuilles sèches comme dans celles des feuilles vivantes, et que ces substances étaient facilement libérées des cellules dans la solution ( Figures 3a,b). Notamment, le FGF-2 dans le cytoplasme et le HMGB1 dans le noyau n'ont pas été sécrétés par les feuilles vivantes mais ont été libérés par les feuilles sèches (Fig. 3b). Nous avons confirmé que l'éluat de feuille sèche présentait une bioactivité plus forte que l'éluat de feuille vivant par examen in vitro d'un test de prolifération des fibroblastes (Fig. 4a). De plus, l'éluat a stimulé les fibroblastes et amélioré la production de VEGF et de HGF (Fig. 4b – d), suggérant que les substances libérées par les feuilles sèches favorisent, directement et indirectement, la cicatrisation des plaies et l'angiogenèse.

Des niveaux élevés de FGF-2 ont été libérés des feuilles sèches dans le milieu et ont été impliqués dans l'activité biologique. Le FGF-2 est un facteur de croissance puissant et important pour favoriser la cicatrisation des plaies et l'angiogenèse16. Bien que le FGF-2 soit fortement exprimé dans les fibroblastes, sa sécrétion extracellulaire est généralement inefficace en raison du manque de peptides signaux sécrétoires. Par conséquent, la principale libération de FGF-2 provient de cellules endommagées ou mortes17,18,19,20. Une étude antérieure sur la thérapie de transplantation de cellules stromales mésenchymateuses (MSC) a montré que des niveaux élevés de FGF-2 libérés par des MSC transplantés blessés stimulaient l'angiogenèse et la neuropoïèse20. Par la suite, il n'y a eu aucun rapport sur le FGF-2 en tant qu'effecteur sécrété à partir de feuilles de cellules. Dans cette étude, nous avons démontré que l'éluat de feuille sèche favorisait l'activité proliférative des fibroblastes, qui était nettement supprimée par l'anticorps neutralisant FGF-2 (Fig. 4f). Ces résultats suggèrent que la libération de FGF-2 à partir de feuilles sèches joue un rôle important dans la promotion de la cicatrisation des plaies et de l'angiogenèse.

L'expérience in vivo utilisant un modèle de plaie cutanée de souris diabétique a montré qu'il n'y avait pas de différence dans la fermeture de la plaie entre le groupe de draps secs et le groupe témoin au jour 13. Cependant, il y avait une différence significative dans le taux de fermeture de la plaie par observation macroscopique à 5 , 7 et 9 jours après le traitement (Fig. 5). Aux jours 5 et 7 après le traitement, histologiquement, l'épithélialisation a augmenté de manière significative dans le groupe de feuilles sèches (Fig. Supplémentaire S6e – h), et il y avait une différence significative dans le nombre de microvaisseaux et de croissance des kératinocytes au bord de la plaie au jour 3 après le traitement. (Fig. S6a–d supplémentaire). Ces résultats indiquent que des facteurs de croissance ont été libérés des feuilles sèches au cours de la phase précoce après la transplantation et qu'ils ont stimulé à la fois les fibroblastes et les cellules péri-lésionnelles, y compris les kératinocytes et les cellules endothéliales vasculaires, à la fois directement et indirectement, ce qui peut avoir favorisé la cicatrisation. Nous avons observé que la structure en forme de feuille contenant l'ECM semblait protéger la plaie des facteurs externes (Fig. 6), mais nous n'avons pas pu confirmer la prolifération cellulaire à l'intérieur de la structure en feuille. Les caractéristiques et les mécanismes d'action possibles des feuillets cellulaires utilisés dans cette étude sont résumés dans la Fig. 8.

Schéma du mécanisme d'effet cicatrisant de chaque feuille de cellules. Les draps vivants étaient considérés comme ayant le plus grand effet thérapeutique par greffe après application sur la plaie. Pendant que les feuilles vivantes étaient vivantes, l'effet paracrine de la sécrétion continue de grandes quantités de facteurs de croissance favorisait la cicatrisation des plaies. Lorsque des feuilles sèches sont transplantées dans des plaies, elles libèrent de manière transitoire divers facteurs de croissance, censés stimuler l'angiogenèse et l'activation des cellules autour de la plaie. De plus, toutes les feuilles de cellules ont conservé l'ECM, ce qui peut avoir favorisé la cicatrisation en protégeant la plaie. Du fait de ces différences de mécanisme d'action, le classement de l'accélération de la cicatrisation était le suivant : draps vivants > draps secs > draps FT. ECM : matrice extracellulaire.

Lorsque l'éluat de feuille sèche a été traité avec une quantité en excès de l'anticorps neutralisant FGF-2, la prolifération cellulaire a été inhibée au même niveau que celui du témoin. Cependant, la réponse proliférative cellulaire à l'éluat de feuille sèche était significativement plus élevée que celle au rFGF-2 seul (Fig. 4f). Ce résultat indique que des substances autres que le FGF-2 peuvent également affecter la prolifération cellulaire. Bien que d'autres études soient nécessaires, des substances nucléaires, telles que HMGB1, qui sont collectivement connues sous le nom d'alarmines et agissent comme des facteurs de défense21,22 et sont impliquées dans la promotion de la cicatrisation des plaies23,24,25,26, sont également libérées des feuilles sèches, ce qui suggère que plusieurs facteurs peuvent agir de concert pour favoriser la cicatrisation des plaies.

Dans notre étude précédente, des feuilles vivantes transplantées dans des modèles d'ulcères cutanés de souris, à la fois autologues et allogéniques, ont disparu au jour 9 de l'imagerie in vivo de fibroblastes exprimant la luciférase9. De même, les observations histologiques du processus de cicatrisation ont indiqué que les feuilles sèches allogéniques étaient situées sous la couche épidermique pendant l'épithélialisation, mais qu'aucune feuille sèche n'est restée dans les échantillons de tissu après la fin de l'épithélialisation au jour 9 (Fig. 6). Il a été suggéré que la feuille sèche se décomposait naturellement et était absorbée par les leucocytes infiltrants. Une étude précédente utilisant des feuilles de cellules épidermiques d'origine humaine dans un modèle d'ulcère de souris supposant une transplantation allogénique chez l'homme a confirmé que les feuilles étaient excrétées ex vivo pendant le processus de cicatrisation de la plaie27. Ces observations suggèrent que les feuilles sèches dérivées de fibroblastes peuvent être utilisées non seulement sur la surface du corps mais également sur les organes internes car elles sont décomposées et absorbées. Auparavant, nous avons également démontré l'efficacité d'une feuille de cellules de fibroblastes multicouches pour les fistules bronchiques et pancréatiques postopératoires dans des modèles animaux28,29. En outre, les feuilles sèches peuvent également être utilisées comme matériaux de revêtement biologique pour favoriser la réparation des tissus et prévenir diverses complications postopératoires.

Ici, nous confirmons que les substances bioactives retenues dans la feuille sèche réfrigérée étaient stables pendant au moins 1 mois et que certaines substances bioactives étaient retenues même lorsqu'elles étaient stockées à température ambiante (Fig. 7). Bien que des draps secs stockés à température ambiante pendant 7 jours ou moins aient été utilisés dans les expériences sur les souris de cette étude, le groupe de traitement avec des draps secs a montré des effets significatifs sur la cicatrisation des plaies par rapport au groupe sans traitement. Étant donné que l'étude de stabilité au stockage in vitro a révélé que la quantité de FGF-2 est affectée par la température de stockage, un meilleur effet thérapeutique peut être attendu en contrôlant strictement la température de stockage.

Les feuilles sèches conservent leur structure en forme de feuille tout en conservant un certain degré de rigidité, ce qui signifie qu'elles peuvent être utilisées sans le support requis pour la thérapie de transplantation de feuilles de cellules et ont l'avantage d'une manipulation plus facile (Fig. S1 supplémentaire). Plusieurs feuilles de membranes amniotiques déshydratées ont déjà été utilisées pour le traitement des ulcères cutanés30. Les feuilles sèches dérivées de fibroblastes présentent des avantages en termes de stabilité de la disponibilité des matériaux et de sécurité contre les infections causées par les donneurs. Nos plaques sèches peuvent être produites en série à partir d'un seul matériau, garantissant un approvisionnement stable et une qualité de produit uniforme.

Comme limitation, suite à nos études précédentes5,6,7, toutes les feuilles de cellules utilisées dans cette étude ont été produites à partir de feuilles de cellules de fibroblastes multicouches préconditionnées hypoxiques puisque le traitement du préconditionnement hypoxique est efficace pour augmenter la puissance sécrétoire du fibroblaste. Avant cette étude, nous avions émis l'hypothèse que les draps secs pouvaient avoir des effets cicatrisants grâce aux mêmes facteurs de croissance sécrétés par les draps vivants. Cependant, contrairement au mécanisme d'action des feuilles de cellules conventionnelles, il est devenu clair que la libération de FGF-2 à partir de feuilles sèches, qui n'est pas sécrétée par des feuilles vivantes, joue un rôle important dans la cicatrisation des plaies. Par conséquent, l'effet du préconditionnement hypoxique sur les facteurs de croissance retenus dans la feuille sèche doit être étudié à l'avenir.

En conclusion, il s'agit de la première étude à démontrer que la capacité de cicatrisation des draps secs allogéniques pour les ulcères cutanés est comparable aux draps secs autologues. Fait important, nous avons constaté que les feuilles sèches retenaient et libéraient des substances bioactives, y compris le FGF-2, des cellules pour favoriser la cicatrisation des plaies. Les feuilles sèches peuvent être facilement réfrigérées ou stockées à température ambiante et peuvent être fournies rapidement et de manière stable. Ainsi, les feuilles sèches allogéniques représentent un outil utile pour le traitement des ulcères cutanés.

Toutes les expériences de cette étude ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives ARRIVE et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Yamaguchi (numéro d'approbation 31-093).

Des souris mâles C57BL/6N et C3H/He (âgées de 6 semaines) ont été achetées auprès de Japan SLC (Shizuoka, Japon). Ils étaient logés dans une pièce à température (22 ± 2 °C), humidité (70 ± 20 %) et lumière contrôlée (cycles lumière/obscurité de 12 h) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau.

Des fibroblastes ont été isolés de la peau de la queue de souris à l'aide de collagénase (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japon) et cultivés dans du milieu CTS™ AIM-V™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) avec 10 % de sérum bovin fœtal ( FBS ; Thermo Fisher Scientific). Des cellules de fibroblastes primaires ont été ensemencées dans une plaque normale à 24 puits (4,2 × 105 cellules/puits) en utilisant un milieu de 2 ml composé de CTS™ AIM-V™ et HFDM-1 (+) (Cell Science & Technology Institute, Sendai, Japon) additionnés de 5 % de FBS et ont été incubés dans des conditions normoxiques (37 °C, 5 % CO2, 20 % O2) pendant 2 jours, puis dans des conditions hypoxiques (33 °C, 5 % CO2, 2 % O2) pendant 1 jour pour les traitement du préconditionnement hypoxique5,6,7. Après incubation, les feuilles de cellules de fibroblastes multicouches ont été rincées deux fois avec 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis incubées avec 500 µl de solution de dispase (10 PU/mL, FUJIFILM Wako) pendant 30 min dans des conditions normoxiques. Après deux lavages avec du PBS, des feuilles de cellules de fibroblastes multicouches ont été délicatement détachées des plaques de culture. Ces draps ont été utilisés comme draps vivants dans cette étude.

Le séchage à l'air a été effectué à l'intérieur d'un banc bio-propre (CCV-1300E, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japon), avec la flamme pilote du brûleur à gaz fonctionnant au centre, où des opérations propres pouvaient être maintenues. Les feuilles vivantes ont été transférées sur un socle en silicone à l'aide d'une pointe à large alésage de 1000 µL et dépliées pour éviter les plis. Après avoir éliminé le plus d'eau possible, les feuilles ont été laissées au repos pendant 30 minutes. Les feuilles de cellules séchées ont été décollées du silicium avec des pincettes et transférées dans des microtubes de 1,5 ml. Pour les expériences de transplantation, les feuilles sèches ont été stockées à température ambiante (23 ° C) et utilisées dans la semaine suivant la préparation. Pour les expériences de stabilité au stockage, des feuilles sèches ont été stockées avec un déshydratant à une température de réfrigération (4 ° C) ou à température ambiante (23 ° C).

Une plaque de culture à 24 puits contenant des feuilles vivantes a été transférée dans un sac en plastique scellable et placée dans un congélateur (-80 ° C) pendant 60 min, suivie d'une décongélation dans un incubateur (37 ° C) pendant 90 min. Les cycles de congélation et de décongélation ont été répétés trois fois pour détruire les membranes cellulaires, suivis d'un lavage deux fois avec 2 ml de PBS pour obtenir des feuilles FT. Les feuilles FT ont été conservées après le troisième cycle de congélation (− 80 °C) jusqu'à leur utilisation.

Huit feuilles vivantes ont été transférées sur une plaque en plastique à l'aide d'un embout à large diamètre de 1000 µL, et le changement de poids a été mesuré toutes les minutes à l'aide d'une balance XS104 (Mettler Toledo, Inc.) installée sur un banc bio-nettoyant. Trois expériences indépendantes ont été réalisées et la vitesse de séchage a été calculée. Les conditions environnementales dans le banc bio-propre ont été mesurées en utilisant HYGROPALM-HP32 (Rotronic, Bassersdorf, Suisse) et l'anémomètre portable INFURIDER (AP-816B, AOPUTTRIVER).

Le poids total des 50 feuilles sèches a été mesuré et les feuilles ont été immergées dans 2 ml de méthanol pendant deux heures. La quantité d'eau dans le méthanol a été mesurée en utilisant la méthode de Karl Fischer (Japan Testing Laboratories, Inc., Ohgaki, Japon). La méthode Karl Fischer a été réalisée deux fois.

Des feuilles de cellules non fixées ont été colorées avec du DAPI (Dojindo, Kumamoto, Japon). Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japon).

Les draps vivants individuels ont été séchés à l'air pendant 5, 10, 15, 30, 45 ou 60 min et immédiatement immergés dans 500 µL de PBS pendant 30 min à température ambiante. La LDH dans le surnageant de chaque feuille de cellules a été mesurée avec la feuille de cellules vivantes immergée dans 500 µL de tampon de lyse cellulaire comme contrôle positif et PBS comme contrôle négatif à l'aide d'un kit de détection de cytotoxicité LDH (Dojindo).

Les feuilles vivantes et les feuilles sèches obtenues après séchage pendant 30 min ont été transférées dans une autre plaque à 12 puits contenant 2 mL de CTS™ AIM-V™ avec 10 % de FBS et cultivées pendant 24 h dans des conditions normoxiques. Les feuillets cellulaires ont été observés à l'aide d'un microscope optique à différence de phase. L'activité métabolique cellulaire des feuilles de cellules re-cultivées a été analysée comme suit : après élimination des surnageants de culture, 1 mL de CTS™ AIM-V™ avec 10 % de FBS contenant 10 % de [2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)- 3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium, sel monosodique] (WST-8) réactif (Cell Count Reagent SF ; Nacalai Tesque, Inc. Kyoto, Japon) ont été ajoutés à chaque bien et incubé pendant 3 h dans des conditions normoxiques. L'absorbance du surnageant a été mesurée à 450 nm (longueur d'onde de référence : 630 nm).

Le protocole détaillé a été décrit précédemment7. En bref, des feuilles de cellules ont été transférées sur un CellShifter (CellSeed Inc., Tokyo, Japon) pour préparer des coupes de tissus. Des tissus cutanés isolés ou des feuillets cellulaires ont été fixés dans une solution tampon neutre de formol à 10 % et inclus dans de la paraffine. Des coupes de trois micromètres d'épaisseur ont été montées sur des lames et colorées à l'hématoxyline-éosine (HE) ou à l'Azan. L'immunomarquage a été réalisé à l'aide d'anticorps primaires de lapin anti-collagène I (1:200, ab34710, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-FGF-2 (1:30, ab208687, Abcam) et anti-HMGB-1 (1: 400, ab79823, Abcam), un anticorps de lapin anti-CD31 (1:200, ab28364, Abcam) et un anticorps secondaire pour l'IgG de chèvre anti-lapin conjugué DyLight550 (H&L) (1:200, ab96884; Abcam). Le DAPI a été utilisé pour colorer les noyaux cellulaires. Toutes les images histologiques ont été capturées par le microscope BZ-X710 et analysées à l'aide de l'analyseur BZ-X (Keyence). Toutes les analyses histologiques ont été réalisées par un pathologiste.

Les feuilles de cellules ont été immergées dans des microtubes de 1,5 ml avec leur couvercle scellé. Pour mesurer les niveaux de cytokines à l'intérieur des feuilles de cellules, chaque feuille de cellules a été immergée dans 200 μL de tampon de lyse cellulaire 2 (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA) pendant 30 min à température ambiante. Pour mesurer les niveaux de cytokines libérés des feuilles de cellules, chaque feuille de cellules a été immergée dans 200 µL de CTS™ AIM-V™ avec 10 % de FBS pendant 24 h dans des conditions normoxiques (37 °C). Après incubation, les échantillons ont été centrifugés à 2460 × g pendant 5 min à 4 ° C, et les surnageants ont été collectés et stockés à - 30 ° C jusqu'à la mesure. Les concentrations de VEGF, HGF, FGF-2 et HMGB1 dans le surnageant ont été mesurées à l'aide de Quantikine Immunoassay Kits (R&D Systems) et HMGB1 ELISA Kit Exp (SHINO-TEST CORPORATION, Kanagawa, Japon), respectivement, conformément aux instructions du fabricant.

Les échantillons d'éluat ont été préparés en immergeant chaque feuille de cellules dans 200 μL de DMEM (Thermo Fisher Scientific) sans FBS pendant 24 h dans des conditions normoxiques. Le surnageant a été récupéré après centrifugation (2460 xg, 4 °C, 5 min). Les fibroblastes ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits à 8000 cellules / puits dans 100 μL de DMEM avec 10% de FBS, suivis de l'ajout de 100 μL de l'échantillon d'éluat ou de DMEM sans FBS. Chaque échantillon d'éluat dilué 2 fois avec du DMEM contenant 10 % de FBS a été utilisé comme échantillon d'éluat sans fibroblastes. Après 48 h d'incubation dans des conditions normoxiques, le surnageant de culture a été collecté pour la mesure du VEGF et du HGF, suivie du test de prolifération cellulaire. Du DMEM (100 μL) avec 5% de FBS contenant 10% de réactif WST-8 (Cell Count Reagent SF) a été ajouté à chaque puits et incubé pendant 1 h dans des conditions normoxiques. L'absorbance du surnageant a été mesurée à 450 nm. Le taux de prolifération cellulaire a été calculé en utilisant les fibroblastes cultivés dans du DMEM comme témoin. Les concentrations de VEGF et HGF dans le surnageant de culture ont été mesurées par ELISA, et les ratios de production ont été calculés par la formule suivante : [(surnageant de fibroblastes cultivés avec l'échantillon d'éluat) − (surnageant de l'échantillon d'éluat sans fibroblastes)]/(surnageant de fibroblastes cultivés avec du DMEM). Trois expériences indépendantes ont été réalisées en triple.

Des échantillons d'éluat de feuille sèche ont été préparés par la même procédure que pour l'analyse de prolifération cellulaire décrite ci-dessus. Des DMEM contenant du rFGF-2 (0 ou 5 ng/mL, FUJIFILM Wako) ont également été préparés. Ces échantillons ont été incubés pendant 60 min à 37 °C avec l'anticorps neutralisant anti-FGF-2 (30,3 μg/mL, #05-117, clone bFM-1, Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne), ou l'anticorps contrôle (Mouse Contrôle isotype IgG1, clone11711 ; 30,3 μg/mL, MBA002, R&D Systems). Les fibroblastes ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits à raison de 8 000 cellules par puits dans 100 μL de DMEM avec 1 % de FBS, suivi de l'ajout de 100 μL soit de l'échantillon d'éluat avec les anticorps, soit de DMEM contenant du rFGF-2 (0 ou 5 ng/ mL) avec des anticorps. Après une incubation de 48 h dans des conditions normoxiques, le surnageant de culture a été aspiré et le test de prolifération cellulaire a été effectué. Du DMEM (100 μL) avec 0, 5% de FBS contenant 10% de réactif de comptage de cellules SF a été ajouté à chaque puits et incubé pendant 2 h dans des conditions normoxiques. L'absorbance du surnageant a été mesurée à 450 nm. Le taux de prolifération cellulaire a été calculé en utilisant des fibroblastes cultivés dans 0 ng/mL de rFGF-2 avec l'anticorps témoin comme témoin. Trois expériences indépendantes ont été réalisées en triple.

Des souris mâles C57BL/6N ont reçu par voie intrapéritonéale de la streptozotocine (STZ; FUJIFILM Wako) à raison de 55 mg/kg toutes les 24 h pendant cinq jours consécutifs. Les souris avec des valeurs de glycémie ≥ 300 mg/dL aux jours 9 et 10 après l'administration de STZ ont été classées comme souris diabétiques. Un ulcère cutané a été préparé chez les souris diabétiques le 14ème jour après la dernière administration de STZ. Des souris mâles C57BL/6N ont été anesthésiées avec 2 % d'isoflurane par inhalation, et un défaut cutané de 6 mm d'épaisseur totale a été créé sur la peau dorsale à l'aide d'un poinçon de biopsie (n = 6 par groupe). Des feuilles vivantes et des feuilles FT ont été transférées sur le défaut cutané à l'aide d'une pointe à large diamètre de 1000 µL, et des feuilles sèches ont été manipulées à l'aide d'une pince à épiler. Chaque feuillet cellulaire a été préparé à partir de souris mâles C57BL/6N (autologues) et de souris mâles C3H/He (allogéniques). Toutes les plaies ont été recouvertes d'ADAPTIC (#2012; Acelity, San Antonio, TX, USA) et de Derma-aid® (ALCARE, Tokyo, Japon) et fixées avec un bandage Silkytex (#11893; ALCARE) pendant les 24 premières heures. Le premier jour, toutes les plaies ont été recouvertes d'Airwall Fuwari (# MA-E050-FT; Kyowa, Osaka, Japon) et fixées à l'aide d'un bandage Silkytex9. Chaque plaie a été photographiée à l'aide d'un appareil photo numérique aux jours 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 et 13. Chaque photographie a été normalisée avec une mesure de diamètre de 10,5 mm et la zone de la plaie a été mesurée en traçant manuellement chaque plaie. bord à l'aide du logiciel ImageJ (NIH, Bethesda, MD, États-Unis). Le taux de fermeture de la plaie a été calculé comme suit : [jour X] (%) = {1 − (surface de la plaie [jour X]/surface de la plaie [jour 0])} × 100. Les draps secs ont été stockés à température ambiante (23 °C ) et utilisé pour cette expérience dans la semaine suivant la préparation.

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type, sauf indication contraire. Les différences statistiques ont été évaluées par une analyse de variance unidirectionnelle suivie soit du test de Tukey-Kramer pour les comparaisons multiples entre les groupes, soit du test de Dunnett pour les comparaisons de plusieurs groupes par rapport à un groupe témoin. Le test t de Student a été réalisé pour une comparaison statistique entre les deux groupes. Les données ont été analysées statistiquement dans Statcel (logiciel complémentaire pour Microsoft Excel, OMS Ltd., Japon). La signification statistique a été fixée à P < 0,05.

Les ensembles de données générés et analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions Yukari Hironaka et Kenzo Ikemoto pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (21K08845 à MY et 22K08960 à RS) et AMED sous Grant Number JP21lm0203008 (à KH).

Département de chirurgie et de sciences cliniques, École supérieure de médecine de l'Université de Yamaguchi, Ube, Japon

Yutaro Matsuno, Masashi Yanagihara, Koji Ueno, Toshiro Saito, Hiroshi Kurazumi, Ryo Suzuki, Shunsaku Katsura et Kimikazu Hamano

Département de pathologie moléculaire, École supérieure de médecine de l'Université de Yamaguchi, Ube, Japon

Atsunori Oga

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YM, MY, TS, KU, RS, SK et KH ont contribué à la conception et à la conception des expériences. YM, MY, HK et RS ont réalisé des expériences. YM, MY, KU, RS, AO et KH ont analysé les données. YM, MY, HK et RS ont respectivement fourni des réactifs, des matériaux et des outils d'analyse. YM, MY, RS, SK, AO et KH ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont discuté des résultats et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Masashi Yanagihara.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Matsuno, Y., Yanagihara, M., Ueno, K. et al. Les feuilles de cellules de fibroblastes multicouches conservées à sec sont un nouvel outil gérable pour la médecine régénérative pour favoriser la cicatrisation des plaies. Sci Rep 12, 12519 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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Reçu : 09 mars 2022

Accepté : 08 juillet 2022

Publié: 22 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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