YiaC et CobB régulent la lactylation de la lysine chez Escherichia coli

Jun 18, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6628 (2022) Citer cet article

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Il a été récemment rapporté que la lactylation de la lysine (Kla) participe à la régulation de la transcription dans les cellules humaines. Cependant, la caractérisation, le mécanisme de régulation et la conséquence fonctionnelle de Kla chez les procaryotes restent flous. Nous rapportons ici que YiaC fonctionne comme une lysine lactylase et que CobB sert de lysine delactylase dans la régulation du métabolisme. Nous démontrons que YiaC catalyse l'ajout de Kla, tandis que CobB efface ce PTM à la fois in vitro et intracellulairement. De plus, nous montrons que YdiF peut catalyser la formation d'un lactyl-coenzyme A, qui donne le groupe lactyle pour Kla. L'analyse protéomique quantitative révèle en outre 446 sites Kla endogènes ciblés par CobB et 79 candidats ciblés par YiaC chez Escherichia coli (E. coli). De plus, nous présentons que Kla peut influencer les fonctions des enzymes métaboliques. Fait intéressant, nous démontrons que CobB peut moduler spécifiquement l'activité de PykF en régulant K382la, favorisant la glycolyse et la croissance bactérienne. Notre étude identifie les enzymes régulatrices et le réseau fonctionnel de Kla et révèle un mécanisme moléculaire médié par Kla catalysé par CobB pour la régulation de la glycolyse chez E. coli.

La modification post-traductionnelle (PTM) est un élément clé dans la régulation des fonctions des protéines et joue un rôle vital dans la modulation de diverses fonctions cellulaires et de la progression de la maladie chez les eucaryotes1,2. De plus, de plus en plus de preuves indiquent que les PTM remplissent également une fonction importante chez les procaryotes. Par exemple, l'acétylation de la lysine (Kac) régule la virulence bactérienne3, la chimiotaxie4 et la stabilité des protéines5,6. Nous avons récemment découvert que la lysine 2-hydroxyisobutyrylation (Khib) était impliquée dans la régulation du métabolisme bactérien, de la transcription et de la résistance aux antibiotiques7,8,9,10. Cependant, la compréhension de la fonction et du mécanisme de régulation des PTM chez les procaryotes reste limitée.

La lactylation de la lysine (Kla) a récemment été signalée comme un type de PTM nouvellement identifié sur les histones humaines pour réguler la polarisation et les états des macrophages11,12,13,14. D'autres études ont montré que Kla sur les histones peut influencer la reprogrammation métabolique cellulaire lors de la différenciation des cellules souches pluripotentes et dans le cancer du poumon non à petites cellules15,16, peut entraîner l'oncogenèse et est associée à l'excitation neurale17,18 via la régulation de la transcription génique. De plus, il a été démontré que Kla sur la protéine non histone HMGB1 favorise la libération exosomale dans la septicémie polymicrobienne19. Aux données, Kla a été signalé chez les eucaryotes, y compris les humains, les souris, le riz et Botrytis cinerea11,18,20,21. Cependant, on ne sait toujours pas si Kla existe chez les procaryotes et quels rôles ces modifications non découvertes de Kla pourraient jouer.

On pense que les changements dynamiques des PTM avec le temps et l'espace sont des événements biologiques importants, modulant la fonction des protéines dans divers processus cellulaires. Les PTM réversibles sont généralement régulés par deux types d'enzymes qui ajoutent ou suppriment spécifiquement des PTM. Par exemple, il a été largement rapporté que les lysine acétyltransférases (KAT) et les lysine désacétylases (KDAC) catalysent diverses acylations ou désacylations1,22,23,24. Pour Kla, P300 fonctionne comme la lactylase potentielle et les histones désacétylases de classe I (HDAC1‒3) servent de delactylases11,25. Cependant, les enzymes régulatrices de Kla chez les procaryotes sont encore inconnues.

Ici, nous avons profilé le protéome Kla dans Escherichia coli (E. coli) MG1655, identifié l'écrivain et la gomme pour Kla et illustré l'effet médié par Kla sur la glycolyse et la croissance bactériennes. Nous avons identifié YiaC comme une lactylase et CobB comme une delactylase en criblant des souches avec des protéines de la famille des N-acétyltransférases (GNAT) liées à GCN5 surexprimées et CobB. De plus, nous avons révélé que YiaC et CobB peuvent catalyser l'ajout et l'élimination de la lactylation de la lysine, respectivement, à la fois in vitro et intracellulairement. Ensuite, en réalisant une approche de protéomique quantitative basée sur le marquage des isotopes stables par les acides aminés en culture cellulaire (SILAC), nous avons identifié 79 sites Kla endogènes potentiellement régulés par YiaC et 446 candidats Kla ciblés par CobB. Nous avons identifié un total de 1047 sites Kla sur 478 protéines dans E. coli MG1655 et avons montré que les protéines lactylées étaient principalement liées au métabolisme. Nous avons en outre démontré que CobB peut effacer PykF K382la pour améliorer la glycolyse et favoriser la croissance d'E. coli. En résumé, cette étude identifie le système enzymatique régulateur de Kla chez les bactéries, profile les protéines substrats endogènes de Kla et illustre le mécanisme moléculaire de la régulation de la glycolyse médiée par Kla.

Kla a été identifié à l'origine comme un marqueur d'histone dans les cellules eucaryotes11,12,13,14. Cependant, on ne savait toujours pas si le nouveau PTM existait chez les procaryotes. Pour atteindre cet objectif, nous avons effectué un test Western blot avec un anticorps pan-Kla pour les lysats de cellules entières de E. coli. Comme le montre la Fig. 1a supplémentaire, un certain nombre de protéines lactylées à la lysine ont été détectées, confirmant l'existence de Kla chez les procaryotes.

Les PTM réversibles qui sont régulés par des écrivains et des effaceurs modulent les fonctions des protéines dans divers processus cellulaires. Par conséquent, il est impératif d'identifier les enzymes régulatrices de Kla pour comprendre sa fonction et son mécanisme de régulation chez les procaryotes. Des études antérieures ont montré que les acétyltransférases (KAT) et les désacétylases peuvent réguler diverses acylations de la lysine, telles que l'acétylation, la succinylation et la crotonylation24,26,27,28,29,30. Par conséquent, nous avons rationnellement émis l'hypothèse que certaines KAT et désacétylases pourraient catalyser l'ajout et l'élimination de Kla.

Les GNAT sont la seule famille de protéines qui agissent comme des lysine acétylases chez E. coli31,32. Nos travaux récents ont montré que TmcA sert de lysine 2-hydroxyisobutyryltransférase en criblant les souches d'E. coli BL21 (λDE3) surexprimant GNAT9. Ici, nous avons utilisé 18 souches d'E. coli BL21 (λDE3) surexprimant GNAT (pGNAT) pour cribler des candidats lactylase par immunotransfert de lysats de cellules entières avec un anticorps pan-Kla. Par rapport à E. coli hébergeant le vecteur pET28a vide, nous avons constaté que seule la surexpression de YiaC provoquait une augmentation importante et évidente des niveaux de Kla (Fig. 1a, Supplémentaire Fig. 1b, c), identifiant YiaC comme candidat lysine lactylase. Pour confirmer son activité catalytique envers Kla, nous avons en outre détecté des niveaux de Kla dans E. coli MG1655 yiaC+ et ΔyiaC. Les résultats d'immunoblot ont montré que le niveau de Kla dans la souche ΔyiaC était significativement diminué (Fig. 1b). Ensemble, nos résultats suggèrent que YiaC est une lactylase candidate qui catalyse la génération de Kla.

a La surexpression de YiaC a augmenté les niveaux de Kla dans E. coli. E. coli BL21 (λDE3) a été transféré avec le vecteur vide (pET28a) comme contrôle et avec les gènes vecteurs GNAT-pET28a comme souches surexprimant GNAT (pGNAT), le niveau de Kla des lysats de cellules entières a été analysé par immunotransfert. b Une carence en YiaC a diminué Kla dans E. coli. Le niveau de Kla de E. coli MG1655 ΔyiaC a été analysé par immunotransfert, avec yiaC+ comme contrôle. c La surexpression de CobB a diminué les niveaux de Kla dans E. coli. L'immunotransfert a analysé les niveaux de Kla de E. coli BL21 (λDE3) transféré pET28a comme contrôle et cobB-pET28a comme souche pCobB. d Une carence en CobB a augmenté Kla dans E. coli. Le niveau de Kla de E. coli MG1655 ΔcobB a été analysé par immunotransfert, avec cobB+ comme contrôle. Tous les immunoblots avaient trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. Et toutes les souches ont été cultivées dans du milieu LB à 37°C.

Pour explorer la délactylase pour E. coli, nous avons analysé les niveaux de Kla de la souche CobB surexprimant E. coli BL21 (λDE3) (pCobB), où CobB est la principale déacylase connue dans E. coli pour l'élimination de l'acétylation, de la succinylation et 2-hydroxyisobutyrylation8,33,34,35. Par rapport à E. coli hébergeant le vecteur pET28a vide, la souche pCobB a provoqué une diminution significative des niveaux de Kla (Fig. 1c). Par la suite, nous avons constaté que les niveaux de Kla étaient légèrement augmentés dans E. coli MG1655 ΔcobB par rapport à cobB + (Fig. 1d). Ces résultats indiquent que CobB fonctionne comme une delactylase endogène.

Il est connu que l'acétyl-CoA ou l'acétyl-phosphate peut agir comme donneur de groupe acétyle pour l'acétylation chez les procaryotes36. Cependant, il n'y a aucune preuve de la présence de lactyl-phosphate dans E. coli. Pour le lactyl-CoA, une étude antérieure a suggéré que l'extrait frais de protéines d'E. coli peut catalyser le lactate en lactyl-CoA37,38. Pour le confirmer, nous avons détecté du lactyl-CoA dans des lysats de cellules entières comme contrôle. Comme prévu, nous avons détecté un faible niveau de lactyl-CoA (Fig. 2e supplémentaire), montrant que le lactyl-CoA est présent dans E. coli. Ensuite, nous avons incubé du lactate avec des lysats frais de cellules entières et avons découvert que le lactate pouvait être efficacement converti en lactyl-CoA (Fig. 2e supplémentaire).

Pour mieux comprendre la formation de lactyl-CoA, nous avons exploré la synthétase ou transférase potentielle de la lactyl-CoA. Tout d'abord, nous avons sélectionné l'acétyl-CoA synthétase (Acs) et la propionate CoA synthétase (PrpE) comme candidats pour la lactyl-CoA synthétase chez E. coli. Pour examiner si Acs ou PrpE peuvent catalyser le lactate en lactyl-CoA, nous avons incubé Acs purifié avec de l'acétate ou du lactate et PrpE avec du propionate ou du lactate, respectivement. Cependant, nous avons observé que ni Acs ni PrpE ne pouvaient catalyser la formation de lactyl-CoA à partir de lactate (Fig. 2c, d, f, g supplémentaires). Il a été récemment rapporté que cinq transférases CoA de différentes espèces, y compris Megasphaera elsdenii, Clostridium propionicum, Megasphaera sp. DISK 18, Clostridium lactatifermentans An75 et la bactérie Firmicutes CAG:466 peuvent convertir le lactate en lactyl-CoA39,40. Après une recherche BLAST, nous avons découvert que l'acétate CoA-transférase (Ydif) chez E. coli a une conservation de séquence élevée avec les cinq transférases, en particulier dans les motifs EXGXXG et GXGGF (Fig. 2a, b supplémentaires). Ainsi, nous avons incubé YdiF purifié avec de l'acétate ou du lactate. Fait intéressant, nous avons découvert que YdiF pouvait catalyser la conversion de l'acétyl-CoA ou du lactyl-CoA à partir d'acétate ou de lactate in vitro (Fig. 2a, b), ce qui suggère que Ydif a une activité lactyl-CoA-transférase. Pour confirmer son activité catalytique intracellulaire, nous avons en outre analysé les niveaux de Kac et Kla dans la souche E. coli BL21 (λDE3) surexprimant YdiF (pYdiF). Par rapport à E. coli hébergeant le vecteur pET28a vide, nous avons constaté que la souche pYdiF provoquait une augmentation significative des niveaux de Kac et Kla (Fig. 2c). Ensemble, nos résultats démontrent que le lactyl-CoA existe dans E. coli et que YdiF peut servir de lactyl-CoA-transférase pour la conversion du lactyl-CoA à partir du lactate.

a est réalisé produire de l'acétyl-CoA (Ac-CoA) par YdiF. − YdiF : acétate d'incubation avec acétoacétyl-CoA (Acac-CoA), + YdiF : acétate d'incubation avec acétoacétyl-CoA (Acac-CoA) avec YdiF. n = 3 répétitions biologiques. b est réalisé produire du lactyl-CoA (la-CoA) par YdiF. − YdiF : incubation lactate avec acétoacétyl-CoA (Acac-CoA), + YdiF : incubation lactate avec acétoacétyl-CoA (Acac-CoA) avec YdiF. n = 3 répétitions biologiques. c La surexpression de YdiF a augmenté la formation d'acétyl-CoA et de lactyl-CoA. L'immunotransfert a analysé Kac et Kla de E. coli BL21 (λDE3) transféré pET28a comme contrôle et ydiF-pET28a comme souche pYdiF. d Analyse ITC de l'affinité du YiaC recombinant avec le lactyl-CoA, l'acétyl-CoA et le succinyl-CoA, trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. e YiaC a catalysé l'acétylation mais pas la succinylation. L'immunotransfert a analysé Kac et Ksucc de E. coli BL21 (λDE3) a transféré pET28a comme contrôle et yiaC-pET28a comme souche pYiaC. f Analyse ITC de l'affinité du CobB recombinant avec le peptide Kla (AETAEK(la)YGDEQVK) et le peptide Kac (AETAEK(la)YGDEQVK), trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. g CobB a catalysé la délactylation du peptide in vitro. Des peptides synthétiques (AETAEK (la) YGDEQVK, AETAEK (ac) YGDEQVK) ont été utilisés comme substrats pour la réaction CobB avec détection LC-MS des activités de délactylation et de désacétylation de la lysine de CobB, trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. h Lactylation catalysée par YiaC du peptide in vitro. Le peptide synthétique (TICHDKAFVR) a été utilisé comme substrat pour la réaction YiaC avec détection LC-MS des activités de lactylation et d'acétylation de la lysine de YiaC, trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. i Paramètres cinétiques (kcat, Km et kcat/Km) de YiaC pour la lactylation et CobB pour la délactylation, n = 3 répétitions biologiques. Les données sont des moyennes ± SEM de trois tests indépendants, test t de Student bilatéral. Les valeurs P sont indiquées sur la figure. Tous les immunoblots avaient trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. Toutes les souches ont été cultivées dans du milieu LB à 37°C. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Des études antérieures ont montré que les lysine acylases se lient généralement à l'acyl-CoA pertinent pour démarrer la fonction catalytique, tandis que les désacylases doivent reconnaître la lysine modifiée correspondante pour catalyser l'élimination du PTM8. Ainsi, nous avons effectué un test de calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour détecter la liaison de YiaC avec le lactyl-CoA et CobB avec le peptide lactylé. Étant donné que YiaC est une lysine acétylase connue et que CobB est une désacétylase32,33, nous avons utilisé séparément l'acétyl-CoA et le peptide acétylé comme témoins. Comme prévu, il y avait une forte liaison entre YiaC et le lactyl-CoA (KD = 6,83 μM), qui était similaire à l'acétyl-CoA (KD = 5,57 μM) ; au lieu de cela, il n'y avait pas de liaison entre YiaC et succinyl-CoA (Fig. 2d, Données supplémentaires 1). Ensuite, nous avons constaté que la surexpression de YiaC pouvait réguler positivement Kac, comme indiqué32, mais ne provoquait pas de modification de la succinylation par rapport à E. coli transformé avec le vecteur pET28a (Fig. 2e), ce qui était cohérent avec les résultats de l'ITC. Ces résultats fournissent une preuve supplémentaire que YiaC peut catalyser l'ajout de Kla. Nous avons également détecté la liaison de CobB avec le peptide lactylé (AETAEK(la)YGDEQVK, de GpmA) et le peptide acétylé (AETAEK(ac)YGDEQVK, de GpmA). Les résultats de l'ITC ont montré que CobB pouvait se lier au peptide lactylé (KD = 0,371 μM), similaire au peptide acétylé (KD = 0,508 μM) (Fig. 2f, Données supplémentaires 1).

Pour caractériser les activités enzymatiques de YiaC et CobB, nous avons en outre effectué des tests de réaction enzymatique in vitro avec des peptides synthétiques. La chromatographie liquide-MS (LC-MS) a été utilisée pour surveiller Kla et Kac des peptides ayant réagi, et le spectre MS/MS a été utilisé pour vérifier sa véracité. En incubant CobB avec un peptide lactylé ou acétylé (AETAEK(la ou ac)YGDEQVK, de GpmA), nous avons constaté que CobB catalysait efficacement l'hydrolyse du peptide lactyle en présence de NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide). En revanche, le peptide délactylé n'a pas été détecté dans la réaction sans NAD +, suggérant un mécanisme de délactylation dépendant du NAD, similaire à la désacétylation (Fig. 2g). Par la suite, nous avons constaté que la réaction de délactylation pouvait être inhibée par le nicotinamide (NAM) (un inhibiteur d'HDAC de classe III) et que le NAM était plus efficace pour la désacétylation que la délactylation (Fig. 2g). Ces résultats indiquent que CobB dépendant du NAD peut catalyser la délactylation de la lysine in vitro, qui peut être inhibée efficacement par le NAM. De plus, en incubant YiaC avec un peptide (TICHDKAFVR) présentant du lactyl-CoA ou de l'acétyl-CoA, nous avons trouvé que YiaC peut catalyser la lactylation in vitro. Comparé à l'acétylation, YiaC est probablement plus efficace pour la lactylation (Fig. 2h).

Pour déterminer la cinétique enzymatique de YiaC et CobB, nous avons ensuite utilisé un test MS de désorption/ionisation-temps de vol (MALDI-TOF) assisté par matrice laser pour calculer les paramètres cinétiques (kcat, Km et kcat/Km) de YiaC pour la lactylation et CobB pour la délactylation. Les mesures cinétiques (Fig. 2i, Fig. 3 supplémentaire, Données supplémentaires 2) ont confirmé l'activité lactylase de YiaC (kcat = 0,97 ± 0,03 s−1, Km = 26,6 ± 1,1 μM, kcat /Km = 3,6 × 104 s−1 .M−1) est plus efficace que l'acétylase (kcat = 0,23 ± 0,04 s−1, Km = 28,7 ± 1,2 μM, kcat /Km = 8,0 × 103 s−1.M−1). L'activité delactylase de CobB (kcat = 0,99 ± 0,04 s−1, Km = 25,4 ± 1,5 μM, kcat /Km = 3,9 × 104 s−1.M−1) est similaire à l'activité désacétylase (kcat = 0,97 ± 0,02 s −1, Km = 18,7 ± 1,0 μM, kcat /Km = 5,2 × 104 s−1.M−1). Ces résultats montrent la caractérisation cinétique enzymatique de YiaC pour la lactylation et CobB pour la délactylation.

Pour comprendre les substrats endogènes Kla régulés par YiaC et CobB, nous avons effectué une protéomique quantitative en combinant SILAC et enrichissement par affinité pour analyser l'influence de la délétion du gène YiaC ou CobB sur le lactylome chez E. coli (Fig. 3a). En comparant les souches E. coli MG1655 yiaC+ et ΔyiaC, nous avons quantifié 451 sites Kla dans 247 protéines (Données supplémentaires 3). En normalisant les abondances détectées par rapport à l'expression de leurs protéines correspondantes (Fig. 4a supplémentaire), nous avons quantifié 79 sites Kla significativement régulés à la baisse (réduction de plus de 1,5 fois) dans E. coli ΔyiaC (Fig. 3b). Ces Kla régulés à la baisse peuvent être des substrats potentiellement fonctionnels ciblés par YiaC. De plus, en comparant les souches E. coli MG1655 cobB+ et ΔcobB, nous avons quantifié 818 sites Kla dans 375 protéines (Données supplémentaires 4). Normalisé par l'abondance des protéines correspondantes (Fig. 4b supplémentaire), le résultat a montré que plus de la moitié des sites Kla étaient significativement régulés positivement (plus d'une augmentation de 1,5 ×) dans la souche ΔcobB par rapport à la souche cobB + (Fig. 3c) . Un total de 446 sites Kla régulés à la hausse étaient des substrats candidats ciblés par CobB. En comparant les candidats ciblés par YiaC et CobB, nous avons constaté que 63% des protéines lactylées par YiaC étaient également des substrats pour CobB (Fig. 4c supplémentaire), alors que seuls 29 sites Kla sur 25 protéines étaient nettement corégulés par ces deux enzymes (Fig. 4d), ce qui indique que le système de régulation Kla composé de YiaC et CobB n'est peut-être pas le seul, et il est probable qu'il existe d'autres enzymes régulatrices intracellulaires. De plus, nous avons analysé les caractéristiques de séquence des peptides Kla potentiellement régulés par YiaC et CobB. Comme le montre la figure 3d, le glutamate et l'aspartate acides et la valine hydrophobe ont clairement entouré Kla situé dans les peptides Kla ciblés par YiaC. De plus, le glutamate acide, l'alanine hydrophobe et la lysine basique entouraient le Kla situé dans les peptides Kla ciblés par CobB (Fig. 3e). La différence dans les caractéristiques de séquence a indiqué que YiaC et CobB ont tendance à catalyser Kla dans différentes séquences d'acides aminés caractéristiques. Cela explique également dans une certaine mesure pourquoi seul un petit nombre de sites réglementés communs ont été identifiés. Pour comprendre l'importance biologique de la régulation YiaC et CobB, nous avons en outre effectué une analyse Gene Ontology (GO) des protéines candidates Kla ciblées par YiaC ou CobB. Nous avons constaté que les candidats Kla pour YiaC ou CobB sont principalement liés au métabolisme et à la biosynthèse, en particulier la glycolyse, et se produisent principalement dans le ribosome et le cytosol avec des activités de liaison à la diversité (Fig. 3f, g), ce qui suggère que Kla régulé par YiaC et CobB peut influencer le métabolisme et la biosynthèse.

a Représentation schématique du flux de travail expérimental pour la quantification SILAC. b Diagramme de dispersion montrant le rapport des peptides Kla dans E. coli MG1655 yiaC+ par rapport à ΔyiaC (normalisé par l'abondance des protéines). c Diagramme de dispersion montrant le rapport des peptides Kla dans E. coli MG1655 cobB+ par rapport à ΔcobB (normalisé par l'abondance des protéines). d Le logo du motif de séquence montre une séquence représentative des sites Kla régulés par YiaC. Le logo du motif de séquence montre une séquence représentative des sites Kla régulés par CobB. f Analyse GO pour les protéines candidates Kla ciblées par YiaC. g Analyse GO pour les protéines candidates Kla ciblées par CobB. Le seuil de valeur p = 0,05 et le seuil de valeur q = 0,2 ont été sélectionnés comme critères de seuil. La correction de Benjamini et Hochberg a été utilisée pour ajuster les valeurs P.

Les caractéristiques biologiques de Kla chez les procaryotes sont restées floues, nous avons donc combiné les deux groupes de données quantifiées sur le lactylome répertoriées dans les données supplémentaires 3, 4 et sélectionné toutes les données Kla identifiées dans E. coli MG1655 de type sauvage comme le lactylome dans E. coli. Nous avons identifié un total de 1047 sites Kla dans 478 protéines (Fig. 4a, Données supplémentaires 5). En analysant la fréquence de Kla dans les protéines, nous avons constaté que la plupart des protéines identifiées (~ 57 %) ont 1 à 2 sites Kla, et 11 % des protéines ont plus de 5 sites Kla. Fait intéressant, de nombreuses protéines riches en sites Kla sont des enzymes métaboliques et biosynthétiques (Fig. 4b), ce qui indique que Kla peut avoir des effets fonctionnels sur le métabolisme et la biosynthèse bactérienne. En analysant les caractéristiques de séquence des peptides Kla, nous avons constaté que le glutamate acide et la lysine basique étaient entourés de Kla avec une confiance élevée (Fig. 5a supplémentaire). De plus, l'analyse GO de ce lactylome a montré que les protéines lactylées sont principalement liées au métabolisme, à la traduction, à l'assemblage des ribosomes et à la biosynthèse et se produisent principalement dans les ribosomes ayant diverses activités de liaison (Fig. 5b supplémentaire). Pour analyser la probabilité de Kla par rapport à son substrat, nous avons utilisé l'intensité de Kla identifiée dans E. coli MG1655 de type sauvage divisée par l'intensité de la protéine correspondante. Nous avons défini un rapport> 0, 001 en tant que sites Kla avec une fréquence élevée sur les protéines (données supplémentaires 6); ainsi, un total de 323 sites Kla sur 240 protéines ont été définis comme se produisant à haute fréquence (Fig. 5c, d supplémentaires). L'analyse GO a montré que ces protéines à haute fréquence Kla sont également principalement liées à diverses voies métaboliques (Fig. 5e supplémentaire). Notamment, une analyse plus approfondie des protéines lactylées dans les voies a révélé que presque toutes les enzymes de la glycolyse, du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) et de la biosynthèse des acides gras sont lactylées ; de plus, la plupart de ces enzymes ont également été identifiées comme candidates à la régulation CobB ou YiaC (Fig. 4c). Il a également été démontré que CobB a une plage de régulation plus large que YiaC, et qu'ils peuvent réguler conjointement la même protéine et avoir leurs propres protéines régulatrices spécifiques.

a Analyse statistique des protéines Kla et des sites d'E. coli. b La fréquence de Kla se produit sur les protéines. c Les enzymes lactylées du métabolisme central du carbone et du réseau de biosynthèse des acides gras chez E. coli.

Pour explorer la fonction de Kla régulée par YiaC et CobB, nous avons réalisé des expériences in vitro. Selon les réseaux Kla (Fig. 3b, c), nous avons en outre effectué un groupe de réactions in vitro dans lesquelles YiaC et CobB ont été incubés avec leurs protéines candidates respectives. Ensuite, les niveaux de Kla des protéines candidates ont été détectés par immunotransfert. Nous avons constaté que YiaC peut efficacement lactyler la citrate synthase (GltA) et la nicotinate phosphoribosyltransférase (PncB) (Fig. 5a, b), tandis que CobB peut clairement délactyler la pyruvate kinase I (PykF), la phosphoglycérate mutase dépendante du 2,3-bisphosphoglycérate (GpmA) et la malate déshydrogénase (Mdh) in vitro (Fig. 5c – e). Ainsi, on peut voir que YiaC et CobB peuvent réguler les niveaux de Kla de diverses enzymes métaboliques et biosynthétiques ; en particulier, CobB peut délactyler largement les enzymes de glycolyse in vitro, ce qui est cohérent avec les résultats de l'analyse GO présentés sur la figure 3g.

a, b YiaC peut catalyser spécifiquement Kla de GltA et PncB in vitro. Le GltA ou PncB recombinant a été incubé avec YiaC en présence de lactyl-CoA (1 mM) pendant 10 h à 25 ° C, et un immunotransfert a été effectué. c – e CobB peut effacer spécifiquement Kla de GpmA, Mdh et PykF in vitro. Le GpmA, Mdh ou PykF recombinant a été incubé avec CobB pendant 10 h à 25 ° C et un immunotransfert a été effectué. f La liste des sites Kla identifiés des enzymes. g–i Détection des activités des enzymes et de leurs mutants (K à Q et K à R) (les données sont des moyennes ± SEM de trois tests indépendants, test t de Student bilatéral). Tous les immunoblots avaient trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Déterminer si Kla peut influencer l'activité enzymatique. Tout d'abord, nous avons confirmé les sites Kla de ces protéines régulées par YiaC et CobB à partir des données supplémentaires 3 et 4 (Fig. 5f), puis nous avons remplacé K lactylé par Q (glutamine) car la propriété électrique de Kla est neutre, similaire à celle de glutamine et remplacé K non modifié par R (arginine) car la charge positive de K est similaire à celle de R. En combinant les tests d'activité enzymatique in vitro, nous avons constaté que les activités enzymatiques de simulation des variants Kla PncBK381Q, GpmAK106Q et PykFK382Q étaient significativement diminuées par rapport à celles des protéines de type sauvage. Les activités enzymatiques des mutants non modifiés PncBK381R, GpmAK106R et PykFK382R ont été augmentées (Fig. 5g – i). Ces résultats suggèrent que YiaC et CobB peuvent médier Kla pour influencer les activités des enzymes métaboliques.

Notamment, les voies métaboliques et synthétiques affectent la croissance bactérienne42,43,44. Par conséquent, nous avons rationnellement prédit que les modifications des activités PncB, GpmA et PykF causées par Kla pourraient influencer la croissance bactérienne. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons d'abord confirmé la fiabilité des peptides Kla identifiés en synthétisant trois types de peptides Kla du protéome lié à YiaC et trois types de peptides Kla du protéome lié à CobB contenant les peptides PncB K381la (TICHDK(la) AFVR), GpmA K106la (AETAEK(la)YGDEQVK) et PykK382la (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR). Comme le montrent les Fig. 6a, b et la Fig. 6 supplémentaire, les spectres MS/MS entiers des peptides Kla synthétiques se chevauchent presque complètement avec les peptides modifiés de manière intracellulaire ; par conséquent, la fiabilité des peptides Kla a été confirmée. Ensuite, nous avons construit séparément PykF, PykFK382Q et PykFK382R surexprimant E. coli MG1655 (souches pPykF, pPykFK382Q et pPykFK382R), et nous avons construit les souches pPncB, pPncBK381Q, pPncBK381R, pGpmA, pGpmAK106Q et pGpmAK106R. souches. Ensuite, les courbes de croissance ont été détectées après culture dans un milieu de bouillon de lysogénie (LB). Nous avons constaté que pPncB, pGpmA et leurs souches mutantes ne présentaient aucune différence de croissance (Fig. 7a, b supplémentaires). Cependant, dans le groupe PykF, la souche pPykFK382R a connu la croissance la plus rapide, tandis que la souche pPykFK382Q a connu la croissance la plus lente parmi les trois souches avec les mêmes niveaux de surexpression (Fig. 6c, d). De plus, nous avons détecté une activité PykF intracellulaire. Conformément aux courbes de croissance, la souche pPykFK382R a montré l'activité la plus élevée et pPykFK382Q avait l'activité la plus faible parmi les trois souches (Fig. 6e). Comme indiqué, PykF est une enzyme critique limitant la vitesse de la glycolyse qui contrôle le flux métabolique et influence la division cellulaire bactérienne45. Ces résultats démontrent que PykF K382la ralentit la croissance bactérienne en réduisant l'activité de PykF. Pour confirmer davantage cette observation, considérant que le phosphoénolpyruvate produit par la glycolyse du glucose peut produire du pyruvate sous la catalyse de PykF46,47, nous avons sélectionné le milieu minimal M9 avec 1 % de glucose pour que PykF remplisse sa fonction métabolique normale et sélectionné le milieu minimal M9 avec 1 % de pyruvate. pour bloquer la fonction de PykF. Ensuite, nous avons mesuré les courbes de croissance et l'activité PykF intracellulaire de ces trois souches dans du milieu minimal M9 avec 1% de glucose, comme dans LB. La souche pPykFK382R s'est développée le plus rapidement et a montré l'activité PykF la plus élevée, et la souche pPykFK382Q s'est développée la plus lente et a montré l'activité PykF la plus faible (Fig. 6f, g). A l'inverse, pour bloquer l'influence de PykF, nous avons mesuré les courbes de croissance et l'activité intracellulaire de PykF de ces trois souches cultivées en milieu minimal M9 avec 1% de pyruvate. Nous avons constaté qu'il n'y avait pas de différence dans la croissance des trois souches (Fig. 6h). Ces résultats illustrent que PykF K382la affecte la croissance bactérienne en réduisant l'activité de PykF.

a Le spectre MS/MS du peptide (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR, PYKF) du protéome de ΔcobB. b Le spectre MS/MS du peptide synthétique (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR). c Sélection de la même expression de PykF recombinant pour les souches de surexpression par immunotransfert avec son anticorps tag. d Courbe de croissance de mesure des souches d'E. coli surexprimant PykF (pPykF, pPykFK382Q et pPykFK382R) cultivées dans du milieu LB à 37 ° C avec des plaques à 96 puits. e Mesure de l'activité intracellulaire de PykF des souches apparentées à d. f Courbe de croissance de mesure des souches pPykF, pPykFK382Q et pPykFK382R cultivées dans du milieu M9 avec 1 % de glucose à 37 °C avec des plaques à 96 puits. g Mesure de l'activité intracellulaire de PykF de souches apparentées à f. h Courbe de croissance de mesure des souches pPykF, pPykFK382Q et pPykFK382R cultivées dans du milieu M9 avec 1 % de pyruvate à 37 °C avec des plaques à 96 puits. i CobB a catalysé la délactylation de PykF K382la in vitro. Le peptide synthétique PykF K382la (LDAPLIVVATQGGK (la) SAR) a été utilisé comme substrat pour la réaction CobB avec détection LC-MS de l'activité de délactylation de la lysine de CobB. j, k CobB régulation de l'activité PykF en effaçant K382la in vitro. PYKF a ​​été incubé avec CobB pour diminuer K382la (j), après délactylation, détection de l'activité de PykF (k). l Mesure de la courbe de croissance des souches E. coli MG1655 cobB+ et ΔcobB cultivées en milieu M9 avec 1% de glucose à 37 °C avec des plaques 96 puits. m Mesure de l'activité intracellulaire de PykF de souches apparentées à l. n Mesure de la courbe de croissance des souches E. coli MG1655 cobB+ et ΔcobB cultivées en milieu M9 avec 1% de pyruvate à 37 °C avec des plaques 96 puits. o Analyse 3D du résultat de la simulation MD du système PykF-FBP. p Analyse 3D du résultat de la simulation MD du système PykF K382la-FBP. Pour mesurer l'activité PykF et la courbe de croissance, n = 3 répétitions biologiques, les données sont des moyennes ± SEM, test t de Student bilatéral, les valeurs P sont indiquées sur la figure, NS signifie non significatif. OD600, densité optique à 600 nm. Les immunotransferts ont eu trois répétitions biologiques, avec des résultats similaires. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Le lactylome a montré que CobB délactylait PykF K382la de manière intracellulaire (Fig. 5f). Pour confirmer ce résultat, nous avons incubé le peptide PykF K382la (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR) avec CobB et détecté les produits par LC‒MS/MS, et les résultats ont montré que CobB peut catalyser efficacement la délactylation de PykF K382la in vitro (Fig. 6i ). Ainsi, nous avons incubé PykF avec CobB pour effacer PykF K382la (Fig. 6j), puis avons détecté l'activité. Le résultat a montré que CobB effaçant PykF K382la augmentait l'activité de PykF in vitro (Fig. 6k). Pour les dosages intracellulaires, nous avons mesuré les courbes de croissance et l'activité PykF intracellulaire des souches cobB+ et ΔcobB cultivées en milieu minimal M9 avec 1% de glucose ou 1% de pyruvate. De plus, nous avons constaté que la souche cobB + se développait plus rapidement que la souche ΔcobB dans un milieu minimal M9 avec 1% de glucose (Fig. 6l). De plus, l'activité PykF intracellulaire de cobB + était supérieure à celle de la souche ΔcobB (Fig. 6m). Comme prévu, il n'y avait aucune différence dans la croissance des souches cobB + et ΔcobB (Fig. 6n). Ensemble, ces résultats démontrent que CobB peut réguler l'activité de PykF et influencer la croissance bactérienne en effaçant PykF K382la in vitro et intracellulairement.

Des études antérieures ont indiqué que le fructose 1,6-bisphosphate (FBP) peut se lier à PykF et activer allostériquement PykF, et que K382 est une régulation allostérique liée au site clé de PykF48,49,50. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que la diminution de l'activité de PykF par K382la pourrait être due à l'influence sur l'activation allostérique. Pour confirmer cela, nous avons en outre effectué des simulations de dynamique moléculaire (MD) de 100 ns pour PykF-FBP et PykF K382la-FBP à trois reprises, respectivement. Pour observer la stabilité dynamique des deux complexes du système, les écarts quadratiques moyens (RMSD) ont été surveillés à partir de la structure de départ. Nous avons constaté que les RMSD moyennes de ces deux complexes de systèmes fluctuent légèrement (Fig. 8a supplémentaire), ce qui suggère que les deux systèmes sont stables. Pour mieux comprendre l'influence sur la liaison, nous avons mesuré les distances moyennes entre l'atome d'azote de la chaîne latérale K382 et l'atome de carbone central du FBP dans le système PykF-FBP et le système PykF K382la-FBP de 45 ns à 100 ns, respectivement ( Fig. 8b supplémentaire). Nous avons constaté que la distance moyenne de trois fois entre le K382 et le FBP est très stable dans le système PykF-FBP, mais que celle du K382la et du FBP a des fluctuations importantes dans le système PykF K382la-FBP. Ce résultat indique que PykF K382la peut affecter la liaison entre FBP et PykF. Afin d'observer les changements dans la microstructure, nous avons sélectionné la structure initiale et stable (0 et 55 ns) en utilisant le GROMACS sur deux processus de simulation, respectivement. Pour le système PykF-FBP, nous pouvons voir que la distance de K382 et FBP dans la structure initiale est de 9,4 Å, et celle dans la structure stable n'est que de 8,4 Å (Fig. 6o). Pour le système PykF K382la-FBP, la distance entre le K382la et le FBP dans la structure initiale est de 10,7 Å, tandis que celle dans la structure stable est de 15,8 Å (Fig. 6p). Ainsi, ces résultats suggèrent que PykF K382la entrave la liaison entre FBP et PykF et affaiblit davantage l'activation allostérique de PykF, réduisant finalement l'activité de PykF.

Le lactate, autrefois considéré comme un déchet métabolique, est maintenant reconnu comme un métabolite important chez les mammifères. Le lactate agit comme un carburant glucidique circulant majeur en fournissant des composés à trois carbones51 et en modulant les microenvironnements cellulaires pour réguler le développement tumoral et la réponse immunitaire52,53. La découverte de la lactylation de la lysine a ouvert l'horizon de la régulation fonctionnelle par le lactate, et Kla sur les histones a servi de marqueur important pour réguler la transcription chez les eucaryotes11,15,17. Toutes ces preuves ont démontré l'importance de Kla. Pour les bactéries, le lactate a été initialement identifié comme un métabolite secondaire universel, et la fermentation bactérienne est la principale méthode de production industrielle de lactate54. Le lactate est une source de carbone importante pour le métabolisme bactérien55, et l'utilisation du lactate microbien peut moduler la résistance au stress, le remodelage de la paroi cellulaire et les facteurs de virulence56. De plus, les métabolites microbiens de l'hôte sont un facteur critique influençant de nombreux processus physiologiques et le développement de maladies57, dans lesquelles le lactate peut perturber le microenvironnement et provoquer une réponse immunitaire56,58. La présence de Kla chez les procaryotes et les fonctions biologiques qu'il pourrait remplir restent incertaines. Ainsi, il est nécessaire d'explorer la caractérisation, les fonctions et les mécanismes de régulation de Kla chez les bactéries.

Notre étude montre que Kla est largement distribué dans les protéines bactériennes. Il est important de noter que nous avons identifié une paire d'enzymes catalytiques Kla dans lesquelles CobB sert de delactylase, tandis que YiaC fonctionne comme lactylase (Fig. 7). Par la constante de liaison thermodynamique et la cinétique enzymatique, nous avons caractérisé les capacités catalytiques de CobB et YiaC et prouvé en outre que le mécanisme de régulation de la délactylation par CobB dépend du NAD et que la lactylation par YiaC dépend de La-CoA. Pour la génération de Kla, nous avons détecté la présence de lactyl-CoA en tant que donneur de Kla dans E. coli et avons constaté que les lysats frais de cellules entières présentent une activité catalytique pour la conversion du lactate en lactyl-CoA (Fig. 2e supplémentaire). De plus, nous avons identifié YdiF comme transférase pour la production de lactyl-CoA dans E. coli (Fig. 2a – c).

YiaC et CobB régulent Kla dans E. coli et influencent la croissance bactérienne en régulant l'activité de PykF.

Pour comprendre les réseaux de régulation endogènes, nous avons effectué une protéomique quantitative et identifié 79 sites candidats Kla régulés par YiaC et 446 sites candidats Kla ciblés par CobB. Il convient de noter que YiaC et P300 appartiennent à des familles de protéines différentes, tandis que ce dernier a une activité lactylase dans les cellules humaines11, et CobB est une delactylase, qui est également distincte de HDAC1-3, qui servent de delactylases chez les eucaryotes25. Cette découverte indique ainsi qu'il peut y avoir d'autres lactylases et délactylases potentielles chez les eucaryotes. De plus, YiaC a été précédemment signalé comme une lysine et une acétylase N-terminale59,60, et CobB a été signalé comme une lysine acétylase, succinylae et 2-hydroxyisobutyryltransférase8,33,34. Par conséquent, nous avons élargi la compréhension des enzymes régulatrices d'acylation dans la diversité réglementaire et fonctionnelle. L'acylation de la lysine dépend de la dose du métabolisme de l'acyl-CoA et des acides organiques correspondants61,62, et des changements dans le métabolisme peuvent mobiliser des enzymes régulatrices pour réguler les niveaux d'acylation. Le lactate s'accumule dans E. coli lors de la fermentation du glucose63, et l'augmentation du taux de lactate peut mobiliser YiaC et CobB pour maintenir l'équilibre de Kla.

Nous rapportons ici une analyse globale des lactylomes de lysine chez les bactéries. Un total de 1047 sites Kla ont été identifiés dans 478 protéines d'E. coli. Cette modification est répandue mais est principalement enrichie en enzymes métaboliques. Comme le montre la figure 4c, presque toutes les enzymes de la glycolyse et du TCA sont lactylées ; notamment, ces enzymes sont également identifiées comme des candidats ciblés par CobB, suggérant que CobB pourrait effacer Kla pour réguler les activités des enzymes métaboliques. En effet, nos résultats montrent que CobB et YiaC peuvent médier Kla pour exercer des effets sur leurs substrats. Par exemple, CobB régule à la baisse K106la de GpmA et K382la de PykF pour améliorer les activités des enzymes correspondantes, et YiaC régule à la hausse K381la de PncB pour diminuer l'activité de PncB. Surtout, nous démontrons que CobB efface K382la de PykF pour favoriser la glycolyse et la croissance bactérienne. Notre étude révèle que Kla a un effet régulateur important sur le métabolisme chez les bactéries, distinct de la transcription régulatrice de Kla chez les eucaryotes11,15. En tant que produit final de la glycolyse anaérobie chez les bactéries (Fig. 7)55, le lactate peut être catalysé pour produire du lactyl-CoA, qui est un substrat nécessaire à la génération de Kla11. Par conséquent, les métabolites peuvent influencer efficacement le niveau de Kla des enzymes métaboliques intracellulaires. Inversement, notre étude révèle que Kla médiée par CobB régule les activités des enzymes métaboliques et influence davantage la glycolyse, suggérant une cascade de signalisation métabolisme-PTM-métabolisme qui régule l'équilibre du métabolisme et du PTM.

En résumé, nous avons initialement identifié le système de régulation procaryote Kla dans lequel YiaC est une lysine actylase et CobB sert de delactylase. Nous avons ensuite profilé les candidats endogènes de YiaC et CobB, fournissant un cadre pour étudier les diverses fonctions de Kla régulées par YiaC et CobB chez les procaryotes. De plus, nous avons décrit les caractéristiques du lactylome chez E. coli contenant 1047 sites Kla dans 478 protéines. Surtout, nous avons démontré que CobB peut augmenter l'activité de PykF en effaçant K382la, en améliorant la glycolyse et la croissance bactérienne. Notre travail présente le système de régulation et le réseau moléculaire de Kla et offre un nouvel aperçu du mécanisme médié par Kla pour la régulation du métabolisme chez les bactéries.

Les cellules E. coli MG1655 et les cellules E. coli MG1655 ΔcobB ont été obtenues à partir de notre étude précédente8, E. coli BL21 (λDE3) provenait de TIANGEN, E. coli MG1655 ΔyiaC et les gènes de la famille GNAT surexprimant les souches E. coli BL21 (λDE3) étaient tiré de notre précédente étude9. Tous les anticorps anti-acyllysine ont été achetés auprès de PTM Biolabs Inc. Tous les peptides synthétiques ont été générés par SciLight Biotechnology, LLC. Les anticorps (tous dilués à 1:1000) et autres réactifs sont répertoriés dans les données supplémentaires 7.

Cette méthode a été réalisée comme décrit précédemment9. En détail, des plasmides ont été construits pour exprimer des protéines dans E. coli. Nous avons utilisé pEASY®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (TRANS) pour construire les plasmides de pET28a-cisY, pET28a-pncB, pET28a-gpmA, pET28a-mdh, pET28a-pykF et pBR322-pykF-His tag. Pour la mutation, nous avons utilisé le Fast Mutagenesis System (TRANS) pour construire les vecteurs contenant des gènes mutés ponctuels. Toutes les amorces utilisées pour la PCR sont répertoriées dans les données supplémentaires 7. Les vecteurs construits de pET28a ont été transformés dans E. coli BL21 (λDE3) pour les souches surexprimantes. Les vecteurs construits de pBR322 ont été transformés en E. coli MG1655 et cultivés dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (Amp, 50 μg ml–1), à 37 °C dans des flacons agités à 220 tr/min. pendant la nuit.

Les E. coli BL21 (λDE3) construits transformés avec des vecteurs gène-pET28a ont été cultivés dans un milieu LB contenant de la kanamycine (Kana, 50 μg ml–1), à 16 °C dans des flacons agités à une densité optique de 0,6–0,8 à 600 nm . Ensuite, les cellules ont été induites avec de l'IPTG 0, 05 mM à 16 ° C pendant la nuit, suivies de la récolte de lysats de cellules entières pour immunotransfert ou purification de protéines. Les protéines ont été récoltées à partir de cellules cultivées par un tampon de lyse (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, MgCl2 10 mM, 1 mg ml-1 lysozyme, 50 U ml-1 nucléase). Ensuite, les protéines ont été mélangées avec de la résine HisPur Ni-NTA et lavées avec un tampon de lavage (Na3PO4 20 mM, NaCl 300 mM, imidazole 25 mM, pH 7,4), les protéines surexprimées ont été éluées avec un tampon d'élution (Na3PO4 20 mM, NaCl 300 mM, 250 mM d'imidazole, pH 7,4). L'élution a été recueillie et concentrée à l'aide d'un dispositif de filtre centrifuge Amicon Ultra-0,5 dans un tampon de stockage (HEPES 100 mM, MgCl2 10 mM, KCl 7,7 mM, pH 7,0).

Nous avons synthétisé le lactyl-CoA comme décrit précédemment8. En détail, le dicyclohexylcarbodiimide a été ajouté à une solution de mélange de diméthylformamide contenant de l'acide lactique et du thiophénol, et agité à 4 ° C, la réaction a été arrêtée en ajoutant de l'eau froide. La solution a été extraite par de l'éther et lavée trois fois avec du chlorure de sodium saturé, et séchée l'extrait éthéré par du sulfate de sodium anhydre, puis purifié le résidu par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluée par un mélange 20:1 d'acétate d'éthyle et d'hexane) suivi de chromatographie sur couche mince de silice (éluée par un mélange 1:4 d'acétate d'éthyle et d'hexane). La purification a été dissoute dans du bicarbonate de sodium 0,1 M, puis ajoutée à un tampon de bicarbonate de sodium contenant du sel de sodium de CoA à 0°C. Après une nuit de repos, la réaction a été interrompue par le HCl à pH 7,0. Le produit final a été évaporé dans l'eau à 30°C et extrait par de l'éther et de l'acétate d'éthyle.

Cette méthode a été réalisée comme décrit précédemment64. En détail, les Acs ou PrpE purifiés avec une concentration finale de 0,3 μM ont été ajoutés dans le tampon de réaction [HEPES 50 mM, MgCl2 10 mM, ATP 2,5 mM, HSCoA 0,5 mM, phosphoénolpyruvate 3 mM, NADH 0,1 mM, pyruvate kinase 1 U , 1,5 U lactate déshydrogénase, 5 U myokinase, 10 mM DTT et 0,2 mM substrat acide organique (acétate, lactate et propionate), pH 7,5] à 25 ° C pendant 30 min. Après avoir désactivé la réaction en ajoutant un volume égal d'acide trifluoroacétique à 10 % (v/v) et nettoyé avec des ZipTips C18, les produits d'actyl-CoA ont été analysés par LC-MS/MS. Chaque réaction a été effectuée trois répétitions biologiques.

Cette méthode a été décrite précédemment37. En détail, E. coli MG1655 a été cultivé dans du milieu LB à 37 ° C dans des flacons agités pendant la nuit et a récolté les cellules par centrifugation, puis a ajouté un tampon de lysat [50 mM NaH2PO4, 50 mM NaH2PO4 et 5 mM MgCl2, PH 7.0] et cassé les cellules par ultrasons sur glace, le surnageant a été extrait par centrifugation à grande vitesse sous forme de lysat protéique entier. Puis mesuré la concentration de protéines par BCA et ajusté la concentration de protéines à 2 mg/ml. En ajoutant 5 mM d'ATP, 2 mM de HSCoA, 10 mM de DTT et 0,5 mM de lactate dans un lysat de protéines entières comme système de réaction, la réaction a été effectuée à 25 ° C pendant 30 min, après avoir éteint la réaction en ajoutant un volume égal de 10 % (v/ v) acide trifluoroacétique et centrifugation, le surnageant a été nettoyé avec des ZipTips C18 et les produits de lactyl-CoA ont été analysés par LC-MS/MS. Chaque réaction a été effectuée trois répétitions biologiques.

Le dosage de l'activité YdiF CoA-transférase a été réalisé comme décrit précédemment40, avec de légères modifications comme suit : les réactions enzymatiques ont été réalisées dans un tampon phosphate [50 mM NaH2PO4, 50 mM Na2HPO4 et 5 mM MgCl2, PH 7,0] contenant 1 mM d'acétoacétyl- CoA et L-lactate ou acétate 10 mM à 35 ° C pendant 20 min, et initialisé en ajoutant les 7, 5 μg d'YdiF purifié. Le volume total du mélange réactionnel était de 50 µL. Les mélanges ont été pré-incubés à la température de réaction désignée pendant 5 min avant l'initiation. Les réactions ont été terminées en ajoutant un volume égal d'acide trifluoroacétique à 10 % (v/v) et centrifugation, le surnageant a été nettoyé avec des ZipTips C18 et les produits de lactyl-CoA ont été analysés par LC-MS/MS. Chaque réaction a été effectuée trois répétitions biologiques.

Les échantillons dissous dans l'eau ont été analysés par un spectromètre de masse Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) en mode ESI positif en utilisant les paramètres décrits précédemment65,66. En détail, les échantillons ont été séparés par une colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1*100 mm, 1,7 μm), le gradient HPLC pendant 15 min a été configuré comme suit : débit de 0,2 mL/min à 98 % de tampon A (eau avec 5 mM acétate d'ammonium) et 2 % de tampon B (95 % d'acétonitrile dans de l'eau avec 5 mM d'acétate d'ammonium) pendant 0 min, 98 à 70 % de tampon A pendant 8 min, 70 à 2 % de tampon A pendant 1 min, 2 % de tampon A pendant 3 min, 2 à 98 % de tampon A pendant 1 min, 98 % de tampon A pendant 2 min. Un Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour l'analyse MS. La tension de pulvérisation a été réglée à 3,5 kV, le niveau RF de l'entonnoir à 40 et la température du tube de transfert d'ions à 320 °C. Les données ont été collectées par Xcalibur (v.4.0.27.19). L'analyseur de masse orbitrap a été utilisé comme détecteur MS1 avec une résolution de 120 000. La cible AGC normalisée et le temps d'injection maximal ont été fixés à 70 % / standard pour MS1. Le détecteur MS2 a été utilisé avec une résolution de 15 000. Le réglage de masse ciblé est le lactyl-CoA : 840.1436, l'acétyl-CoA : 810.1330 et le propionate CoA : 824.1487. La fenêtre d'isolement MS2 était de 2 Da et la tolérance de masse était de 10 ppm, et une énergie de collision normalisée HCD (dissociation induite par collision à haute énergie) de 25 % a été utilisée pour la fragmentation des précurseurs. L'intensité relative de l'acyl-CoA a été analysée par Xcalibur (v.4.0.27.19).

Cette méthode a été décrite précédemment8. En détail, à l'aide du calorimètre de titrage MicroCal PEAQ-ITC (Malvern Instruments) à 37 ° C, la cellule de réaction contenant 50 μM de YiaC (ou CobB) a été titrée avec 500 μM d'actyl-CoA (ou de peptides actylés) différents. Le volume de la première injection était de 0,5 μl de 500 μM d'actyl-CoA (ou de peptides actylés), et les 18 injections suivantes étaient de 2,0 μl. L'isotherme de liaison a été ajusté avec le logiciel Origin 8.0 (OriginLab). Chaque groupe avait trois répétitions biologiques.

La réaction CobB a été décrite comme précédemment8. En détail, des peptides lactylés ou acétylés (50 μM) avec 1 μM de CobB ont été incubés dans du tampon de réaction CobB [50 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT et 1 mM NAD+ (pH 8.5)] avec ou sans NAM 10 mM pendant 2 h à 37 °C. Pour la réaction YiaC, des peptides non modifiés (50 μM) avec 5 μM de YiaC ont été incubés dans du tampon de réaction YiaC [HEPES 100 mM, MgCl2 100 mM, KCl 10 mM et lactyl-CoA ou acétyl-CoA 0,1 mM (PH = 7)] pendant 2h à 37°C. Après réaction de trempe avec un volume égal d'acide trifluoroacétique à 10 % (v/v), les échantillons ont été centrifugés pendant 10 min à 18 000 × g pour séparer l'enzyme. Les échantillons ont été séparés par un gradient HPLC de 28 min [gradient linéaire de 5 à 50 % de tampon HPLC B (0,1 % d'acide formique dans de l'acétonitrile) pendant 3 min, puis à 100 % de tampon B pendant 20 min et en gardant 100 % de tampon B pendant 5 min].

Cette méthode a été décrite précédemment8. CobB a été incubé avec des peptides modifiés (AETAEK (la) YGDEQVK ou AETAEK (ac) YGDEQVK, de GpmA) dans le tampon de réaction CobB à 37 ° C pendant 2 min. Pendant ce temps, YiaC a été incubé avec un peptide non modifié (TICHDKAFVK, de PncB) dans le tampon de réaction YiaC. Les concentrations des peptides étaient de 5, 10, 16, 32, 60 et 285 uM et les temps de réaction étaient de 1, 5, 15 et 30 min. Après avoir éteint la réaction en ajoutant un volume égal d'acide trifluoroacétique à 10 % (v/v) et nettoyé avec des ZipTips C18, les produits ont été analysés par un spectromètre de masse Autoflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics) avec un mode ion positif réflexe équipant les ions retardés. extraction. Des échantillons de 0,1 μl mélangés à de l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) ont été analysés par MS. Une tension d'accélération de 20 kV a été utilisée. Les données MS ont été analysées à l'aide du logiciel FlexAnalysis pour le traitement spectral et la détection des pics. La cinétique enzymatique a été analysée par le logiciel Prism GraphPad 8.0.

Comme décrit précédemment8, E. coli MG1655, E. coli MG1655 ΔyiaC et ΔcobB ont été cultivés à 37 °C dans du milieu minimal M9 avec du glucose à 0,2 % et de la L-lysine (100 mg ml–1) ou de la 13C6-lysine (100 mg ml– 1) montré comme Fig. 3A. Les cellules ont été récoltées pendant la phase mi-exponentielle puis soniquées sur de la glace dans du PBS. Après centrifugation (20 000 g) à 4°C pendant 20 min, le surnageant a été récupéré. Des quantités égales de protéines de E. coli MG1655 et MG1655 ΔyiaC (ou ΔcobB) ont été mélangées et précipitées par de l'acide trichloroacétique, les précipités ont été dissous dans du NH4HCO3 100 mM avec une digestion nocturne par la trypsine (rapport trypsine: protéine, 1:50). Les produits digérés ont été incubés avec du DTT 10 mM à 37 ° C pendant 1 h, suivi d'une alkylation avec de l'iodoacétamide 20 mM pendant 45 min à température ambiante dans l'obscurité. L'excès d'iodoacétamide a été bloqué avec de la cystéine 20 mM, une dernière digestion a été effectuée à un rapport de 1:100 pendant 4 h. Les produits ont été dessalés par des cartouches SepPak C18 (Waters) et séchés.

Les peptides tryptiques ont été redissous dans du tampon NETN (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % Nonidet P-40) et incubés avec des billes d'agarose conjuguées à l'anticorps anti-lactyllysine (PTM Biolabs) à 4 °C pendant la nuit, avec rotation douce. Les billes incubées ont été lavées trois fois avec du tampon NETN, deux fois avec du tampon ETN (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM et EDTA 1 mM) et trois fois avec de l'eau. Les peptides liés ont été élués trois fois avec de l'acide trifluoroacétique à 1 %. Enfin, les éluats ont été séchés et nettoyés avec des C18 ZipTips (Millipore Corp) avant l'analyse par nano-HPLC-MS/MS.

Les peptides enrichis ont été analysés par HPLC-MS/MS. Les échantillons ont été reconstitués dans de l'acide formique à 0,1 %, puis injectés dans un système nano-LC (EASY-nLC 1200, Thermo Fisher Scientific). Les peptides ont été résolus par une colonne C18 de 75 µm de diamètre intérieur et de 25 cm de long (3 µm, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Allemagne) à un débit de 300 nL/min. L'élution en gradient a été réalisée avec du tampon HPLC B à 2-45 % (0,1 % d'acide formique dans de l'acétonitrile à 80 %) pendant 90 min, puis une transition vers un tampon B à 100 % pendant 15 min et un maintien avec un tampon B à 100 % pendant 5 min. Un spectromètre de masse Orbitrap Eclipse Tribrid avec une interface FAIMS Pro (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour l'analyse MS. La tension de pulvérisation a été réglée à 2,1 kV, le niveau RF de l'entonnoir à 40 et la température du tube de transfert d'ions à 320 °C. L'analyse par spectrométrie de masse a été réalisée en mode d'acquisition dépendante des données (DDA) des précurseurs les plus intenses, et les données ont été collectées par Xcalibur (v.4.0.27.19). Une combinaison de CV FAIMS de -40V/-60V/-80V (tension de compensation) a été réglée pour fonctionner en mode DDA pendant un cycle de 1 s pour construire un grand cycle de 3 s. L'analyseur de masse orbitrap a été utilisé comme détecteur MS1 avec une résolution de 60 000 et une plage de balayage de 350 à 1 600 m/z. La cible AGC normalisée et le temps d'injection maximal ont été fixés à 100 %/20 ms pour MS1 et à 200 %/30 ms pour MS2. L'analyseur de masse orbitrap a été utilisé comme détecteur MS2 avec une résolution de 17 500. Les ions précurseurs avec des charges de +2 à +5 ont été isolés pour MS2, et le temps d'exclusion dynamique a été fixé à 50 s. La fenêtre d'isolement MS2 était de 1, 6 Da et une énergie de collision normalisée HCD (dissociation induite par collision à haute énergie) de 30% a été utilisée pour la fragmentation des précurseurs.

Les critères de recherche et de filtrage de la base de données ont été effectués comme décrit précédemment8. En détail, les données brutes ont été recherchées par MaxQuant (v.1.5.5.1) avec la base de données de protéines UniProt E. coli K12 (Proteome ID : UP000474145) et un taux global de fausses découvertes pour les peptides inférieur à 1 %. La recherche de séquences peptidiques a été définie comme spécificité de la trypsine, deux clivages manqués pour la longueur maximale et sept pour la longueur minimale du peptide. La carbamidométhylation sur Cys a été spécifiée comme modification fixe. La lactylation sur la lysine, l'oxydation de la méthionine et l'acétylation sur l'extrémité N-terminale du peptide ont été fixées comme modifications variables. Les tolérances de masse ont été fixées à ±10 ppm pour les ions précurseurs et ±0,02 Da pour MS/MS. Les peptides lactylés avec un score <40 et une probabilité de localisation <0,75 ont été en outre exclus. Nous avons normalisé tous les ratios de peptides Kla par les ratios des taux de protéines correspondants.

La fonction GO (Gene Ontology) dans trois catégories BP (Biological Processes), CC (Cellular Component) et MF (molecular functions) enrichissement des voies analysées via le package R/Bioconductor "clusterProfiler" (version : 4.0)67. Le seuil de valeur p = 0,05 et le seuil de valeur q = 0,2 ont été sélectionnés comme critères de seuil. La signification statistique a été calculée à l'aide d'un test exact de Fisher bilatéral non apparié. La correction de Benjamini et Hochberg a été utilisée pour ajuster les valeurs P.

Le YiaC recombinant purifié (15 μM) et les protéines de substrat candidates (GltA, PncB, 20 μM) ont été incubés dans un tampon de réaction YiaC à 25 ° C pendant 10 h. Le CobB recombinant purifié (15 μM) et les substrats candidats (GpmA, Mdh, PykF, 20 μM) ont été incubés dans un tampon de réaction CobB à 25 ° C pendant 10 h. Les produits de la réaction ont été analysés par Western blot avec anti-lactylation.

L'activité de PncB, PncBK381Q et PncBK381R purifiés a été mesurée comme décrit68. En détail, les protéines purifiées ont été ajoutées dans le tampon de réaction [Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, dithiothréitol 2,5 mM, ATP 1 mM, 25 g d'albumine de sérum bovin, acide nicotinique 1 mM et 5-phosphoribosyl-1 mM -pyrophosphate (pH 7,5)] à 37 °C pendant 2 h. Les réactions ont été mesurées par HPLC-MS/MS pour détecter la production d'acide nicotinique. La séparation a été réalisée sur un système Vanquish UHPLC (Thermo Fisher Scientific) avec une colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 μm). La phase mobile A était de l'acide formique à 0,1 % dans l'eau. La phase mobile B était de l'acide formique à 0,1 % dans du méthanol. L'élution par gradient (0,0 min, 0 % B ; 2 min, 15 % B ; 4 min, 100 % B ; 5 min, 0 % B) a été effectuée à un débit de 0,2 ml/min et à une température de colonne constante de 20 °C. Le volume d'injection était de 2 µl. La détection de l'acide nicotinique a été réalisée sur un spectromètre Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific, Brême, Allemagne) fonctionnant avec une sonde ESI. Les données ont été acquises sous les paramètres suivants : gaz de gaine ((N2), 35 Arb ; gaz aux (N2), 10 Arb ; tension de pulvérisation, 3 500 V (mode positif) ; et température du tube de transfert, 320 °C. Un SIM a été appliquée pour l'acquisition de données.

L'activité de GpmA, GpmAK106Q et GpmAK106R purifiés a été mesurée comme décrit69. En détail, les recombinants purifiés GpmA, GpmAK106Q ou GpmAK106R ont été incubés dans un tampon de réaction [Tris-HCl 100 mM, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, ADP 1 mM et NADH 0,2 mM (PH 7,0)] avec 0,5 U énolase, 0,5 U pyruvate kinase, 0, 1 U Ldh et 2 mM de 3-phosphoglycérate pendant 1 h à 30 ° C, et des échantillons sans GpmA ont servi de blanc. L'oxydation du NADH a été mesurée en tant qu'activité GpmA par autofluorescence à 340 nm.

L'activité de PykF, PykFK382Q et PykFK382R purifiés a été mesurée comme décrit70. En détail, les recombinants purifiés PykF, PykFK382Q et PykFK382R ont été incubés dans un tampon de réaction [50 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 15 mM MgCl2, 25 % glycérol, 175 μM NADH, 5 mM phosphoénolpyruvate, 5 mM ADP et 5 mM fructose 1,6-bisphosphate (PH 8,0)] avec 1 U de lactate déshydrogénase pendant 10 min à 32 ° C, et des échantillons sans PykF ont servi de blanc. L'oxydation du NADH a été mesurée en tant qu'activité PykF par autofluorescence à 340 nm.

E. coli dans 5 ml de milieu de culture a été récolté. Le test a été effectué avec le kit de test d'activité Pyruvate Kinase (Sigma – Aldrich, MAK072) en suivant le protocole du fabricant.

Comme décrit précédemment8, les souches ont été cultivées dans du milieu LB pendant une nuit, puis diluées au 1/1000 dans du milieu LB ou M9 (avec 1 % de glucose ou 1 % de pyruvate) et incubées à 37 °C avec des plaques à 96 puits, et chaque souche a été ajoutée à trois puits. L'absorbance à 600 nm à l'initiation a été définie comme un blanc et mesurée toutes les heures à l'aide d'un spectrophotomètre. Toutes les courbes dynamiques de croissance ont été tracées avec Origin 8.0.

Nous avons réalisé deux systèmes PykF/PykF K382la-FBP pour des simulations de dynamique moléculaire (MD) de 100 ns à trois reprises. Les coordonnées initiales des systèmes ont été obtenues à partir de structures cristallines aux rayons X avec PDB ID 1PKY. Toutes les simulations MD ont été effectuées à l'aide de GROMACS 2019.6 (définir les valeurs par défaut comme paramètres). Le progiciel avec le champ de force Gromos 54A7 a été appliqué pour décrire le PykF, et le champ de force Gromos 54A8 a été utilisé pour le PykF K382la. Gromos 54A7 et Gromos 54A8 ont été téléchargés depuis Vienna-PTM. Les champs de force du ligand FBP ont été obtenus à partir de la base de données Automated Topology Builder (ATB) (Version 3.0) (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md). Les systèmes complexes ont été analysés par des simulations MD dans une boîte cubique avec le modèle d'eau SPC. Pour neutraliser les systèmes, des ions chlorure et sodium ont été ajoutés au hasard dans la boîte de simulation. Au cours des simulations MD, les interactions coulombiques à longue portée ont été traitées à l'aide de la méthode du maillage de particules d'Ewald (PME). La minimisation énergétique de l'ensemble du système a été réalisée sur 50 000 pas avec la méthode de descente la plus raide. Par la suite, 500 ps de NVT (température de Berendsen couplée à un nombre de particules, un volume et une température constants) et 500 ps de NPT (pression de Parrinello-Rahman couplée à un nombre de particules, une pression et une température constants) ont été effectués pour maintenir la stabilité du système. (300K, 1 bar). Après avoir stabilisé toutes les propriétés thermodynamiques, le système moléculaire a été simulé pendant 100 ns avec un intervalle de temps de 2 fs, tandis que les coordonnées de tous les modèles ont été stockées toutes les 2 ps. Les écarts quadratiques moyens (RMSD) et les distances entre l'atome d'azote de la chaîne latérale K382 et l'atome de carbone central du FBP ont été évalués à l'aide des outils d'analyse de GROMACS 2019.6. Toutes les visualisations sont effectuées via les logiciels PyMOL et Xmgrace 2.3.7. Les fichiers de codes, les fichiers de paramètres d'entrée et les fichiers de configuration initiale et finale liés à deux systèmes de simulation MD (PykF-FBP et PykF K382la-FBP) sont fournis en tant que données sources de simulation MD.

Toutes les données nécessaires pour évaluer les conclusions de l'article sont présentes dans l'article et/ou les documents supplémentaires. Des données supplémentaires liées à cet article peuvent être demandées aux auteurs. Les données de protéomique MS ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) via le référentiel partenaire iProX avec l'identifiant de jeu de données PXD030345 et PXD030346. Les champs de force du ligand FBP ont été obtenus à partir de la base de données Automated Topology Builder (ATB) (Version 3.0) (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md). La structure cristalline suivante a été utilisée pour l'analyse PDB ID 1PKY. Les fichiers de codes, les fichiers de paramètres d'entrée et les fichiers de configuration initiale et finale liés à deux systèmes de simulation MD (PykF-FBP et PykF K382la-FBP) sont fournis en tant que données source de simulation MD. Les données sources sont fournies avec ce document.

Sabari, BR, Zhang, D., Allis, CD & Zhao, Y. Régulation métabolique de l'expression génique par acylations d'histones. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 18, 90-101 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Choudhary, C., Weinert, BT, Nishida, Y., Verdin, E. & Mann, M. Le paysage croissant de l'acétylation de la lysine relie le métabolisme et la signalisation cellulaire. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 15, 536–550 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ren, J., Sang, Y., Lu, J. & Yao, YF L'acétylation des protéines et son rôle dans la virulence bactérienne. Tendances Microbiol. 25, 768–779 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, R., Chen, P., Gu, J. & Deng, JY L'acétylation réduit la capacité de CheY à subir une autophosphorylation. Microbiol FEMS. Lett. 347, 70–76 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liang, W., Malhotra, A. & Deutscher, MP L'acétylation régule la stabilité d'une protéine bactérienne : modification dépendante du stade de croissance de la RNase R. Mol. Cellule 44, 160-166 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carabetta, VJ, Greco, TM, Cristea, IM & Dubnau, D. YfmK est une N(epsilon)-lysine acétyltransférase qui acétyle directement la protéine de type histone HBsu dans Bacillus subtilis. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 116, 3752–3757 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, H. et al. Identification systématique des protéines lysine 2-hydroxyisobutyrylées chez Proteus mirabilis. Mol. Protéine cellulaire. 17, 482–494 (2018).

Article CAS Google Scholar

Dong, H. et al. Dé-2-hydroxyisobutyrylation de la protéine lysine par CobB chez les procaryotes. Sci. Adv. 5, eaaw6703 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, H. et al. TmcA fonctionne comme une lysine 2-hydroxyisobutyryltransférase pour réguler la transcription. Nat. Chim. Biol. 18, 142–151 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zheng, Y. et al. Effets de la lysine 2-hydroxyisobutyrylation sur l'activité FabI bactérienne et la résistance au triclosan. Biochimie 182, 197-205 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zhang, D. et al. Régulation métabolique de l'expression des gènes par la lactylation des histones. Nature 574, 575–580 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irizarry-Caro, RA et al. L'adaptateur de signalisation TLR BCAP régule la transition inflammatoire vers les macrophages réparateurs en favorisant la lactylation des histones. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 117, 30628–30638 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dichtl, S. et al. Le lactate et l'IL6 définissent des voies séparables d'adaptation métabolique inflammatoire. Sci. Adv. 7, eabg3505 (2021).

Cui, H. et al. Les myofibroblastes pulmonaires favorisent l'activité profibrotique des macrophages par la lactylation des histones induite par le lactate. Suis. J. Respir. Cellule Mol. Biol. 64, 115-125 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, L. et al. Glis1 facilite l'induction de la pluripotence via une cascade de signalisation épigénome-métabolome-épigénome. Nat. Métab. 2, 882–892 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jiang, J. et al. Le lactate module le métabolisme cellulaire par l'expression génique médiée par la lactylation des histones dans le cancer du poumon non à petites cellules. Devant. Oncol. 11, 647559 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, J. et al. La lactylation des histones entraîne l'oncogenèse en facilitant l'expression de la protéine lecteur m(6)A YTHDF2 dans le mélanome oculaire. Génome Biol. 22, 85 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hagihara, H. et al. Lactylation des protéines induite par l'excitation neurale. Cell Rep. 37, 109820 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yang, K. et al. Le lactate favorise la lactylation, l'acétylation et la libération exosomale du macrophage HMGB1 dans la septicémie polymicrobienne. La mort cellulaire diffère. 29, 133-146 (2021).

Meng, X., Baine, JM, Yan, T. & Wang, S. Analyse complète de la lactylation de la lysine dans les grains de riz (Oryza sativa). J. Agric Food Chem. 69, 8287–8297 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gao, M., Zhang, N. et Liang, W. Analyse systématique de la lactylation de la lysine chez l'agent pathogène fongique végétal Botrytis cinerea. Devant. Microbiol. 11, 594743 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, S., Zhang, X. & Li, H. Au-delà de l'acétylation des histones, écrire et effacer les acylations des histones. Courant. Avis. Structure. Biol. 53, 169-177 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wang, M. & Lin, H. Comprendre la fonction des sirtuines de mammifères et l'acylation de la protéine lysine. Annu. Rév. Biochem. 90, 245-285 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Narita, T., Weinert, BT & Choudhary, C. Fonctions et mécanismes de l'acétylation des protéines non histones. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 20, 156-174 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Moreno-Yruela, C. et al. Les histone désacétylases de classe I (HDAC1-3) sont des histones lysine délactylases. Sci. Adv. 8, eabi6696 (2022).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dancy, BM & Cole, PA Acétylation de la protéine lysine par p300/CBP. Chim. Rév. 115, 2419–2452 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. KAT2A couplé au complexe α-KGDH agit comme une histone H3 succinyltransférase. Nature 552, 273-277 (2017).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sabari, BR et al. Le crotonyl-CoA intracellulaire stimule la transcription par la crotonylation des histones catalysée par p300. Mol. Cellule 58, 203-215 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rardin, MJ et al. SIRT5 régule le succinylome mitochondrial de la lysine et les réseaux métaboliques. Cellule Metab. 18, 920–933 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wei, W. et al. Les histones désacétylases de classe I sont des histones décrotonylases majeures : preuve de la fonction critique et large de la crotonylation des histones dans la transcription. Cell Res. 27, 898–915 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Christensen, DG et al. Mécanismes, détection et pertinence de l'acétylation des protéines chez les procaryotes. mBio. 10, e02708-18 (2019).

Christensen, DG et al. Identification de nouvelles protéines lysine acétyltransférases chez Escherichia coli. mBio. 9, e01905-18 (2018).

Starai, VJ, Celic, I., Cole, RN, Boeke, JD & Escalante-Semerena, JC Activation dépendante de Sir2 de l'acétyl-CoA synthétase par désacétylation de la lysine active. Sciences 298, 2390-2392 (2002).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Colak, G. et al. Identification des substrats de succinylation de la lysine et de l'enzyme régulatrice de la succinylation CobB chez Escherichia coli. Mol. Protéine cellulaire. 12, 3509–3520 (2013).

Article CAS Google Scholar

Frye, RA Classification phylogénétique des protéines procaryotes et eucaryotes de type Sir2. Biochimie. Biophys. Rés. Commun. 273, 793–798 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Weinert, BT et al. L'acétyl-phosphate est un déterminant essentiel de l'acétylation de la lysine chez E. coli. Mol. Cellule 51, 265-272 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Megraw, RE, Reeves, HC & Ajl, SJ Formation de lactyl-coenzyme A et de pyruvyl-coenzyme A à partir d'acide lactique par Escherichia coli. J. Bactériol. 90, 984–988 (1965).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prabhu, R., Altman, E. & Eiteman, MA Métabolisme du lactate et de l'acrylate par Megasphaera elsdenii dans des conditions discontinues et à l'état d'équilibre. Appl. Environ. Microbiol. 78, 8564–8570 (2012).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, JW & Trinh, CT Biosynthèse microbienne des esters de lactate. Biotechnol. Biocarburants 12, 226 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, X. et al. Criblage, expression, purification et caractérisation de CoA-transférases pour la génération de lactoyl-CoA. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 46, 899-909 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dyda, F., Klein, DC et Hickman, AB N-acétyltransférases liées à GCN5 : un aperçu structurel. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Structure. 29, 81-103 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goncheva, MI, Chin, D. & Heinrichs, DE Biosynthèse des nucléotides : la base de la pathogenèse bactérienne. Tendances Microbiol. 30, 793–804 (2022).

Sellés Vidal, L., Murray, JW & Heap, JT Pression évolutive sélective polyvalente utilisant un défaut synthétique dans le métabolisme universel. Nat. Commun. 12, 6859 (2021).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Q. et al. L'acétylation des enzymes métaboliques coordonne l'utilisation de la source de carbone et le flux métabolique. Sciences 327, 1004-1007 (2010).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monahan, LG, Hajduk, IV, Blaber, SP, Charles, IG & Harry, EJ Coordination de la division cellulaire bactérienne avec la disponibilité des nutriments : un rôle pour la glycolyse. mBio 5, e00935–00914 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Collins, RA, McNally, T., Fothergill-Gilmore, LA & Muirhead, H. Un mutant d'interface de sous-unité de la pyruvate kinase de levure nécessite l'activateur allostérique fructose 1,6-bisphosphate pour son activité. Biochimie. J. 310, 117–123 (1995).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siddiquee, KA, Arauzo-Bravo, MJ & Shimizu, K. Effet d'une mutation knock-out de la pyruvate kinase (gène pykF) sur le contrôle de l'expression génique et des flux métaboliques chez Escherichia coli. Microbiol FEMS. Lett. 235, 25-33 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mattevi, A. et al. Structure cristalline d'Escherichia coli pyruvate kinase de type I : bases moléculaires de la transition allostérique. Structure 3, 729–741 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Valentini, G. et al. La régulation allostérique de la pyruvate kinase. J. Biol. Chim. 275, 18145–18152 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Donovan, KA et al. Dynamique conformationnelle et allostérie dans la pyruvate kinase. J. Biol. Chim. 291, 9244–9256 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rabinowitz, JD & Enerback, S. Lactate : le vilain petit canard du métabolisme énergétique. Nat. Métab. 2, 566–571 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Certo, M., Tsai, CH, Pucino, V., Ho, PC et Mauro, C. Modulation du lactate des réponses immunitaires dans les microenvironnements inflammatoires versus tumoraux. Nat. Rév. Immunol. 21, 151-161 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, F. & Simon, MC Les cellules cancéreuses ne vivent pas seules : communication métabolique dans les microenvironnements tumoraux. Dév. Cellule 54, 183-195 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Teusink, B. & Smid, EJ Stratégies de modélisation pour l'exploitation industrielle des bactéries lactiques. Nat. Rév. Microbiol. 4, 46–56 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jiang, T., Gao, C., Ma, C. & Xu, P. Utilisation du lactate microbien : enzymes, pathogenèse et régulation. Tendances Microbiol. 22, 589-599 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Brown, AJ, Brown, GD, Netea, MG & Gow, NA Le métabolisme a un impact sur l'immunogénicité et la pathogénicité de Candida à plusieurs niveaux. Tendances Microbiol. 22, 614–622 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olive, AJ & Sassetti, CM Diaphonie métabolique entre l'hôte et l'agent pathogène : détection, adaptation et compétition. Nat. Rév. Microbiol. 14, 221-234 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Oliphant, K. & Allen-Vercoe, E. Métabolisme des macronutriments par le microbiome intestinal humain : principaux sous-produits de fermentation et leur impact sur la santé de l'hôte. Microbiome 7, 91 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Carabetta, VJ, Greco, TM, Cristea, IM & Dubnau, D. YfmK est une N-epsilon-lysine acétyltransférase qui acétyle directement la protéine de type histone HBsu dans Bacillus subtilis. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 116, 3752–3757 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parks, AR & Escalante-Semerena, JC Modulation de l'activité bactérienne CobB sirtuine désacylase par acétylation N-terminale. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 117, 15895–15901 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weinert, BT et al. Dynamique de l'acétylation et stoechiométrie chez Saccharomyces cerevisiae. Mol. Syst. Biol. 10, 716 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, X. et al. L'acétate fonctionne comme un métabolite épigénétique pour favoriser la synthèse des lipides sous hypoxie. Nat. Commun. 7, 11960 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, H., Kang, J., Qi, Q. & Chen, G. Production de lactate chez Escherichia coli par régulation redox génétiquement et physiologiquement. Appl. Biochimie. Biotechnol. 164, 162–169 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jeter, VL & Escalante-Semerena, JC L'acétylation réversible de la lysine dépendante de la sirtuine contrôle l'activité de l'acétyl coenzyme A synthétase chez Campylobacter jejuni. J. Bactériol. 203, e0033321 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Frey, AJ et al. La spectrométrie de masse haute résolution LC-quadripôle/Orbitrap permet la quantification simultanée résolue par les isotopes stables et le marquage isotopique ¹³C des thioesters d'acyl-coenzyme A. Anal. Bioanale. Chim. 408, 3651–3658 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varner, EL et al. Quantification du lactoyl-CoA (lactyl-CoA) par chromatographie liquide spectrométrie de masse dans les cellules et tissus de mammifères. Ouvrez Biol. 10, 200187 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, T. et al. clusterProfiler 4.0 : un outil d'enrichissement universel pour l'interprétation des données omiques. Innovation 2, 100141 (2021).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hara, N. et al. Élévation des niveaux de NAD cellulaire par l'acide nicotinique et implication de l'acide nicotinique phosphoribosyltransférase dans les cellules humaines. J. Biol. Chim. 282, 24574–24582 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hitosugi, T. et al. La phosphorylation de Tyr26 de PGAM1 offre un avantage métabolique aux tumeurs en stabilisant la conformation active. Nat. Commun. 4, 1790 (2013).

Article ADS PubMed Google Scholar

Dombrauckas, JD, Santarsiero, BD & Mesecar, AD Base structurelle de la régulation et de la catalyse allostériques de la pyruvate kinase tumorale M2. Biochimie 44, 9417–9429 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Nos. 22074103 to KZ, 21874100 to KZ, 22274114 to KZ, 32101023 to HD, 21904097 to GZ, and 22004091 to XB), Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2022A1515011810 à HD), la Fondation des sciences postdoctorales de Chine (n° 2021M702067 à HD), la Commission municipale des sciences et technologies de Tianjin (n° 19JCZDJC35000 à KZ et 19JCQNJC08900 à ST) et la subvention d'équipe innovante du ministère de l'Éducation du Guangdong (n° 2021KCXTD005 à EL).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Hanyang Dong, Jianji Zhang.

Centre d'innovation collaborative coparrainé par la province et le ministère pour l'épigénétique médicale, Laboratoire clé du microenvironnement et des maladies immunitaires (ministère de l'Éducation), Laboratoire clé d'épigénétique médicale de Tianjin, Département de biochimie et de biologie moléculaire, École des sciences médicales fondamentales, Université médicale de Tianjin , 300070, Tianjin, Chine

Hanyang Dong, Jianji Zhang, Hui Zhang, Yue Han, Chen Chen, Xiaoxia Tan, Siyu Wang, Xue Bai, Guijin Zhai, Shanshan Tian, ​​​​Tao Zhang et Kai Zhang

Laboratoire clé provincial des maladies infectieuses et d'immunopathologie moléculaire du Guangdong, Institut de pathologie oncologique, Collège médical de l'université de Shantou, 515041, Shantou, Guangdong, Chine

Hanyang Dong, Enmin Li et Liyan Xu

Collège des sciences de la vie, Université de Nankai, 300071, Tianjin, Chine

Congcong Lu

Jingjie PTM Biolab (Hangzhou) Co. Ltd, Hangzhou, 310018, Zhejiang, Chine

Zhongyi Cheng

Laboratoire clé de biologie moléculaire pour la région côtière de Chaoshan à incidence élevée de cancer, Département de biochimie et de biologie moléculaire, Shantou University Medical College, 515041, Shantou, Guangdong, Chine

Enmin Li

Tianjin Key Laboratory of Retinal Functions and Diseases, Eye Institute and School of Optometry, Tianjin Medical University Eye Hospital, Tianjin Medical University, 300070, Tianjin, Chine

Kai Zhang

Tianjin Key Laboratory of Digestive Diseases, Department of Gastroenterology and Hepatology, Medical University General Hospital, Tianjin Medical University, 300070, Tianjin, Chine

Kai Zhang

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Expériences supervisées par KZ et LX. HD et KZ ont conçu des expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. HD et JZ ont effectué une culture cellulaire, un dosage enzymatique, une étude métabolomique et une analyse de biologie moléculaire. HD, JZ, CL, HZ et XB ont effectué l'étude protéomique et l'analyse par spectrométrie de masse. GZ et CC ont préparé des réactifs pour l'étude des fonctions des protéines. HD, JZ, YH, XT, SW, ST, ZC, TZ, EL, LX et KZ ont effectué la collecte, l'analyse et l'interprétation des données. Tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit.

Correspondance à Liyan Xu ou Kai Zhang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

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Réimpressions et autorisations

Dong, H., Zhang, J., Zhang, H. et al. YiaC et CobB régulent la lactylation de la lysine chez Escherichia coli. Nat Commun 13, 6628 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

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Reçu : 13 janvier 2022

Accepté : 20 octobre 2022

Publié: 04 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

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