Utilisation du monolithe

Jun 14, 2023

Figure 1:Chromatogramme issu de l'analyse d'une réaction IVT à l'aide d'une colonne de chromatographie monolithique CIMac PrimaS.

La transcription in vitro (IVT) est une étape critique dans la production d'ARN messager (ARNm). Dans un webinaire de mars 2022, Rok Sekirnik (responsable du développement de processus pour les applications d'ARNm et d'ADN plasmidique (pDNA) chez BIA Separations, qui fait partie de Sartorius) a expliqué que l'optimisation des concentrations de réactifs utilisés pendant l'IVT aide à maximiser la quantité d'ARNm produite. Les développeurs de médicaments ont un grand besoin de méthodes analytiques capables de mesurer l'IVT en temps réel. Sekirnik a montré comment les colonnes de chromatographie monolithique CIMac PrimaS permettent l'analyse en ligne de l'IVT, y compris la surveillance de la concentration des nucléosides triphosphates (NTP), des réactifs de coiffage et des plasmides.

La présentation Sekirnik a noté qu'une molécule d'ARNm de 4 000 nucléotides telle que celle présentée dans les vaccins à ARNm contre le SRAS-CoV-2 est d'environ 1,3 MDa - environ 10 fois plus grande qu'un anticorps IgG standard. L'ARN messager porte également une charge négative et devient hydrophobe lorsqu'il est exposé à de fortes concentrations de sel. Pour permettre la traduction des protéines, il doit avoir une coiffe en 5 'et une queue polyadénylée (poly-A). Les queues poly-A peuvent être codées dans la matrice d'ADN utilisée pour la transcription ou ajoutées par voie enzymatique après IVT. De même, des bouchons 5 'peuvent être ajoutés pendant ou après IVT.

Compte tenu de ces propriétés, les développeurs de médicaments ont besoin de méthodes analytiques capables de mesurer le rendement en ARNm et l'efficacité du coiffage en temps réel. La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est utile pour de telles évaluations, mais les analystes doivent sélectionner un milieu de séparation qui fournit une chimie de liaison appropriée, une surface suffisamment grande pour l'ARNm et une capacité d'analyses rapides. Dans les milieux à base de billes contenant des particules poreuses, la diffusion limite le transfert de masse, nécessitant de longs temps d'analyse et limitant le potentiel d'évaluation en ligne. Les perles génèrent également un flux à contre-courant, produisant une contrainte de cisaillement qui diminue la récupération.

Les colonnes monolithes CIMac PrimaS reposent sur le transport convectif de masse à travers une phase stationnaire en polyméthacrylate. La séparation est basée sur des interactions multimodales d'échange d'anions et de liaisons hydrogène. Le flux laminaire à travers la colonne minimise les contraintes de cisaillement. Par rapport aux particules poreuses, les microcanaux offrent une surface beaucoup plus grande pour la liaison de l'ARNm. Parce que les canaux manquent de pores sans issue, leur capacité de liaison et leur résolution restent les mêmes quel que soit le débit.

Cette fonctionnalité permet aux analystes de traiter les échantillons assez rapidement pour évaluer l'IVT en temps réel sans diminuer la résolution. Sekirnik a noté qu'un test peut séparer et quantifier l'ARNm, l'ADNp, les réactifs de coiffage et les NTP distincts (Figure 1). Les résultats sont générés en moins de trois minutes.

De telles capacités permettent de surveiller et de contrôler la cinétique de production d'ARNm, y compris l'efficacité du coiffage en 5'. Sekirnik a expliqué que si une exonucléase qui dégrade sélectivement l'ARNm non coiffé est utilisée, alors un échantillon peut être analysé pour la concentration d'ARNm, traité par voie enzymatique et analysé à nouveau pour quantifier les molécules non digérées. La comparaison des valeurs de concentration avant et après le traitement révélera l'efficacité de coiffage d'une réaction IVT. Les analystes peuvent ajuster les régimes d'alimentation et les concentrations de réactifs en conséquence pour optimiser le coiffage et le rendement de l'ARNm.

Sekirnik a démontré cette possibilité en utilisant les données d'un processus IVT fed-batch. Sartorius a initié l'IVT avec un rapport de 1: 4 de guanosine triphosphate (GTP) à l'analogue de capuchon anti-inverse (ARCA). Une heure après le début du processus, l'efficacité du bouchage était élevée (80 %), mais le rendement était faible. L'équipe a ensuite utilisé une stratégie d'alimentation pour ajuster les niveaux de NTP tout au long de la réaction tout en maintenant le rapport GTP:ARCA. De tels changements ont sextuplé le rendement (à 11,7 mg/mL) sans diminuer l'efficacité du bouchage (80 %) ou la qualité du produit.

En utilisant un tel flux de travail, les analystes peuvent obtenir rapidement des informations sur l'efficacité et le rendement du plafonnement. Le logiciel Sartorius PATfix comprend des séquences analytiques préchargées et des outils pour faciliter la surveillance des processus. La société propose également des colonnes monolithes avec d'autres chimies de liaison pour fournir de multiples outils pour la fabrication d'ARNm et l'analyse des processus.

Questions et réponses Les colonnes CIMac PrimaS peuvent-elles être utilisées dans les systèmes HPLC avec pompes quaternaires ? Les colonnes analytiques CIMac peuvent être utilisées avec les systèmes HPLC ; les pompes quaternaires sont privilégiées.

Les colonnes peuvent-elles caractériser la polyadénylation de l'ARNm ?Les colonnes CIMac Oligo dT peuvent être utilisées pour quantifier la teneur en ARNm polyadénylés.

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