β fongique

Mar 14, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 576 (2023) Citer cet article

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Le microbiote intestinal humain (HGM) est composé d'un réseau très complexe de micro-organismes, qui interagissent avec l'hôte, ce qui a un impact sur la santé et le bien-être de l'hôte. Le β-glucane a été établi comme un polysaccharide alimentaire favorisant la croissance de bactéries particulières associées à l'intestin, y compris les membres des genres Bacteroides et Bifidobacterium, ces derniers étant considérés comme représentant des bactéries bénéfiques ou probiotiques. Cependant, le mécanisme exact qui sous-tend le métabolisme des β-glucanes par les commensaux intestinaux n'est pas entièrement compris. Nous montrons que la mycoprotéine représente une excellente source de β-glucane, qui est consommée par certaines espèces de Bacteroides comme dégradeurs primaires, comme Bacteroides cellulosilyticus WH2. Cette dernière bactérie utilise deux enzymes extracellulaires à action endo, appartenant aux familles de glycoside hydrolases 30 et 157, pour dégrader le β-glucane dérivé de la mycoprotéine, libérant ainsi des oligosaccharides dans le milieu de croissance. Ces oligosaccharides libérés peuvent à leur tour être utilisés par d'autres microbes intestinaux, tels que Bifidobacterium et Lactiplantibacillus, qui agissent ainsi comme dégradeurs secondaires. Nous avons utilisé une approche d'alimentation croisée pour suivre la façon dont les deux espèces sont capables de se développer en co-culture.

Le microbiote intestinal humain (HGM) est un écosystème complexe de microbes censés avoir un impact bénéfique sur la santé humaine. Les glucides alimentaires représentent la principale source d'énergie pour le corps humain, même si nous n'avons pas les capacités enzymatiques pour dégrader nous-mêmes la plupart de ces glycanes1. Cependant, le HGM code pour un arsenal d'enzymes actives glucidiques (CAZYmes) capables de cataboliser ces glucides1. Les produits finaux métaboliques de la fermentation des glycanes par le HGM sont principalement des SCFA, tels que le propionate, l'acétate et le butyrate, qui ont une variété d'effets bénéfiques sur l'hôte humain. Le déséquilibre dans la composition de la communauté microbienne intestinale, parfois appelé dysbiose, est une caractéristique des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), du cancer colorectal, de l'obésité, des infections à Clostridioides difficile et, potentiellement, d'un large éventail d'autres affections2,3,4.

Comme indiqué ci-dessus, le HGM est un réseau complexe de microbes représentant environ 10 000 milliards de bactéries5. Néanmoins, seuls deux phyla sont dominants dans cette communauté bactérienne complexe, à savoir Bacteroidota et Bacillota, complétés par des représentants de plusieurs phylums mineurs, tels que Actinomycetota ou Verrucomicrobiota. Il a été démontré que divers membres du genre Bacteroides contiennent des groupes spécifiques de gènes co-régulés qui métabolisent un glycane spécifique, et qui sont appelés Polysaccharide Utilization Loci (singulier : PUL, pluriel : PUL). Un PUL donné contient les gènes nécessaires pour détecter, transporter et dégrader un glycane particulier6,7,8. Par exemple, le génome de Bacteroides thetaiotaomicron (Ba. thetaiotaomicron VPI-5482, BT) abrite 96 PUL différents, selon la base de données CAZY9,10, tandis qu'une autre espèce de Bacteroides, Ba. ovatus ATCC8483 (Bacova), comprend 115 PUL différents. Généralement, une glycoside hydrolase (GH) ou une polysaccharide lyase (PL) associée à la surface cellulaire initie la dégradation extracellulaire des polysaccharides permettant la libération des oligosaccharides résultants dans le milieu de croissance11,12,13,14,15,16,17.

Les membres du genre Bifidobacterium sont particulièrement abondants chez les nourrissons nés à terme et allaités, chez lesquels on pense qu'ils exercent d'importants effets bénéfiques18,19,20,21. La dominance de ces bactéries dans cette niche est attribuée, au moins en partie, à leur capacité à métaboliser (en particulier) les oligosaccharides du lait maternel (HMO) comme seule source de carbone et d'énergie22. Différentes espèces de bifidobactéries ont des préférences particulières de consommation de HMO, par exemple des souches de Bi. brève et Bi. longum sont connus pour internaliser et métaboliser le lacto-N-tétraose23,24,25,26, tandis que Bi. catenulatum subsp. kashiwanohense peut utiliser le 2-fucosyllactose comme source de carbone19,27. La souche prototype Bi. il a été démontré que breve UCC2003 métabolise plusieurs HMO et autres poly/oligosaccharides alimentaires, soit par lui-même23,28, soit par alimentation croisée impliquant d'autres membres du microbiote intestinal ; des exemples de tels substrats saccharidiques sont la mucine29,30, l'arabinogalactane/galactane31,32 et le sialyllactose20.

Le β-glucane est un glycane complexe qui a été exploré comme prébiotique potentiel et qui est particulièrement abondant dans les céréales et les parois cellulaires fongiques13,33,34,35,36. Le β-glucane dérivé de céréales, avec une liaison mixte β-1,3/1,4 définie (Fig. 1A), a été utilisé pour comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels certaines espèces de Bacteroides sont capables de détecter, d'intérioriser et de dégrader ce polymère13,34,35,36. Par exemple, Bacova utilise un PUL avec une glycoside hydrolase 16 (GH16) associée à la surface cellulaire et un GH3 périplasmique pour catalyser la dégradation de ce β-glucane de céréale à liaison mixte34,35,36.

A Structures de fongiques (mycoprotéine), de levure, de laminarine, d'orge et de β-glucane pustulan. B Croissance Bacteroides ovatus, DSM, WH2 et BT sur la mycoprotéine mesurée sur un lecteur de plaque. Toutes les croissances ont été produites en 3 répétitions indépendantes différentes (n = 3). C Nombre de protéines exprimées par Baccell WH2 lors de l'utilisation du β-glucane de Mycoprotein tel qu'identifié par l'analyse du protéome. Les protéomiques ont été produites en 3 répétitions indépendantes différentes (n = 3). Structure D GUL dans Baccell WH2 (GUL-1 et GUL-2) et BT agissant sur la mycoprotéine, la levure et le pustulan.

De plus, un Ba. uniformis ATCC8492 PUL, qui est impliqué dans le métabolisme des β-1,3-glucanes apparentés présents dans la levure et la laminarine glucane d'algue (Fig. 1A), est responsable de la dégradation initiale à la surface cellulaire par une glycoside hydrolase 16 (GH16 ) et un GH158, et un GH313 périplasmique agissant ultérieurement. De plus, Ba. uniformis JCM13288 peut dégrader les β-glucanes de la laminarine, du pustulan et du porphyran, en utilisant deux PUL codant pour un GH16, GH30, GH158 et GH3, et en partageant des oligosaccharides avec d'autres membres du microbiote intestinal, favorisant éventuellement l'homéostasie intestinale37.

Un autre type de β-1,6-glucane, qui se trouve sous forme de glucane linéaire dans le lichen Lasallia pustulata et de glucane linéaire mais réticulé avec d'autres composants de la paroi cellulaire dans la levure Saccharomyces cerevisiae ou dans le champignon amandier (Agaricus blazei), est utilisé par BT via un PUL impliquant uniquement un GH30_3 situé en surface et un GH317,33 périplasmique. On sait peu de choses sur la dégradation du β-glucane fongique, tel que celui dérivé de la mycoprotéine produite par Fusarium venenatum, un champignon utilisé par Quorn® comme ingrédient alimentaire fonctionnel38. La structure chimique de ce β-glucane est constituée d'un squelette linéaire de β-1,3-glucane portant des chaînes latérales de β-1,6-glucanes, ce qui le distingue du β-glucane de céréales, ou du β-glucane/laminarine de levure, où la chaîne principale ou les liaisons de la chaîne latérale sont différentes, respectivement 13, 34, 39 (Fig. 1A).

Actuellement, il n'y a que quelques publications décrivant les avantages pour la santé induits par Bacteroidota (en fait, certaines espèces sont considérées comme des agents pathogènes opportunistes)40,41. Cependant, on peut affirmer que certaines espèces de Bacteroides représentent des dégradeurs primaires de glycanes qui permettent l'alimentation croisée des glucides par d'autres membres bénéfiques du microbiote, tels que les bifidobactéries (qui ne sont pas connues pour être capables de métaboliser directement le β-glucane). De telles interactions métaboliques se produisent entre BT et Bi. longum, et entre Ba. cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSMZ) et Bi. breve UCC2003 lorsqu'il est cultivé sur la protéine de mélèze arabinogalactane (AGP) comme seule source de carbone31,42,43. D'autres interactions trophiques ont été établies entre différentes espèces de Bacteroides et Bifidobacterium39,44,45,46,47,48, mais restent à définir pour la mycoprotéine β-glucane.

Dans la présente étude, nous avons effectué une caractérisation moléculaire de la dégradation des mycoprotéines et des β-glucanes de levure par Bacova, Ba. cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) et BT, mettant en évidence l'architecture PUL de ces Bacteroides spp. De plus, nous avons découvert des interactions d'alimentation croisée entre les Bacteroides, en tant que dégradeurs primaires, et certaines espèces de Bifidobacterium et de Lactiplantibacillus, agissant comme dégradeurs secondaires du β-glucane fongique dérivé des mycoprotéines.

Certains membres du genre Bacteroides ont été établis comme fermenteurs généralistes de liaison mixte (orge) et β-glucane de levure13,34,35,36,37. Les génomes de ces espèces de Bacteroides englobent divers PUL (appelés ici locus d'utilisation des glucanes ou GUL) pour dégrader ce glycane complexe, en utilisant des glycosides hydrolases codés pour ce processus métabolique. Pour évaluer la capacité des espèces de Bacteroides à utiliser le β-glucane dérivé de champignons, nous avons extrait ce polysaccharide de la mycoprotéine de Fusarium venenatum (voir "Matériel et méthodes") et avons criblé les 23 espèces de Bacteroidetes les plus importantes associées à l'intestin pour leur capacité à se développer. sur ce glycane ainsi que sur le β-glucane issu de levure (tableau S1). Dans les conditions (anaérobies) utilisées, Ba. xylanisolvens, Ba. intestinalis, Bacova, Ba. fragilis, Ba. finegoldii, Ba. vulgatus, Ba. uniformis, BT (croissance partielle), Dysgonomonas gadei, D. mossii et deux souches de Baccell (Baccell WH2 et Baccell DSMZ) métabolisent le β-glucane dérivé de la mycoprotéine. De plus, Ba. vulgatus, Ba. uniformis, Bacova, BT, Dysgonomonas gadei, D. mossii et les deux souches Baccell ont pu utiliser le β-glucane de levure. Il a déjà été démontré que Bacova se développe également dans le β-glucane dérivé de l'orge34,35, ce qui montre la grande capacité de cette espèce à fermenter des β-glucanes provenant de différentes sources et structures chimiques (Fig. 1A). La figure 1B montre le profil de croissance de Baccell WH2, Baccell DSMZ, BT et Bacova sur le β-glucane de la mycoprotéine (Fig. 1B). En plus de ces expériences de croissance, nous avons évalué la croissance de diverses souches de Bifidobacterium sur du β-glucane dérivé de mycoprotéine, montrant clairement le manque de capacité de ces souches à utiliser cette source de carbone complexe (Fig. S1A).

Pour caractériser davantage la croissance de souches sélectionnées de Bacteroides sur des β-glucanes particuliers, nous avons effectué une analyse protéomique sur Baccell WH2 lorsqu'il est cultivé sur du glucose (agissant comme référence) ou du β-glucane fongique dérivé de mycoprotéines comme sources de carbone. Nous avons comparé les données générées sur le protéome de cette bactérie lorsqu'elle est cultivée sur l'une de ces sources de carbone pour identifier les protéines qui présentent une expression accrue lorsque la souche est cultivée sur le polymère complexe. Comme le montre la Fig. 1C, cette analyse a révélé que toutes les protéines codées par deux GUL attribuées (nommées ici GUL-1 et GUL-2 et représentant les étiquettes de locus BcellWH2_01929-BcellWH2_01932 et BcellWH2_02537-BcellWH2_02542, respectivement, voir Fig. 1D) expression lorsque Baccell WH2 a été cultivé sur le métabolisme des β-glucanes fongiques dérivés de mycoprotéines (par rapport à la croissance sur glucose). Il a été prédit que GUL-1 code deux enzymes GH3 (BcellWH2_01926 et BcellWH2_01927) et un membre GH157 (BcellWH2_01931), tandis que les protéines codées par les balises de locus BcellWH2_01928 et BcellWH2_01929 représentent la paire de type SusC/D supposée être impliquée dans le substrat (polysaccharide) liaison et reconnaissance à la surface de la cellule bactérienne (Fig. 1D). De plus, BcellWH2_01932 devrait représenter le système de détection du système hybride à deux composants (HTCS) contrôlant la régulation transcriptionnelle de GUL-1. GUL-2 code pour une GH30_3 (BcellWH2_02537, une endo-β-1,6-glucanase prédite selon la base de données CAZY), une GH2 (BcellWH2_02541) et une protéine sans fonction connue (BcellWH2_02538). En plus de ces protéines, BcellWH2_02539 et BcellWH2_02540 représentent la paire SusC/D prédite dans GUL2 (Fig. 1D). Pour confirmer les données protéomiques, nous avons cultivé Baccell WH2 jusqu'à mi-exponentiel et effectué une RT-qPCR sur des paires SusC/D sélectionnées identifiées dans les GUL décrites ci-dessus (Fig. S1B). De plus, nous avons également utilisé cette approche avec BT et Bacova sur les paires SusC / D identifiées sur la base de modèles d'expression différentiels lorsque ces deux souches avaient été cultivées sur du bêta-glucane de pustulan17, 34, 35 (Fig. S1B). Puisque nous avons observé une expression différentielle basée sur la RT-qPCR, il semble que leurs GUL correspondantes, qui sont substantiellement différentes de celle de Baccell WH2 en termes de structure génétique et de contenu, soient également responsables de la croissance sur le β-glucane fongique. Les figures 1D et S1C montrent l'architecture GUL de BT, Bacova et Baccell WH2, et les fonctions prédites relatives à la régulation GUL, à la dégradation des β-glucanes et à l'apport d'oligosaccharides associé. BT et Baccell WH2 utilisent une architecture GUL différente pour l'utilisation du β-glucane fongique (Fig. 1D), par rapport à Bacova, qui, sur la base de son profil d'expression, semble utiliser le même GUL pour les β-glucanes fongiques et d'orge. S1B et S1C.

Comme indiqué ci-dessus, BT, Baccell WH2 et Bacova peuvent métaboliser le β-glucane fongique. D'après la qPCR réalisée sur BT en croissance dans un milieu contenant soit du β-glucane fongique, soit du pustulan, cette bactérie semble utiliser la même LMG pour l'une ou l'autre de ces deux sources de carbone17 (BT3309-BT3314, Fig. 1D et S1B). Selon les données qPCR obtenues lorsque Bacova se développe dans un milieu additionné d'orge ou de β-glucane fongique (Fig. S1B), il a été démontré que la bactérie utilise le même GUL pour l'une ou l'autre de ces sources de carbone, ce qui contraste avec ce que nous avons découvert pour Baccell WH2, car cette bactérie semble utiliser des GUL distinctes pour déconstruire le β-glucane fongique ou d'orge (Fig. 1D et S1C)49.

Suite à notre observation que certaines protéines codées par, et leurs gènes correspondants présents dans, GUL-1 et GUL-2 de Baccell WH2 suscitent une expression accrue lors de la croissance sur du β-glucane fongique, nous avons voulu confirmer leur implication dans ce processus métabolique. À cette fin, nous avons exprimé par recombinaison les enzymes représentant les activités putatives GH157, GH30_3 et GH3 (Baccell WH2_01926) de GUL1/GUL2 pour disséquer complètement le mécanisme de dégradation de cette source de carbone alimentaire complexe. À cette fin, nous avons incubé les protéines exprimées avec du β-glucane fongique et révélé d'éventuels produits de dégradation au moyen d'une chromatographie HPLC. Plus précisément, la figure 2A montre les chromatogrammes HPLC de BcellWH2_01931 et BcellWH2_02537 (représentant respectivement les activités prédites de GH157 et GH30_3) agissant sur le β-glucane fongique.

Toutes les expériences HPLC ont été produites dans 3 répétitions indépendantes différentes (n = 3). Une évolution temporelle de BcellWH2_01931 (GH157) avec la mycoprotéine β-glucane. B Évolution dans le temps de BcellWH2_01931 (GH157) avec β-1,3-glucane linéaire. C Évolution dans le temps de BcellWH2_02537 (GH30_3) sur la mycoprotéine β-glucane. D Évolution dans le temps de BcellWH2_02537 (GH30_3) avec pustulan. E Évolution temporelle de BcellWH2_01931 (GH157) et BcellWH2_02537 (GH30_3) ensemble sur le β-1,3-glucane linéaire. HPLC F de BT3312 (GH30_3) sur la mycoprotéine β-glucane. G HPLC de BT3314 (GH3) sur la mycoprotéine β-glucane.

Les données présentées dans les Fig. 2A et 2B ont confirmé que BcellWH2_01931 agit sur le β-glucane fongique (Fig. 2A) et le β-1,3-glucane linéaire d'Euglena glacialis (Fig. 2B) libérant initialement des penta- et trisaccharides, qui sont convertis en disaccharides et en glucose lors d'une incubation plus longue (16 h). Cependant, nous n'avons trouvé aucune activité lorsque l'enzyme a été incubée avec du pustulan. Le tableau 1 répertorie les paramètres cinétiques (kcat/Km) de cette protéine agissant sur l'un ou l'autre substrat.

Pour valider la prédiction selon laquelle ces enzymes sont impliquées dans le métabolisme des β-glucanes fongiques, nous avons effectué une analyse de localisation des protéines par LipoP50, indiquant que BcellWH2_01931 (GH157) et BcellWH2_02537 (GH30_3) sont situés à la surface cellulaire de Baccell WH2. De plus, selon la base de données CAZY, l'enzyme GH157 devait agir comme une endo-β-1,3-glucanase, tandis que l'enzyme GH30_3 devait posséder une activité endo-β-1,6-glucanase comme cela a été rapporté pour autres membres de cette famille CAZY17. Comme GH157, GH30_3 exprimé et purifié par recombinaison a été incubé avec du β-glucane fongique, du β-1,3-glucane linéaire et du pustulan (β-1,6-glucane linéaire), suivi d'une analyse HPLC. Les figures 2C et 2D montrent les résultats de chromatographie associés pour cette expérience d'incubation, confirmant l'activité β-1,6-glucanase avec le β-glucane fongique (Fig. 2C) et le pustulan (Fig. 2D). De plus, GH30_3 n'a montré aucune activité contre le β-1,3-glucane linéaire. Le tableau 1 présente les paramètres catalytiques de cette protéine tels que mesurés par des dosages DNSA avec du β-glucane fongique et du pustulan. BcellWH2_02537 a montré des paramètres d'activité pour le β-glucane de Fusarium venenatum similaires à ceux obtenus pour le pustulan (kcat/Km de 2512 ± 28 et 1968 ± 17 mg ml−1 min−1) suggérant que l'enzyme ne nécessite pas d'interactions avec le β- squelette (1,3)-glucane. De plus, il a été démontré que BcellWH2_02537 ne présente une activité que sur les oligosaccharides plus grands que le β-(1,6)-glucotriose indiquant que, comme dans BT3312, l'enzyme a 3 sous-sites dans le site actif (nomenclature établie par Davies et al.)51.

Enfin, pour bien comprendre comment le β-glucane dérivé de la mycoprotéine est métabolisé par Baccell WH2, nous avons exprimé de manière recombinante les enzymes GH3 et GH2 prédites (comme spécifié par BcellWH2_01926 et BcellWH2_02541, respectivement), montrant que les deux sont capables d'agir sur les différents oligosaccharides produits. par l'action des enzymes GH157 et GH30_3. BcellWH2_01926 (GH3) était capable de dégrader les β-1,6-glucooligosaccharides libérés par GH30_3, tandis que l'enzyme GH2 (BcellWH2_02541) agissait sur les β-1,3-glucooligosaccharides (glucobiose et glucotriose), libérant dans les deux cas du glucose sous forme de le produit final, qui confirme le mécanisme exo-actif de ces enzymes (BcellWH2_01926 et BcellWH2_02541). Le tableau 1 présente également les paramètres catalytiques de ces deux exo-glucosidases, ce qui met en évidence que l'activité de l'enzyme GH2 est similaire pour le β-1,3-glucobiose et le β-1,3-glucotriose, suggérant 2 sous-sites dans le site actif.

Dans le cas de BT, l'architecture GUL est plus simple que celle observée pour Baccell WH2 (Fig. 1D). Pour la première bactérie, seuls le GH30_3 (BT3312) et un GH3 (BT3314) ont été précédemment décrits comme actifs sur le pustulan β-glucan17. Pour évaluer l'activité catalytique de BT3312 sur le β-glucane de Fusarium venenatum, nous avons réalisé des dosages enzymatiques avec ce polysaccharide obtenant des niveaux d'activité similaires à ceux de BcellWH2_02537 (2874 ± 35 mg ml−1 min−1 pour BT3312 et 2512 ± 28 mg ml-1 min-1 pour BcellWH2_02537) (Tableau 1). L'enzyme BT3312 s'est avérée active sur les chaînes latérales β-glucanes fongiques, libérant ainsi des β-1,6-oligosaccharides particuliers, qui à leur tour peuvent être hydrolysés par BT3314 en tant qu'exo-glucosidase pour libérer du glucose (Fig. 2F pour BT3312, et figure 2G pour BT3314). De la même manière que pour les enzymes Baccell WH2, le tableau 1 montre les paramètres catalytiques pour BT3312 et BT3314 sur ces substrats.

Pour disséquer les interactions des enzymes GH157 et GH30_3 codées par Baccell WH2 avec le β-glucane fongique, nous avons tenté d'obtenir des cristaux des protéines Baccell WH2. Malheureusement, malgré le dépistage de plusieurs conditions, nous n'avons pas pu obtenir de cristaux appropriés. Au lieu de cela, nous avons obtenu la structure de la protéine GH30_3 par comparaison avec la structure cristalline résolue pour BT3312 en utilisant l'algorithme Phyre2 comme plateforme de recherche17,52. La figure S1D montre que la structure prédite est un tonneau (β/a)8 avec le mécanisme de rétention conservé où deux acides glutamiques agissent comme nucléophile (E339 et E347 pour BT3312 et BcellWH2_02537, respectivement) et acide/base (E238 et E247 pour BT3312 et BcellWH2_02537, respectivement). Comme indiqué sur cette figure, les deux protéines présentent un niveau élevé de similarité de séquence (identique à 58,33 %) et présentent le même profil d'activité (tableau 1). Cela indique que le GH30_3 de Baccell WH2 ne contient que trois sous-sites principaux d'une manière similaire à ce qui a été décrit pour BT331217. Les acides aminés impliqués dans la liaison et la catalyse sont conservés dans les deux protéines (Fig. S1E).

Pour déterminer si Baccell WH2 et BT libèrent des oligosaccharides dans leur milieu de culture lorsqu'ils sont cultivés sur du β-glucane fongique, permettant ainsi peut-être la croissance d'autres bactéries par le biais d'activités d'alimentation croisée, nous avons obtenu un milieu de croissance sans cellule après la culture de ces souches jusqu'à la mi-exponentielle. et phase stationnaire (Fig. 3). La présence d'oligosaccharides libérés dans le milieu par Baccell WH2 ou BT a ensuite été évaluée par HPLC (Fig. 3A, B). Lorsque ces deux espèces bactériennes utilisent la mycoprotéine comme seule source de carbone (Fig. 3A), il a été démontré qu'elles libèrent des oligosaccharides dans le milieu, mais ceux-ci étaient différents dans chaque cas (Fig. 3B), ce qui est cohérent avec leur architecture GUL différente et enzymes associées, confirmant ainsi la stratégie de dégradation distincte suivie par chacune de ces deux espèces.

Un chromatogramme HPLC du milieu de croissance de Baccell WH2 sur du β-glucane fongique. B Identique au panneau A avec BT. C Oligosaccharide purifié de Baccell WH2 après colonne de filtration sur gel (GF). D Oligosaccharide purifié de BT après colonne GF. E LC/MS du surnageant Baccell WH2 cultivé sur β-glucane fongique. F LC/MS du surnageant BT cultivé sur β-glucane fongique. Toutes les expériences HPLC et LC/MS ont été réalisées dans 3 répétitions indépendantes différentes (n = 3).

Pour étudier la nature de ces oligosaccharides, nous avons effectué une LC/MS pour déterminer leur masse. La figure 3C montre le profil HPLC de l'oligosaccharide principal purifié libéré par Baccell WH2 et la figure 3E le spectre de masse associé de cet oligosaccharide confirmant que cette bactérie libère majoritairement un heptasaccharide. Ces résultats sont en concordance avec la digestion enzymatique in vitro du β-glucane fongique car lorsque nous avons incubé cette source de carbone fongique avec GH30_3 et GH157 ensemble, les produits générés par les deux enzymes étaient le glucose, le 1,6-β-glucobiose 1,3- Le β-glucotétraose et l'heptasaccharide présents dans le milieu de croissance généré par Baccell WH2 (Fig. 2E). La figure 3F affiche les spectres de masse des principaux oligosaccharides libérés par BT dans le milieu de croissance, confirmant la présence d'un disaccharide comme produit principal, correspondant au 1,6-β-glucobiose comme indiqué dans le chromatogramme HPLC (Fig. 3D) .

Après avoir confirmé la libération d'oligosaccharides dans le milieu de croissance par les Bacteroides lorsqu'ils sont cultivés sur la mycoprotéine β-glucane, nous avons émis l'hypothèse que ce phénomène permettrait à d'autres commensaux intestinaux de se nourrir de ces oligosaccharides libérés.

En effet, la figure 4 montre que les souches de Bifidobacterium sont capables de se développer lorsqu'elles sont co-cultivées avec des Bacteroides sur du β-glucane fongique. Nous avons criblé le surnageant d'une nuit de Baccell WH2 et BT cultivés dans du β-glucane avec plusieurs souches disponibles de Bifidobacterium et de Lactobacillus montrant que, dans le cas du surnageant de Baccell WH2, Bi. brève UCC2003, Bi. subsp. longum NCIMB 8809 et Lb. plantarum WCFS1 sont incapables d'utiliser le β-glucane intact comme source de carbone, mais ils peuvent utiliser l'heptasaccharide libéré par Baccell WH2 (Fig. 4A). Nous avons confirmé la capacité de ces souches à utiliser l'heptasaccharide en testant les milieux de croissance avant et après le Bi. brève UCC2003, Bi. subsp. longum NCIMB 8809 et Lb. croissance plantaire de WCFS1. La figure 4B confirme l'utilisation de l'heptasaccharide par Bi. subsp. longum NCIMB 8809, avec Bi. brève UCC2003 et Lb. plantarum WCFS1 présentant une capacité plus modeste à utiliser également l'oligosaccharide libéré. Après 24 h de fermentation, Bi. subsp. longum NCIMB 8809 a atteint une densité optique finale de 0,8 lors de l'utilisation du surnageant de Baccell WH2. Bi. brève et Lb. plantarum ont pu utiliser ces oligosaccharides mais à un degré moindre, atteignant une densité optique finale de 0,6.

A Croissance de Bifidobacterium avec un surnageant de β-glucane fongique de Baccell WH2. B Analyse HPLC des surnageants avant et après croissance de Bifidobacterium longum subsp. longum sur les surnageants de Baccell WH2. C Croissance de Bifidobacterium avec un surnageant de β-glucane fongique de BT. D Analyse HPLC des surnageants avant et après la croissance de Bifidobacterium longum subspecie longum sur un surnageant acellulaire de BT cultivé sur du β-glucane fongique. E Analyse HPLC des surnageants avant et après croissance de Bi breve UCC2003 et L. plantarum sur des surnageants acellulaires de BT cultivés sur du β-glucane fongique. Toutes les croissances et les expériences HPLC ont été réalisées en 3 répétitions indépendantes différentes (n = 3).

Lorsque le surnageant de BT a été utilisé comme source de carbone pour le criblage de Bi. brève UCC2003, Bi. subsp. longum NCIMB 8809 et Lb. plantarum WCFS1, le disaccharide qui s'accumule autrement dans le milieu n'est plus présent, ce qui indique que ce β-1,6-glucobiose est utilisé par les souches bifidobactériennes et Lactiplantibacillus pour soutenir leur croissance (Fig. 4C, D). L'analyse du milieu de croissance par HPLC a également été réalisée pour le Bi. brève UCC2003 et Lb. plantarum WCFS1 confirmant leur capacité à utiliser le β-1,6-glucobiose comme source de carbone (Fig. 4E).

Pour confirmer cette interaction d'alimentation croisée récemment découverte entre les espèces de Bacteroides et de Bifidobacterium, nous avons effectué des expériences d'alimentation croisée à différents moments où nous avons vérifié une co-culture des deux espèces en suivant les unités formant la colonie et la quantification qPCR basée sur l'ARNr 16 S de chaque espèces pendant la croissance (Fig. 5, 6). Dans cette expérience de co-culture, Baccell WH2 a permis Bi. subsp. longum NCIMB 8809 et Bi. breve UCC2003 à se développer lorsque les deux souches sont cultivées avec le β-glucane fongique intact comme il ressort des évaluations de comptage viables (Fig. 5A pour Bi. longum subsp. longum et 5 C pour Bi. breve) et le pourcentage des deux bactéries dans le co -culture (Fig. 5B pour Bi. longum subsp. longum et 5D pour Bi. breve). L'observation de la croissance de Bifidobacterium lors d'une co-culture avec Baccell WH2 en présence de β-glucane concordait avec les résultats de la fermentation en monoculture, lorsque le surnageant acellulaire était utilisé comme source de carbone, comme illustré à la Fig. 4.

A Colonie formant des unités de Baccell WH2 + Bi. subsp. longue. B Pourcentage de Baccell WH2 + Bi. subsp. longue. C Unités formant colonie de Baccell WH2 + Bi. Brève UCC2003. D Pourcentage de Baccell WH2 + Bi. brève UCC2003. Toutes les expériences d'alimentation croisée ont été produites dans 3 répétitions indépendantes différentes (n = 3).

A Colonie formant des unités de BT + Bi. brève UCC2003. B Pourcentage de BT + Bi. brève UCC2003. C Colonie formant des unités de BT + Bi. subsp. longue. D Pourcentage de BT + Bi. subsp. longue. Toutes les expériences d'alimentation croisée ont été produites dans 3 répétitions indépendantes différentes (n = 3).

De même, BT a permis la croissance de Bi. brève UCC2003 et Bi. subsp. longum NCIMB 8809 en co-culture comme on peut l'observer sur les Figs. 6A et 6C (unités formant colonies) et 6B et 6D (pourcentage), respectivement. Encore une fois, cela a confirmé la capacité des Bacteroides à permettre des réseaux d'alimentation croisée spécifiques avec des souches de Bifidobacterium dans l'intestin lorsque les anciennes bactéries se développent sur le β-glucane fongique alimentaire.

Enfin, pour étendre cette étude à d'autres membres commensaux du microbiote intestinal humain, nous avons réalisé l'expérience de co-culture de Baccell WH2 et BT en tant que primaire et Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 en tant que dégradeur secondaire pour confirmer la capacité de Baccel WH2 et BT à permettre la croissance. de ce commensal. Figues. S2A et S2B pour Baccell WH2 et les Fig. S2C et S2D pour BT ont également montré cette capacité en co-culture.

Comme indiqué ci-dessus, Bi. breve UCC2003 peut utiliser le glucobiose libéré par Baccell WH2 lorsqu'il est cultivé sur du β-glucane. Nous avons mené une analyse bioinformatique sur le génome de l'ancienne bactérie pour identifier les glycosides hydrolases qui permettraient à Bifidobacterium d'utiliser cet oligosaccharide. Nous avons identifié un GH1 (Bbr_0109) dont il avait été précédemment démontré qu'il agissait sur le cellobiose comme substrat53. Nous avons émis l'hypothèse que cette protéine agirait sur des gluco-oligosaccharides avec différentes liaisons comme substrats. Pour prouver notre hypothèse, nous avons exprimé la protéine de manière recombinante et effectué des essais enzymatiques avec le β-1,4, le β-1,3 et le β-1,6-glucobiose comme substrats de l'enzyme. Bbr_0109 était actif sur le β-1,4 et le β-1,6-glucobiose comme prévu, et cette activité est montrée par HPLC dans les Fig. S3A et S3B, respectivement. De plus, nous avons pu caractériser cette activité et les paramètres cinétiques sont calculés dans le tableau 1. Analyse bioinformatique du Bi. subsp. longum n'a révélé aucun homologue de Bbr_0109 ou d'autres enzymes candidates responsables de sa capacité à se nourrir d'oligosaccharides dérivés de β-glucane et des travaux supplémentaires sont donc nécessaires pour démêler la voie métabolique responsable de cette activité.

Après avoir confirmé la capacité de Bacteroides à permettre spécifiquement la croissance de Bifidobacterium lorsque l'ancienne bactérie est cultivée sur β-glucane, nous avons effectué une analyse métabolomique des milieux de culture pour évaluer la production d'acides gras à chaîne courte (SCFA)/lactate/succinate par Bacteroides et Bifidobacterium en mono- et co-cultures. Le tableau 2 répertorie les niveaux détectés d'acétate, de butyrate, de propionate et de lactate par ces fermentations. Il a été démontré que Baccell WH2 produisait du succinate (78 mM) et de l'acétate (12 mM) comme principaux AGCC produits en monoculture. Comme contrôle, Bi. subsp. longum NCIMB 8809 n'a pas produit de quantités significatives d'AGCC en raison de son incapacité à utiliser la mycoprotéine β-glucane intacte. En revanche, dans la co-culture, l'acétate était le SCFA le plus concentré (115 mM) suivi du succinate (99 mM) en conséquence de la subsp. croissance longue NCIMB 8809. Enfin, du formiate (16 mM) et du lactate (21 mM) ont également été produits en co-culture du fait de la capacité de Bifidobacterium à produire ces métabolites.

Il a déjà été démontré que le β-glucane agit comme un glucide prébiotique avec divers résultats bénéfiques rapportés pour la santé humaine54,55,56,57. Récemment, Dejean et al. (2020) ont montré la capacité des souches de Bacteroides à utiliser les β-(1,3)-glucanes, tels que ceux dérivés de la laminarine de levure ou d'algue13. Ces auteurs ont montré que Bacteroides uniformis ATCC 8492 utilise un locus d'utilisation spécifique des polysaccharides pour la déconstruction de ces β-(1,3)-glucanes. Ce locus génétique code pour une enzyme de la famille des glycosides hydrolases associées à la surface cellulaire 158 (GH158) et un GH16 pour initier la dépolymérisation du polysaccharide pour libérer des oligosaccharides qui sont incorporés par la paire de type SusC/D dans le périplasme où un GH3 (β-glucosidase ) se poursuit avec le processus de dégradation convertissant tous les oligosaccharides en monomères de glucose, qui entrent ensuite dans le catabolisme glycolytique central. Toujours en 2020, Singh et al.37 ont montré la capacité de Bacteroides uniformis JCM 13288 à dégrader les β-(1,3)-glucanes avec un mécanisme enzymatique similaire à la souche de Bacteroides uniformis mentionnée ci-dessus. Cependant, ces derniers auteurs ont mis en évidence une activité GH30 supplémentaire capable de dégrader les chaînes latérales β-(1,6)-glucanes de la molécule libérant le β-1,6-glucobiose. De plus, ils ont démontré que les oligosaccharides libérés par ce Ba. uniformis peut être utilisée par d'autres membres du microbiote intestinal, qui ne se sont pas développés ou se sont mal développés sur la laminarine.

Dans le cas du β-glucane d'orge, Tamura et al.34,35,36 ont montré que Bacova et Baccell WH2 utilisent une enzyme GH16 associée à la surface (Bovatus_03149 et BcellWH2_04354) pour initier le processus de dégradation. De plus, les mêmes auteurs ont montré qu'il existe deux enzymes GH3 présentes dans le périplasme de Bacova (Bovatus_03146 ​​et Bovatus_03153) et une dans celui de Baccell WH2 (BcellWH2_4356) pour compléter le métabolisme du β-glucane d'orge.

Dans le travail décrit ici, nous révélons une voie alternative suivie par Baccell WH2 pour dégrader les β-glucanes fongiques alimentaires, tels que le polysaccharide dérivé de Fusarium venenatum, l'ingrédient principal utilisé dans les produits Quorn®, où la structure chimique consiste en un β linéaire -(1,3)-squelette glucane avec β-(1,6)-glucane comme chaînes latérales (Fig. 1A). Pour ce métabolisme, Baccell WH2 utilise deux GUL pour dégrader ce glycane complexe, comme révélé par la protéomique et confirmé par la transcriptomique (Fig. 1C et S1B, respectivement). Au sein de ces GUL, Baccell WH2 code pour un nouveau GH157 et un GH30_3, tous deux supposés être situés à la surface de la cellule, pour démarrer la dégradation du complexe glycane. Il a également été démontré que ces GUL codent pour des glycosides hydrolases supplémentaires nécessaires pour dégrader complètement les gluco-oligosaccharides libérés par les protéines de surface de la membrane externe et incorporés dans le périplasme par les paires de type SusC/D. Ces protéines périplasmiques représentent des β-glucosidases typiques appartenant aux familles GH 3 et 2. Enfin, cette GUL code pour une protéine de fonction inconnue (BcellWH2_02538), avec une localisation prédite à la surface de Baccell WH2. Cette protéine est dans un endroit parfait pour être une protéine de liaison aux glycanes de surface (SGBP), dont il a été démontré qu'elle aide la paire de type SusC/D dans la liaison des oligosaccharides à la surface des cellules bactériennes35,36,58. La raison de la présence de trois β-glucosidases différentes (deux GH3 et une GH2) codées par ces GUL pour cibler le β-glucane fongique reste spéculative pour nous. Nous postulons que Baccell WH2 pourrait agir sur plusieurs types de β-glucanes, pas seulement des sources fongiques, avec des structures chimiques différentes. Pour cette raison, ils utilisent des β-glucosidases distinctes pour hydrolyser différentes liaisons dans ces gluco-oligosaccharides. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que certaines de ces β-glucosidases soient redondantes et la bactérie évolue pour éliminer certains de ces gènes de son génome sous la forte pression de sélection imposée par l'environnement intestinal.

Enfin, nous montrons que Baccell WH2 et BT peuvent partager des oligosaccharides avec d'autres membres du microbiote intestinal, y compris les espèces commensales Bifidobacterium et Lactiplantibacillus. À cet égard, il a été démontré que Baccell WH2 permettait des interactions croisées avec le Bi. subsp. long, Bi. breve UCC2003 et Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (Fig. 5 et S2). De plus, il a été démontré que BT favorise une alimentation croisée spécifique avec Bi. subsp. long, Bi. breve UCC2003 et Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (Fig. 6 et S2), permettant la croissance des deux bactéries en co-culture. Étant donné que les oligosaccharides libérés par BT et Baccell WH sont différents (c'est-à-dire glucoheptasaccharide et glucobiose), il sélectionnera des interactions spécifiques dans l'intestin. Bi. breve UCC2003 code un GH1 (Bbr_0109) pour dégrader le glucobiose libéré par BT. Cette GH1 est très spécifique du glucobiose, étant active sur le β-(1,3)glucobiose, le β-(1,4)glucobiose et le β-(1,6)glucobiose (Tableau 1). Cependant, l'incapacité à agir sur le glucotriose ou d'autres oligosaccharides plus longs peut expliquer la capacité partielle du Bi. breve d'utiliser l'heptasaccharide libéré par Baccell WH2 et, par conséquent, son incapacité à se développer dans le surnageant de Baccell WH2. Ces interactions spécifiques dans l'alimentation croisée entre les membres Bacteroides et Bifidobacterium ont été montrées pour d'autres polysaccharides tels que l'arabinogalactane31, l'arabinoxylane48 ou l'inuline59.

En ce qui concerne le β-glucane, peu de choses ont été rapportées sur les interactions d'alimentation croisée par les membres du microbiote intestinal. Comme nous l'avons indiqué ci-dessus, Singh et al.37 ont montré la capacité de Ba. uniformis JCM 13288 pour partager des gluco-oligosaccharides avec Blautia producta JCM1471, Ruminococcus faecis JCM15917 et Bifidobacterium adolescentis JCM 1275 lorsqu'ils poussent sur la laminarine comme seule source de carbone. De plus, Centanni et al.60 ont montré des interactions entre Bacteroides ovatus, Subdoligranulum variabile et Hungatella hathewayi en utilisant le β-glucane d'orge comme source de carbone. Ils ont montré que Ba. ovatus a libéré du 3-O-β-cellobiosyl-d-glucose et du 3-O-β-cellotriosyl-d-glucose dans le milieu en tant que produits finaux et ces oligomères ont permis la croissance des deux autres bactéries avec une préférence pour le 3-O-β- cellotriosyl-d-glucose dans le cas de Hungatella hathewayi. Cependant, à notre connaissance, notre étude révèle pour la première fois des interactions moléculaires détaillées entre différents membres de Bacteroides spp. et d'autres commensaux humains (Bifidobacterium et Lactiplantibacillus) lors de l'utilisation de β-glucane fongique.

Enfin, nous avons montré la capacité de Baccell et B. breve UCC2003 à produire différents AGCC en mono- et coculture suite à la fermentation de β-glucanes. Baccell produit de l'acétate et du succinate comme principaux métabolites lorsqu'il est cultivé en monoculture sur du β-glucane, alors que la co-culture avec B. breve UCC2003 s'est avérée entraîner la production non seulement d'acétate et de succinate, mais également de lactate et de formiate, ce dernier issu de la fermentation de Bifidobacterium. . Cette production est conforme à d'autres procédés de fermentation où Bacteroides produit de l'acétate comme SCFA31 principal. Munoz et al. ont rapporté la production de niveaux inférieurs de succinate (60 mM) pour la fermentation AGP que pour le β-glucane (78 mM, tableau 2) lorsque Baccell était cultivé en monocultures. Cependant, l'effet inverse est observé pour la production d'acétate car il a été démontré que Baccell produisait 24 mM et 12 mM d'acétate lorsqu'il était cultivé sur AGP ou β-glucane, respectivement31. Cependant, la production d'AGCC semble être plus élevée pour tous les métabolites lorsque Baccell a été co-cultivé avec B. breve UCC2003 en présence de β-glucane (115, 99, 21 et 16 mM pour l'acétate, le succinate, le lactate et le formiate, respectivement), par rapport à la co-culture en présence d'AGP (94, 68, 6 et 6,9 mM pour l'acétate, le succinate, le lactate et le formiate, respectivement)31.

Toutes les données présentées dans ce travail nous ont permis d'obtenir un modèle général de la dégradation du β-glucane fongique dans Baccell WH2 et de son interaction avec les bifidobactéries en tant que dégradeurs secondaires (Fig. S3C).

En conclusion, cet article montre la capacité de différents membres des souches de Bacteroides intestinaux humains à utiliser le β-glucane fongique alimentaire. Nous avons montré que Bacteroides utilise deux GUL principales pour dégrader ce glycane complexe avec de nouvelles activités enzymatiques et familles découvertes dans ces GUL et qu'elles partagent des oligosaccharides et du Bi. subsp. long et Bi. breve UCC2003 de manière sélective lorsqu'il est possible de les utiliser. Enfin, nous avons montré l'enzyme spécifique (Bbr_0109, GH1) codée en Bi. breve UCC2003 responsable de la dégradation de l'oligosaccharide libéré par BT. Ainsi, l'étude fournit la preuve que les gènes d'utilisation des β-glucanes fongiques sont présents non seulement dans les Bacteroides mais également dans les bactéries Gram-positives. Diverses β-glucanes GULs identifiées dans cette étude peuvent ouvrir la voie au développement d'aliments fonctionnels modifiés pour l'amélioration de la santé humaine grâce à une thérapie d'intervention nutritionnelle appropriée.

Les β-glucanes de levure et d'orge testés dans cette étude ont été achetés auprès de Megazyme (Dublin, Irlande). Le D-galactose et le D-glucose ont été achetés chez Sigma (Royaume-Uni). Le milieu de croissance Luria-Bertani (LB) a été acheté chez Formedium (Norfolk, Royaume-Uni), la gélose clostridiale renforcée chez Oxoid Ltd. (Basingstoke, Angleterre) et Brain Heart Infusion chez Sigma (Royaume-Uni). Tous les réactifs sont de qualité analytique.

Le matériel de paroi cellulaire de Fusarium venenatum a été extrait et les différentes parties de glycane ont été purifiées selon une méthode précédemment décrite61. En bref, le matériau de la paroi cellulaire a été extrait alcalin avec du NaOH à 3 % pendant 75 h pour obtenir deux fractions : la fraction 1 soluble dans les bases et la fraction 2, insoluble dans les bases. La fraction 1 s'est avérée contenir des mannoprotéines et du β-1,6-1,3-glucane et des fractions contenaient ce β-1,6-1,3-glucane associé à de la chitine. La fraction 1 a été neutralisée avec de l'acide acétique glacial et centrifugée à 15 000 × g pendant 30 min et le surnageant soumis à une dialyse de 24 h. Après dialyse, le mélange a été lyophilisé avant son utilisation (Fig. S4A, B).

Ba. ovatus ATCC8483 (Bovatus), Ba. thetaiotaomicron VPI-5482 (BT), Ba. cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSM) et Ba. cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) sont capables de croître sur toutes les sources de carbone d'intérêt dans cette étude et, par conséquent, ont été cultivées directement dans 3 ml de milieu minimal (MM) contenant 1 % (wt/vol) de glucides, comme décrit ci-dessus48.

Bacteroides sp. ont été précultivés sur MM + Glucose, culottés, lavés, remis en suspension deux fois dans MM sans aucune source de carbone, et inoculés à un A600 d'environ 0,3 dans 4 ml de MM contenant 1 % (wt/vol) de glucides. Les cultures bactériennes ont été récoltées en triple (à la phase mi-log [A600, ~ 0,6] après 5 h d'incubation pour Bovatus, BT, Baccell DSM et Baccell WH2, placées dans RNA protect (Qiagen) pour une stabilisation immédiate de l'ARN, puis stockées à -20 ° C. L'ARN a été extrait et purifié avec le minikit RNeasy (Qiagen), et la pureté de l'ARN a été évaluée par spectrophotométrie. Un µg d'ARN a été utilisé pour la transcription inverse et la synthèse de l'ADNc (SuperScript VILO master mix; Invitrogen). Des PCR quantitatives (volume final de 20 µl) utilisant des amorces spécifiques ont été réalisées avec un kit SensiFast SYBR Lo-ROX (Bioline) sur un système de PCR en temps réel 7500 Fast (Applied Biosystems) (Tableau S2) Les données ont été normalisées au transcrit d'ARNr 16 S niveaux, et les changements dans les niveaux d'expression ont été calculés comme un changement de pli par rapport aux niveaux pour les cultures de MM contenant du glucose.

Baccell WH2 a été cultivé de la même manière que précédemment avec 1% de β-glucane comme polysaccharide complexe et du glucose comme contrôle monosaccharide. Les cultures bactériennes ont été récoltées en triple après croissance dans MM+Glc ou MM+β-glucane. Les cellules ont été recueillies par centrifugation (3 500 g, 15 min, 4 ° C) et lavées trois fois avec du PBS pH 7,4. Les culots cellulaires ont ensuite été remis en suspension dans un tampon d'urée 8 M dans du bicarbonate de triéthylammonium 50 mM, contenant de la tris(2-carboxyéthyl)phosphine 5 mM. Les cellules ont été lysées par sonication à l'aide d'un homogénéisateur à ultrasons (Hielscher). Les protéines ont ensuite été alkylées pendant 30 min à température ambiante en utilisant de l'iodoacétamide 10 mM dans l'obscurité. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide d'un test de protéines de Bradford (Thermo Fisher Scientific). Des échantillons de protéines, contenant 50 μg de protéines totales, ont été dilués cinq fois avec du bicarbonate de triéthylammonium 50 mM et la digestion des protéines a été effectuée à 37 ° C pendant 18 h avec agitation à 300 tr / min. Un rapport protéine / trypsine de 50: 1 a été utilisé. La digestion à la trypsine a été arrêtée et les peptides ont été dessalés comme décrit ci-dessus.

Les peptides ont été dissous dans 2 % d'acétonitrile contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique, et chaque échantillon a été analysé indépendamment sur un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific), connecté à un système UltiMate 3000 RSLCnano (Thermo Fisher Scientific). Les peptides ont été injectés sur une colonne piège Acclaim PepMap 100 C18 LC (100 μm ID × 20 mm, 3 μm, 100 Å) suivi d'une séparation sur une colonne EASY-Spray nanoLC C18 (75ID μm × 500 mm, 2 μm, 100 Å) à un débit de 300 nlmin-1. Le solvant A était de l'eau contenant 0,1 % d'acide formique et le solvant B était de l'acétonitrile à 80 % contenant 0,1 % d'acide formique. Le gradient utilisé pour l'analyse des échantillons de surface rasée était le suivant : le solvant B a été maintenu à 3 % pendant 6 min, suivi d'une augmentation de 3 à 35 % B en 43 min, 35 à 90 % B en 0,5 min, maintenu à 90 % B pendant 5,4 min, suivi d'une diminution à 3 % en 0,1 min et d'un équilibrage à 3 % pendant 10 min. Le gradient utilisé pour l'analyse des échantillons de protéome était le suivant : le solvant B a été maintenu à 3 % pendant 6 min, suivi d'une augmentation de 3 à 35 % B en 218 min, 35 à 90 % B en 0,5 min, maintenu à 90 % B pendant 5 min, suivi d'une diminution à 3 % en 0,5 min et d'un équilibrage à 3 % pendant 10 min. L'Orbitrap Fusion Lumos a fonctionné en mode ion positif dépendant des données à l'aide d'une version modifiée de la méthode d'analyse d'ions parallèles à ordre de charge (CHOPIN) récemment décrite pour une utilisation synchronisée du piège à ions et des analyseurs de masse Orbitrap. La méthode CHOPIN est dérivée de la « méthode universelle » développée par Thermo-Fisher, pour étendre les capacités de parallélisation des analyseurs de masse. Le balayage des ions précurseurs (balayage complet) a été effectué dans l'Orbitrap dans la plage de 400 à 1600 m/z avec une résolution de 120 000 à 200 m/z, une cible de contrôle automatique de gain (AGC) de 4 × 105 et une injection d'ions temps de 50 ms. Les spectres MS/MS des ions précurseurs doublement chargés ont été acquis dans le piège à ions linéaire (IT) en utilisant le mode de balayage rapide après la fragmentation par dissociation induite par collision (CID). Une énergie de collision CID de 32% a été utilisée, la cible AGC a été fixée à 2 × 103 et un temps d'injection de 300 ms a été autorisé. Les ions précurseurs avec un état de charge de 3 à 7 et avec une intensité <5 × 105 ont également été programmés pour analyse par CID/IT, comme décrit ci-dessus. Des ions précurseurs avec un état de charge de 3 à 7 et avec une intensité> 5 × 105 ont cependant été acquis dans l'Orbitrap (FT) avec une résolution de 30 000 à 200 m / z après dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD). Une énergie de collision HCD de 30% a été utilisée, la cible AGC a été fixée à 1 × 104 et un temps d'injection de 40 ms a été autorisé. Le nombre d'événements MS/MS entre les balayages complets a été déterminé à la volée pour maintenir un cycle de service fixe de 3 s. L'exclusion dynamique des ions dans une fenêtre de ± 10 ppm m/z a été mise en œuvre en utilisant une durée d'exclusion de 35 s. Une tension d'électropulvérisation de 2,0 kV et une température capillaire de 275 ° C, sans gaine ni flux de gaz auxiliaire, ont été utilisées.

Tous les spectres MS/MS ont été analysés à l'aide de MaxQuant 1.5.1.739 et recherchés dans une base de données de Bacteroides cellulosilyticus MGS:158 (contenant 4369 entrées). Les séquences de protéines ont été téléchargées à partir d'Uniprot le 10 mai 2020. La génération de la liste des pics a été effectuée dans MaxQuant et les recherches ont été effectuées à l'aide des paramètres par défaut et du moteur de recherche intégré Andromeda. La spécificité enzymatique a été définie pour prendre en compte les peptides entièrement trypsiques, et deux clivages manqués ont été autorisés. L'oxydation de la méthionine, l'acétylation N-terminale et la désamidation de l'asparagine et de la glutamine ont été autorisées comme modifications variables. Un taux de fausses découvertes de protéines et de peptides inférieur à 1 % a été utilisé dans MaxQuant. Les protéines ont été identifiées en toute confiance lorsqu'elles contenaient au moins deux peptides tryptiques uniques. Les protéines qui contenaient des peptides similaires et qui ne pouvaient pas être différenciées sur la base de l'analyse MS/MS seule ont été regroupées pour satisfaire aux principes de parcimonie. Les coups inversés et les contaminants ont été éliminés avant l'analyse en aval. Skyline 4.1.0.11796 a été utilisé pour l'extraction des chromatogrammes ioniques. L'enrichissement de l'ontologie des gènes a été réalisé à l'aide de PANTHER42 et la prédiction de la localisation des protéines subcellulaires a été réalisée à l'aide de LocateP v243.

Les gènes associés aux PUL décrits dans Baccell WH2 [BccellWH2_01926 (GH3), BccellWH2_01931 (GH157), BaccellWH2_02537 (GH30_3)] et les protéines de BT [BT3312 (GH30_3) et BT3314 (GH3)] ont été amplifiés respectivement à partir de Baccell WH2 et BT en utilisant leur ADN génomique comme matrice et cloné dans pET28a (Novagen) en utilisant les sites de restriction Nhel et XhoI pour la production et la purification de son produit codé facilitée par l'incorporation d'une étiquette His6 N-terminale (tableau 2S). Pour cela, des cellules E. coli TOP10 (ThermoFisher Scientific) ont été utilisées. La construction recombinante a été séquencée (Eurofins Genomics) pour vérifier son intégrité génétique, puis utilisée pour transformer des cellules d'expression E. coli BL21 (DE3) (Thermo-Fisher Scientific). Les cellules ont été cultivées dans du milieu Luria-Bertani (LB) contenant 50 mg/ml d'antibiotique kanamycine jusqu'à la phase logarithmique moyenne (A600nm d'environ 0,6). L'expression des protéines a été induite en ajoutant 0, 1 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aux cellules, suivie d'une croissance pendant une nuit à 16 ° C. Le lendemain, les cellules ont été récoltées par centrifugation (4000 × g) et remises en suspension dans le tampon Talon (20 mM Tris/HCl pH 8,0 plus 100 mM NaCl). Les cellules remises en suspension ont été interrompues et centrifugées (16 000 × g) pendant 20 min à 4 ° C, après quoi les protéines recombinantes ont été purifiées à partir de l'extrait acellulaire résultant par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (IMAC) à l'aide de TalonTM, une matrice à base de cobalt. Dans le processus, le Cell Free Extract (CFE) a été chargé sur une colonne contenant la résine Talon puis lavé avec un tampon Talon. Un autre lavage a été effectué avec du tampon Talon contenant 10 mM d'imidazole suivi d'une élution de protéine recombinante avec 100 mM d'imidazole. Les protéines purifiées ont ensuite été échangées dans un tampon de choix par dialyse standard.

Tous les dosages enzymatiques, sauf indication contraire, ont été effectués dans un tampon phosphate de sodium 20 mM, pH 7,0, contenant 150 mM de NaCl et réalisés en triple exemplaire. Les dosages ont été effectués à 37 °C en utilisant 1 µM de chaque GH [BccellWH2_01926 (GH3), BccellWH2_01931 (GH157), BccellWH2_02537 (GH30_3), BcellWH2_02541 (GH2), BT3312 (GH30_3) et BT3314 (GH3)] en présence de 15 0 µM β-glucane. Des aliquotes ont été prélevées sur une durée de 16 h, et les échantillons et les produits ont été évalués par CCM et chromatographie échangeuse d'anions à haute pression (HPAEC) avec détection ampérométrique pulsée (PAD). Les sucres (mono et oligosaccharides courts) ont été séparés sur une colonne de garde et d'analyse Carbopac PA1 dans un programme isocratique de soude 100 mM pendant 40 min puis avec un gradient linéaire de 100% d'acétate de sodium 500 mM pendant 60 min. Les sucres ont été détectés à l'aide de la forme d'onde quadruple standard des glucides pour la détection électrochimique sur une électrode de travail en or avec une électrode de référence de pH Ag/AgCl.

Dans le cas de GH30_3 et GH157, l'hydrolyse des polysaccharides a été quantifiée à l'aide d'un dosage des sucres réducteurs DNSA (acide dinitrosalicylique)48. Les dosages ont été effectués dans un volume final de 1 ml au pH optimal et à 37°C pendant 10 min. Les réactions ont été terminées par l'ajout d'un volume égal (1 ml) de réactif DNSA. La couleur a été développée en chauffant à 80 °C pendant 20 min avant de lire A540. Du glucose (25 à 150 µM) a été utilisé pour générer une courbe standard pour la quantification. Pour déterminer les paramètres de Michaelis-Menten, différentes concentrations de solutions de polysaccharides ont été utilisées sur la plage de 0,025 à 3 mg ml-1 avec la concentration appropriée d'enzyme pendant 10 min, et le nombre d'extrémités réductrices libérées a été quantifié comme décrit ci-dessus. Les valeurs ont été tracées à l'aide d'une régression linéaire donnant kcat/Km comme pente de la ligne.

Dans le cas de GH3s et GH2, le dosage enzymatique a été mesuré dans le spectrophotomètre à une longueur d'onde de 340 nm mesurant la libération de glucose par le kit de dosage de couple de Megazyme (Dublin, Irlande) pour la quantification de la libération de glucose.

Avant la co-culture, Baccell WH2 et BT ont été cultivés en infusion cerveau-cœur (BHI, Sigma Aldrich, Royaume-Uni) et lavés deux fois dans du PBS. Des monocultures de souches de bifidobactéries ont été cultivées sur du milieu Clostridium renforcé (Oxoid, Basingstoke UK) et lavées dans du PBS avant d'être utilisées pour inoculer un milieu minimal (MM) contenant 1 % de mycoprotéine β-glucane11. Les co-cultures ont été cultivées dans un milieu minimal inoculé contenant 1 % de mycoprotéine β-glucane et les expériences ont été réalisées en triple. Des échantillons de 0,5 ml ont été prélevés à intervalles réguliers pendant la croissance, qui ont été dilués en série et étalés sur du BHI avec de la gélose et de l'hématine porcine pour la détermination des UFC totales par millilitre de la culture (Baccell WH2 et BT) et sur du milieu Clostridium renforcé avec 0,05 % de cystéine (pour les souches bifidobactériennes de type sauvage) et avec 100 µg/ml d'érythromycine. Lactiplantibacillus plantarum WCSF4 a été cultivé de manière routinière sur un milieu MRS (Melford, Royaume-Uni) additionné de vancomycine 10 μg/ml. Chaque monoculture de Bacteroides, Bifidobacterium ou Lactiplantibacillus a également été étalée pour la détermination des UFC par millilitre à intervalles pendant la culture.

Des aliquotes prélevées sur des mono et co-cultures ont été analysées par qPCR pour quantifier le ratio de chaque espèce bactérienne lors de la culture amplifiant le gène 16S rRNA pour chaque bactérie de l'échantillon. Nous avons utilisé des amorces spécifiques (1 µM) pour chaque bactérie pour cette qPCR et est indiqué dans le tableau 2S.

Les sucres (type mixte d'oligosaccharides provenant de milieux de croissance) ont été séparés sur une colonne de garde et d'analyse Carbopac PA200 dans un programme isocratique d'hydroxyde de sodium 100 mM pendant 40 min, puis avec un gradient linéaire de 100 % d'acétate de sodium 500 mM sur une période de 60 min. . Les sucres ont été détectés à l'aide de la forme d'onde quadruple standard des glucides pour la détection électrochimique sur une électrode de travail en or avec une électrode de référence de pH Ag/AgCl.

La structure 3D de GH157 (BcellWH2_01931) a été modélisée à l'aide du logiciel AlphaFold2 Colab main/AlphaFold2.ipynb#scrollTo=UGUBLzB3C6WN). Le modèle Bccell WH2_02537 (GH30_3) a été obtenu à l'aide du serveur Phyre252. Les structures ont été visualisées à l'aide de Pymol (The PyMOL Molecular Graphic system, version 2.0 Schrodinger, LLC).

L'analyse HPLC a été utilisée pour évaluer la production de SCFA par (alimentation croisée) Baccell WH2 et Bi. Brève UCC2003. Les surnageants du milieu de croissance de la phase stationnaire (co-cultures) ont été stérilisés (filtre 0,45 μM, colonne Costart Spin-X) et injectés dans un système UltiMate® BioRS Thermo HPLC (Thermo Fisher Scientific) avec un système de détecteur d'indice de réfraction. Ce système a été utilisé pour identifier et calculer la production d'acétate, de lactate et de butyrate à la suite de la fermentation des glucides. Les concentrations ont été calculées sur la base de normes connues. Un milieu non fermenté contenant du LW-AG a servi de témoin. Une colonne HPLC Accucore™ C18 a été utilisée et maintenue à 65°C. L'élution a été réalisée pendant 25 min en utilisant une solution de H2SO4 10 mM à un débit constant de 0,6 ml min-1.

L'échantillon contenant les oligosaccharides générés à partir du surnageant de Baccell WH2 et BT cultivés sur β-glucane a été dilué 1:10 (v/v) avec du tampon B (85 % acétonitrile/15 % formiate d'ammonium 50 mM dans l'eau, pH 4,7) et 0,5 μl a été analysé par analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse via l'élution d'une colonne capillaire ZIC-HILIC (SeQuant, 3,5 μm, 200 Å, 150 × 0,3 mm, Merck). La colonne a été connectée à un système HPLC NanoAcquity (Waters) et chauffée à 35 °C avec un gradient d'élution comme suit : 100 % de tampon B pendant 5 min, suivi d'un gradient à 25 % de tampon B/75 % de tampon A (50 mM formiate d'ammonium dans l'eau, pH 4,7) pendant 40 min. Le débit était de 50 μl min-1 et 10 volumes de colonne de tampon B ont été équilibrés entre les injections. Les données MS ont été recueillies à l'aide d'un spectromètre de masse Bruker Impact II QT fonctionnant en mode ions positifs, 50–2000 m/z, avec des réglages de tension capillaire et de température de 2800 V et 200 °C respectivement, ainsi qu'un débit de gaz de séchage et une pression de nébuliseur de 6 l min−1 et 0,4 bar. Les données MS ont été analysées à l'aide du logiciel Compass DataAnalysis (Bruker).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données protéomiques sont déposées dans PeptideAtlas (identifiant PASS04831, données brutes pour le blanc, le glucose et la mycoprotéine β-glucane comme sources de carbone). Toutes les données générées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires). Toutes les données sources sous-jacentes aux graphiques et aux diagrammes se trouvent dans les données supplémentaires 1. Les gels SDS originaux sont disponibles dans la Fig. S5. D'autres données brutes sont disponibles sur demande.

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JM-M. est soutenu par une bourse de doctorat en partie financée par Marlow Foods Ltd. Ce travail a été mené indépendamment de Marlow Foods et les auteurs n'ont aucun intérêt financier ou autre dans le résultat du travail. JM-M. a reçu le soutien financier d'une subvention interne de l'Université de Northumbria. Dv-S. est membre de l'APC Microbiome Ireland qui reçoit le soutien financier de la Science Foundation Ireland (SFI/12/RC/2273 − P1 et SFI/12/RC/2273 − P2) dans le cadre du plan de développement national du gouvernement irlandais.

Laboratoire d'enzymologie microbienne, Département des sciences appliquées, Université de Northumbria, Newcastle Upon Tyne, NE1 8ST, Tyne & Wear, Angleterre, Royaume-Uni

Pedro Fernandez-Julia, Gary W. Black, William Cheung et José Munoz-Munoz

École de microbiologie et APC Microbiome Ireland, University College Cork, Cork, Irlande

Douwe Van Sinderen

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PF-J. des enzymes recombinantes clonées, exprimées et purifiées ; cinétique conduite et analysée pour l'hydrolyse des polysaccharides, des oligosaccharides et des substrats chromogéniques ; produits d'hydrolyse déterminés dans la CLHP ; courbes de croissance réalisées de toutes les bactéries anaérobies ; mené des expériences d'alimentation croisée ; et écrit l'article. WC a mené et analysé les données protéomiques et rédigé la section protéomique du manuscrit. GB, DVS et JM-M. conçu et dirigé la recherche et co-écrit l'article avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à José Munoz-Munoz.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la gestion principale : Tobias Goris. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Fernandez-Julia, P., Black, GW, Cheung, W. et al. Activités d'alimentation croisée facilitées par les β-glucanes fongiques entre les espèces de Bacteroides et de Bifidobacterium. Commun Biol 6, 576 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04970-4

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Reçu : 19 décembre 2022

Accepté : 23 mai 2023

Publié: 30 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04970-4

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