Bioconversion de 4

Mar 08, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 1835 (2023) Citer cet article

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Les activités d'élevage et les déchets pharmaceutiques entraînent une accumulation considérable d'hormones stéroïdes et d'œstrogènes dans les eaux usées. Ici, les oestrogènes agissent comme des agents pro-cancérogènes et des perturbateurs endocriniens interférant avec le développement sexuel des animaux aquatiques et ayant des effets toxiques chez l'homme. Les bactéries environnementales jouent un rôle vital dans la dégradation des œstrogènes. Leur large réservoir d'enzymes, telles que les dioxygénases à clivage de cycle (RCD), peut dégrader le noyau stéroïdien, catalysant le méta-clivage des cycles stéroïdiens A, B ou D. Dans ce travail, 4 dioxygénases à clivage du cycle extra-diol (ERCD), PP28735, PP26077, PP00124 et PP00193, ont été isolées de la sphingomonade marine Novosphingobium sp. PP1Y et caractérisé. Les paramètres cinétiques des enzymes ont été déterminés sur différents substrats catécholiques synthétiques. Ensuite, la bioconversion des oestrogènes catéchols a été évaluée. PP00124 s'est avéré être un catalyseur efficace pour la dégradation du 4-hydroxyestradiol (4-OHE2), un dérivé hydroxylé cancérigène de E2. Le clivage complet de 4-OHE2 a été obtenu en utilisant PP00124 à la fois sous forme soluble et dans des cellules E. coli recombinantes entières. Les analyses LC – MS / MS ont confirmé la génération d'un produit semi-aldéhyde, par métaclivage du cycle A. A notre connaissance, PP00124 est la première enzyme caractérisée capable de dégrader directement le 4-OHE2 par métaclivage. De plus, la biodégradation complète de 4-OHE2 à l'aide de cellules entières recombinantes a mis en évidence des avantages à des fins de bioremédiation.

Les œstrogènes sont les principales hormones stéroïdes responsables de la régulation du système reproducteur féminin et du développement des caractéristiques sexuelles secondaires1. Chez tous les vertébrés, l'estrone (E1) et le 17β-estradiol (E2) sont les principales hormones régulatrices (Fig. 1a). L'E2, qui a une activité oestrogénique majeure avec des concentrations plasmatiques chez les mammifères femelles jusqu'à 500 pg/mL, est parmi les principaux effecteurs pour le développement du système reproducteur chez l'homme2. Les œstrogènes sont excrétés dans l'urine après hydroxylation ou sulfonation3; plusieurs études ont montré que ces composés, et en particulier leurs formes hydroxylées (4-hydroxyestradiol 4-OHE2 et 2-hydroxyestradiol 2-OHE2, Fig. 1a), pouvaient agir comme perturbateurs endocriniens et cancérigènes4,5.

Principaux composés oestrogéniques et voies de dégradation de l'E2. ( a ) Structures et poids moléculaires (MW) de l'estrone (E1), du 17 β-estradiol (E2), de l'estratetraenol (E0), du 4-hydroxyestradiol (4-OHE2) et du 2-hydroxyestradiol (2-OHE2). Les anneaux stéroïdiens AD sont indiqués en rouge. (b) Principales voies de dégradation E2. i) E2 Une hydroxylation du cycle19. ii) hydroxylation du cycle E2 B19. iii) Déshydratation du cycle E2 D20. iv) déshydrogénation de E2 en E1 et déshydrogénation et clivage ultérieurs du cycle D21. iv.i) Déshydrogénation de E2 en E1 et déshydrogénation et clivage ultérieurs du cycle A18. La voie NB iv.i) suit essentiellement la même réaction de clivage du cycle A que la voie i). Il est ici séparé puisque le substrat de clivage est le 4-OHE1 dans la voie iv.i) et le 4-OHE2 dans la voie i).

La présence de ces composés nocifs dans les eaux usées et les écosystèmes aquatiques est principalement due aux excrétions des animaux de ferme dans les activités d'élevage6 et est récemment devenue une préoccupation environnementale majeure7,8,9 ; ces molécules semblent en effet responsables d'altérations du développement, de la fertilité et des fonctions reproductrices chez les populations de mammifères, de poissons et d'amphibiens. En effet, des populations de poissons intersexués ont été observées dans le monde entier dans des écosystèmes contaminés par les œstrogènes [5,6,10,11,12 et leurs références].

La préoccupation environnementale croissante a récemment stimulé l'intérêt envers les processus biologiques impliqués dans la dégradation des œstrogènes, en particulier de l'E2, et l'identification de nouveaux dégradeurs potentiels et des activités enzymatiques dégradantes13. La dégradation des noyaux œstrogéniques, par perturbation de la structure du cycle aromatique A, est la clé pour entraver l'interaction de ces composés avec l'ADN, neutralisant ainsi leur activité et l'effet cancérigène qui en résulte13,14. Les processus de dégradation microbienne jouent un rôle vital dans la détermination du devenir et du transport des œstrogènes dans l'environnement. Les bactéries possédant la machinerie catalytique spécifique pour une perturbation complète des noyaux stéroïdiens en mode métabolique ou co-métabolique jouent un rôle central dans la conversion des œstrogènes en CO213,14,15.

La biodégradation des œstrogènes peut être catalysée par différentes oxygénases et déshydrogénases, par différentes voies cataboliques. Les dioxygénases à clivage de cycle (RCD) jouent un rôle fondamental dans la dégradation des œstrogènes, catalysant le clivage oxydatif des cycles A œstrogéniques hydroxylés. Ces familles d'enzymes microbiennes jouent également un rôle central dans les voies de dégradation des hydrocarbures aromatiques mono- et polycycliques et des composés aromatiques complexes (permettant par exemple le clivage des polluants environnementaux et des dérivés de la lignine dans l'environnement). Les oxygénases sont généralement des complexes enzymatiques qui utilisent des cofacteurs et réalisent des réactions redox en utilisant l'oxygène comme co-réactif et le NADH ou le fer comme donneur d'électrons16. La voie de dégradation des composés aromatiques chez les bactéries peut généralement être divisée en deux étapes, indiquées comme voies supérieure et inférieure17. Les réactions des voies supérieures impliquent l'activation du cycle aromatique par addition d'un ou deux groupes hydroxyle sur deux atomes de carbone adjacents, souvent catalysée par des monooxygénases. Ensuite, les dioxygénases opèrent le clivage oxydatif du cycle des composés catécholiques. Les dioxygénases sont généralement divisées en dioxygénases à clivage intra-(IRCD) et extra-diol (ERCD)18. Les enzymes IRCD clivent la liaison entre les deux groupes hydroxyle générant un composé dicarboxylique (un dérivé de l'acide cis-muconique). Les ERCD catalysent l'incorporation d'oxygène O2 dans les dérivés catéchols, clivant ainsi l'une des liaisons adjacentes au diol et générant un acide alpha-hydroxy contenant un groupe aldéhydique ou cétonique (un dérivé du semialdéhyde cis-muconique). Ces enzymes permettent la transformation de molécules aromatiques dihydroxylées en intermédiaires du cycle des acides tricarboxyliques (TCA), qui sont facilement métabolisés par tout type d'organisme. Selon Yu et ses collaborateurs14, les voies de dégradation microbienne des œstrogènes sont divisées en quatre voies principales, résumées à la Fig. 1b. Ces voies de dégradation pourraient également être regroupées en fonction des anneaux stéroïdiens impliqués dans la première étape de dégradation : i) Un anneau : hydroxylation directe de E2 en C4 pour former 4-OHE2 et clivage ultérieur de 4-OHE2 via le soi-disant 4,5-seco parcours, réalisé par les ERCD19 ; ii) cycle B : dégradation de E2 à partir de l'hydroxylation du cycle B saturé et du clivage ultérieur19 ; iii) Anneau D : dégradation directe de E2 via la déshydratation de l'anneau D20 ; iv) Anneau D : dans cette voie, la première étape implique toujours une déshydrogénation de E2 en E1. Par la suite, E1 pourrait être soit déshydrogéné et clivé sur le cycle D (voie iv)21,22, soit hydroxylé en 4-OHE1 et clivé sur le cycle A par la voie 4,5-seco (voie iv.i), de la même manière que ce qui est décrit en i) pour 4-OHE219,23.

Ces dernières années, différents travaux ont décrit l'isolement de nouvelles enzymes microbiennes capables de dégrader E2, dont la plupart sont impliquées dans la déshydrogénation initiale de E2 en E1, qui est ensuite hydroxylée et clivée, comme décrit dans la voie iv.i)19,23, 24,25,26,27,28.

L'activité de bioprospection est de la plus haute importance pour faire la lumière sur les voies biochimiques impliquées dans la biodégradation des œstrogènes et pour élargir la boîte à outils enzymatique pour les applications biotechnologiques de ces catalyseurs.

Novosphingobium sp. PP1Y, comme d'autres bactéries dégradant les œstrogènes, est une alpha-protéobactérie marine membre de l'ordre des Sphingomonadales, qui a été isolée des eaux très polluées de Pozzuoli (Italie). Plusieurs traits phénotypiques de cette souche, y compris la possibilité de se développer sur des mélanges complexes de molécules aromatiques dissoutes dans des phases non polaires telles que le diesel et l'essence, suggèrent une polyvalence métabolique unique et la capacité de catalyser la biodégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques complexes (HAP) 29. Novosphingobium sp. Le génome de PP1Y a été entièrement séquencé et annoté30, et son analyse révèle la présence de plus de 40 orfs putatifs codant pour des mono- et dioxygénases, qui représentent un réservoir impressionnant d'activités oxygénases probablement responsables de la capacité de cette souche à dégrader une large gamme de composés aromatiques mono-, bi-, tri-, tétra- et pentacycliques30,31.

Dans ce travail, le microorganisme Novosphigobium sp. PP1Y a été utilisé comme nouvelle source pour l'isolement des ERCD actifs vis-à-vis des œstrogènes catéchols. Les gènes codant pour quatre ERCD ont été exprimés par recombinaison dans E. coli ; les enzymes correspondantes ont été caractérisées et les constantes cinétiques sur différents substrats catécholiques ont été mesurées. Ensuite, la bioconversion des œstrogènes catéchols a été évaluée soit à l'aide d'extraits cellulaires, soit de cellules recombinantes entières. L'ERCD PP00124 a été identifié et caractérisé comme capable de catalyser la bioconversion complète de 4-OHE2, à la fois sous forme soluble et dans des cellules recombinantes entières, via un métaclivage.

La majorité des ERCD connus appartiennent à une famille hétérogène de protéines caractérisée par la présence de plusieurs sous-familles32. Chaque famille a évolué pour optimiser le clivage d'un type spécifique de catéchols substitués : 3- ou 4-alkylcatéchols, 3,4-dihydroxyphénylacétate, 2,3-dihydroxybiphényle, 1,2-dihydroxynaphtalène, 3,4-dihydroxyphénanthrène.

L'analyse du génome de la souche PP1Y30 a révélé la présence de 7 orfs codant pour des ERCD putatifs (trois présents en double copie avec une identité à 100%). Une étude phylogénétique approfondie, étayée par une analyse de modélisation d'homologie, a permis d'émettre l'hypothèse du rôle des sept enzymes dans le métabolisme des composés aromatiques mono et polycycliques30. En particulier, il a été émis l'hypothèse que les orfs AT15671/AT31616, Mpl3065, AT15599/AT31688 et AT32663 codent respectivement pour une (di)(méthyl)catéchol dioxygénase putative, une dihydroxybiphényl dioxygénase putative et deux dihydroxynaphtalène/dihydroxyphénanthrène dioxygénases. Ici, ces enzymes seront nommées respectivement PP00193, PP26077, PP00124 et PP28735.

L'analyse de modélisation/amarrage par homologie décrite dans D'Argenio et al.30 a suggéré que les sites actifs des ERCD mentionnés devraient être capables d'héberger des catéchols avec des substituants aux positions 3 et/ou 4, mais les dimensions de la poche du site actif progressivement augmentation de la commande PP00193 < PP26077 < PP00124 < PP28735. De manière très intrigante, PP00124 et PP28735 ont montré des poches de sites actifs suffisamment grandes pour héberger des hydrocarbures aromatiques polycycliques dihydroxylés avec 3 à 4 cycles (par exemple phénanthrène, anthracène, benz[a]anthracène et chrysène) et 4-OHE2 qui, d'un point de vue stérique, est similaire au 1,2-dihydroxychrysène (voir la figure supplémentaire S1). La détermination de l'activité spécifique des quatre ERCD sur un panel limité de substrats, dont le 4-OHE2, a confirmé les rôles supposés de ces protéines dans le métabolisme des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans la souche PP1Y30.

Par conséquent, les 4 ERCD ont été sélectionnés comme activités intéressantes pour dépister la bioconversion de l'estradiol. Les conditions d'expression recombinante ont été optimisées dans des cellules E. coli BL21(DE3) transformées avec les vecteurs pET22b(+) correspondants, dont la construction a été décrite précédemment30. Les conditions d'expression ont été optimisées en testant différentes températures de croissance, temps d'induction et concentrations d'IPTG, pour obtenir des enzymes actives. Pour sélectionner les conditions de croissance, nous avons évalué l'activité catalytique des ERCD sur le 2,3-dihydroxybiphényle (2,3-DHBP) en tant que substrat dans des cellules entières recombinantes E. coli BL21 (DE3) (Figure supplémentaire S2 a), au cours de la phase d'induction par IPTG. Comme le montre la figure supplémentaire S2 b, tous les ERCD recombinants ont été exprimés dans la fraction soluble, à l'exception de la protéine PP28735, qui était principalement présente dans la fraction insoluble, comme le souligne l'analyse SDS-PAGE des fractions solubles et insolubles après lyse cellulaire (supplémentaire Figure S2 b). Le niveau d'expression des protéines sous forme soluble (tableau supplémentaire S1) a été estimé à 120, 40 et 100 mg/L de culture pour PP26077, PP00124 et PP00193, respectivement, mais seulement 1 à 2 mg/L pour l'enzyme PP28735.

Les ERCD ont ensuite été purifiés par une chromatographie d'échange anionique sur une résine Q-Sepharose FF. Une instabilité marquée de tous les ERCD dans des tampons sans Fe(NH4)2(SO4)2 a été observée, suggérant qu'en l'absence de fer exogène dans le tampon, le Fe(II) dans le site actif était facilement perdu ou oxydé en Fe (III) conduisant ainsi à l'inactivation enzymatique. Un protocole de chromatographie "batch" rapide a donc été mis en place, impliquant l'utilisation d'un tampon contenant 30% de glycérol et 0,1 mM Fe(NH4)2(SO4)2. Comme le montre la figure supplémentaire S3 a, le rendement des procédures de purification variait de 44 à 95 %, sur la base de l'évaluation de l'enzyme active purifiée (unités totales finales) par rapport à la quantité d'enzyme active dans les lysats cellulaires (unités totales initiales). L'analyse SDS-PAGE des protéines purifiées (Figure supplémentaire S3 b) a révélé la présence de contaminants jusqu'à 10 à 20% des protéines totales pour les ERCD PP26077, PP00124 et PP00193, tandis que le PP28735 purifié a montré une présence plus élevée de protéines contaminantes, probablement liées à la faible quantité initiale de protéines dans les fractions solubles des cultures induites.

Comme toutes les dioxygénases à clivage du cycle sont dotées d'un ion Fe(II) comme cofacteur au niveau du site actif, et l'absence d'incorporation de Fe(II) dans la protéine mature, ou son oxydation en Fe(III), provoque une inactivation totale du activité dioxygénase, nous avons mesuré la teneur en fer par dosage Ferene S. Les résultats rapportés dans le tableau supplémentaire S1 ont mis en évidence que le Fe(II) total était de 60 %, 100 % et 88 % pour les protéines PP26077, PP00124 et PP00193, respectivement. Le rendement de récupération de la protéine PP28735 dans les fractions purifiées était trop faible pour mesurer la quantité de fer. De plus, le dosage du fer a permis d'estimer que 25 % et 7 % des protéines PP26077 et PP00193, respectivement, étaient dépourvues de fer, alors que les fractions restantes étaient dotées de Fe(III), conduisant à des enzymes inactives. Il convient de noter que la protéine PP00124 purifiée a conservé 100 % de Fe(II) à la fin de la procédure d'expression et de purification, indiquant ainsi une stabilité enzymatique supérieure par rapport aux autres ERCD.

Ensuite, l'activité spécifique (SA) et les paramètres cinétiques des ERCD purifiés sur les quatre substrats catécholiques sélectionnés, 2,3-DHBP, 3-méthylcatéchol (3MC), 4-méthylcatéchol (4MC) et catéchol (CAT) ont été déterminés ("Materials and Méthodes"). L'activité spécifique des RCD purifiés a été mesurée en surveillant la formation au cours du temps des semialdéhydes cis-muconiques correspondants. Les résultats présentés dans le tableau 1 suggèrent que les protéines PP28735, PP26077 et PP00124 étaient principalement actives sur le 2,3-DHBP et présentaient des valeurs inférieures de SA sur les autres substrats monoaromatiques testés. À l'inverse, PP00193 était plus actif sur CAT, 3-MC et 4-MC, comme prévu sur la base des résultats de modélisation30, qui indiquaient que cette enzyme a un site actif plus petit.

Les caractéristiques cinétiques des 4 ERCD, résumées dans le tableau 2, ont montré que les protéines PP00124 et PP00193 étaient dotées de l'activité la plus élevée vis-à-vis de tous les substrats, avec des valeurs de KM allant de 30 à 1 µM. Comme prévu, PP00193 semblait la meilleure enzyme pour la conversion des composés monoaromatiques et du 2,3-DHBP, montrant les valeurs kcat/KM les plus élevées pour ces substrats. À l'inverse, les protéines PP28735 et PP26077 avaient une activité significative uniquement sur le 2,3-DHBP, le plus grand substrat, tout en affichant des valeurs de KM supérieures à 450 µM sur les catéchols monoaromatiques. En effet, ces enzymes affichent des valeurs de kcat/KM pour la conversion du 2,3-DHBP entre 80 et 200 fois inférieures à celles du 3-MC. La protéine PP00124 a montré une activité comparable sur tous les substrats testés, avec une efficacité supérieure vis-à-vis du 2,3-DHBP.

La bioconversion des oestrogènes catéchols à l'aide de la souche PP1Y ERCD a été testée. Les substrats utilisés pour les bioconversions étaient le 4-OHE2 et le 2-OHE2 (Fig. 1a). Ceux-ci sont dérivés de l'hydroxylation E2, portant les substituants -OH aux positions 3, 4 et 2, 3 du cycle aromatique, respectivement. À partir de l'analyse d'amarrage moléculaire précédemment effectuée30, 4-OHE2 et 2-OHE2 devraient être mieux logés dans les sites actifs PP28735 et PP00124. Par conséquent, ces enzymes devraient présenter une affinité plus élevée pour les œstrogènes catéchols sélectionnés. Les données préliminaires obtenues dans nos travaux précédents30 ont confirmé cette hypothèse. Dans ce travail, la SA des quatre ERCD a été déterminée pour le 4-OHE (tableau 5 en 30). Les données ont montré que les protéines PP28735 et PP00124 étaient capables de catalyser le clivage 4-OHE2 dans son semialdéhyde cis-muconique putatif, tandis que les protéines PP00193 et ​​PP26077 ont montré une activité négligeable.

Afin de sélectionner la meilleure enzyme pour la conversion de 4-OHE2, nous avons effectué des expériences temporelles (Fig. 2) réalisées avec les protéines PP28735 et PP00124 par des analyses au spectrophotomètre. Les réactions, effectuées à pH 7,5 en présence de 100 µM de 4-OHE2, ont conduit à la formation d'un produit de réaction doté de λmax à 298 nm (Fig. 2). En l'espace de 4 (PP00124) et 8 (PP28735) minutes d'incubation, aucun autre changement dans les spectres n'a été observé, suggérant une conversion complète de 4-OHE2. Sur la base des propriétés spectrales des produits de clivage, on pourrait émettre l'hypothèse que les deux enzymes catalysent la même réaction. Cependant, il convient de noter que les semi-aldéhydes obtenus à partir du métaclivage des catéchols apparaissent, en général, sous forme de produits jaunes avec λmax entre environ 350 et 450 nm, alors que le produit de clivage du 4-OHE2 est absorbé dans la région des spectres UV avec λmax à 298 nm. Il est bien connu que les formes de couleur jaune représentent la forme dianionique des semialdéhydes, généralement la plus abondante à pH 7,5 auquel les réactions ont été réalisées33. Pour vérifier les propriétés des produits de conversion 4-OHE2 par les protéines PP28735 et PP00124, nous avons alcalinisé le mélange réactionnel par ajout de NaOH. Les propriétés spectrales dans le tampon alcalin rapportées dans la figure supplémentaire S4, ont mis en évidence des produits de couleur jaune (λmax à 417 nm) comme prévu pour les semi-aldéhydes, confirmant ainsi la réaction de clivage de l'anneau et suggérant qu'une valeur de pH plus élevée est nécessaire pour obtenir la forme jaune dianionique .

Spectres UV-vis de l'évolution temporelle de la conversion enzymatique du 4-OHE2. Les réactions ont été effectuées en utilisant les enzymes PP28735 (a) et PP00124 (b) dans 1 ml de tampon Tris / HCl 50 mM pH 7, 5 contenant 100 μM de 4-OHE2 (lignes noires en pointillés). Les réactions ont été déclenchées par addition d'enzymes purifiées. La production de semialdéhyde a été surveillée par le programme Scanning Kinetics sur le spectrophotomètre Cary 100 UV – VIS dans une gamme de longueurs d'onde de 230 à 500 nm, enregistrant l'absorption pendant 4 à 8 min, à 25 ° C (lignes d'échelle de gris). Les lignes noires en gras représentent les spectres du semialdéhyde en fin de réaction à pH 7,5 (λmax 298 nm).

Nous avons également effectué des analyses cinétiques de la conversion du 4-OHE2 par les ERCD pour sélectionner le meilleur catalyseur. La formation du produit a été surveillée par spectrophotométrie à 298 nm, longueur d'onde à laquelle aucune absorbance n'a été enregistrée pour le substrat 4-OHE2. Comme indiqué dans le tableau 3, la protéine PP00124 a montré les meilleurs paramètres cinétiques pour la bioconversion de 4-OHE2 avec une valeur KM sous-micromolaire, ce qui a incité la mise en place d'un protocole de bioconversion à petite échelle utilisant des lysats cellulaires d'E. coli exprimant PP00124 comme catalyseur.

Nous avons également testé la capacité des ERCD à cliver le 2-OHE2, mais aucun produit de conversion n'a été observé pour aucune des protéines, suggérant ainsi une sélectivité de ces enzymes envers le 4-OHE2.

Sur la base des propriétés cinétiques intéressantes de la protéine PP00124, nous avons étudié plus en détail la cinétique du clivage de 4-OHE2 par PP00124 contenant des extraits cellulaires effectuant des analyses HPLC.

La conversion complète du 4-OHE2 a été vérifiée par spectrophotométrie. Les produits de bioconversion obtenus à partir de la réaction ont ensuite été analysés par HPLC. Les résultats présentés sur la figure 3 ont révélé que dans nos conditions expérimentales, la conversion complète de 4-OHE2 (temps de rétention : 12,7 min et λmax : 279 nm, panneau 3a) en un produit semi-aldéhyde (temps de rétention : 11,4 min et λmax : 305 nm , panneau 3b) a été obtenu, confirmant ainsi les analyses spectrophotométriques. Au contraire, lors de l'utilisation de 2-OHE2 comme substrat (temps de rétention : 13,4 min et λmax : 286 nm) (Fig. 3, panneaux c, d) aucune conversion n'a été observée à aucun moment de la réaction, conformément à nouveau aux analyses spectrophotométriques . Ces données ont confirmé la spécificité étroite de PP00124 vis-à-vis des substrats portant des substituants en positions 3, 4 des cycles A aromatiques.

Analyse HPLC de la bioconversion de 4-OHE2 et 2-OHE2 en utilisant PP00124 recombinant comme catalyseur. Le test a été réalisé dans un tampon Tris/HCl 50 mM pH 7,5 à 25 °C, avec 100 µM et 200 µM de 4-OHE2 et 2-OHE2, respectivement. Des aliquotes des mélanges réactionnels ont été recueillies avant l'ajout de l'enzyme. Les échantillons ont été acidifiés, dilués 100 fois, centrifugés et analysés par HPLC en tant que témoins négatifs (présentés dans les panneaux (a) et (c) en tant que réactions à blanc). Ensuite, le lysat de cellules PP00124 a été ajouté pour démarrer les réactions. La formation du produit a été suivie par spectrophotométrie pendant 15 min. Les échantillons ont ensuite été acidifiés, dilués 100 fois, centrifugés et analysés par les panels HPLC (b) et (d). ( a ) Chromatogramme HPLC de la réaction à blanc 4-OHE2 et du spectre UV-vis du 4-OHE. ( b ) Chromatogramme HPLC de la réaction 4-OHE2: produit de réaction semi-aldéhyde et spectre UV-vis correspondant. ( c ) Chromatogramme HPLC de la réaction à blanc 2-OHE2 et du spectre UV-vis. ( d ) Chromatogramme HPLC de la réaction 2-OHE2 et spectre UV-vis correspondant. Tous les chromatogrammes présentés ont été acquis à 280 nm.

Une analyse par spectrométrie de masse à haute résolution des produits de conversion a été effectuée. Des aliquotes des réactions à blanc et au point final ont été collectées et soumises à une extraction liquide-liquide avec de l'acétate d'éthyle. Les extraits obtenus ont été analysés par LC-MS/MS en mode ions négatifs. Deux produits de réaction majeurs générés par la bioconversion catalysée par PP00124 de 4-OHE2 ont été détectés : deux espèces de co-éluant, avec des poids moléculaires de 306,1839 (mesuré m/z 305,1761, Fig. 4b) et 324,1951 (mesuré m/z 323,1873, Fig .4c), respectivement.

Spectres MS haute résolution des produits de bioconversion 4-OHE2. Les spectres de pleine masse (MS1) ont été acquis en mode ions négatifs. (a) Spectre 4-OHE2 m/z (m/z 287,1652). (b) Spectre m/z du produit de méta-clivage 4-OHE2 (m/z 323,1873). ( c ) Spectre m / z du produit de cyclisation 4-OHE2 (hypothétique). (m/z 305,1761).

Ces données ont confirmé la présence du produit semi-aldéhyde clivé méta 4-OHE2 (MW théorique 324,1937), comme prévu sur la base du mécanisme catalytique des ERCD médiant l'insertion d'une molécule d'O2 dans le substrat34. Ceci est indiqué sur la figure 4 en tant que méta-produit de clivage. Le deuxième produit de réaction pourrait être généré à partir du produit de métaclivage, par une attaque nucléophile spontanée de l'hydroxyle sur C4 sur le groupe carbonylique sur C5, suivie d'une déshydratation (MW théorique 306,1831). Ceci est indiqué sur la figure 4c en tant que produit de cyclisation (hypothétique). Les structures hypothétiques de ces composés et la réaction proposée sont rapportées à la Fig. 5.

Mécanisme de dégradation hypothétique du 4-OHE2 utilisant PP00124. La présence du produit semi-aldéhyde clivé 4-OHE2 meta (MW théorique 324,1951) a été vérifiée par spectrométrie de masse. Il est conforme au mécanisme catalytique des ERCD agissant par le biais d'une insertion d'O2 dans le substrat. Nous émettons l'hypothèse de la génération du deuxième produit identifié, par une cyclisation du produit de métaclivage, avec l'attaque nucléophile spontanée de l'hydroxyle sur C4 sur le groupe carbonylique sur C5. La structure hypothétique de ce composé (MW théorique 306,1839) est rapportée comme produit de cyclisation 4-OHE2 (hypothétique).

Une fois la conversion complète de 100 μM de 4-OHE2 à l'aide de PP00124 confirmée, nous avons évalué la possibilité d'obtenir la bioconversion de 4-OHE2 avec des cellules entières comme biocatalyseurs. A cette fin, des cellules recombinantes d'E. coli exprimant PP00124 ont été utilisées.

Après expression recombinante, les cellules ont été testées pour tester l'activité de la protéine recombinante sur le 2,3-DHBP. Une activité spécifique de 0,7 U2,3DHBP/OD a été mesurée. 3,5 unités totales de 2,3-DHBP (5 DO600) de PP00124 exprimant des cellules d'E. coli ont été incubées dans un milieu minimal contenant 100 μM (28 mg/L) de 4-OHE2 et une expérience d'évolution dans le temps a été réalisée. L'expérience a également été réalisée avec 10 cellules OD600 de E. coli BL21(DE3) transformées avec le plasmide pET22b(+) vide comme témoin négatif. Chaque point de temps des cellules PP00124 et des réactions de contrôle négatif d'E. coli a été extrait deux fois dans de l'acétate d'éthyle et analysé par HPLC-MS/MS. Aucune dégradation de 4-OHE2 n'a été observée en utilisant des cellules E. coli transformées avec le plasmide vide. Les résultats obtenus pour les cellules exprimant PP00124 sont présentés à la Fig. 6. Comme observé dans la réaction réalisée à l'aide de l'enzyme purifiée, une diminution rapide de 4-OHE2 (m/z 287) et la formation au fil du temps des deux composés générés par 4- L'hydrolyse de l'OHE2 était évidente (m/z 305 et 323). Fait intéressant, les cinétiques d'accumulation de ces deux composés étaient presque superposables, suggérant ainsi qu'un équilibre entre ces deux espèces s'est produit.

Bioconversion de cellules entières d'E. coli de 4-OHE2 en utilisant PP00124 recombinant comme catalyseur. Des cellules recombinantes d'E. coli exprimant P00124 ont été incubées à 37 ° C avec 100 μM de 4-OHE2 dans un milieu minimal. À différents moments, des aliquotes du surnageant ont été prélevées et acidifiées. Une extraction liquide-liquide avec de l'acétate d'éthyle a été réalisée. Des analyses quali-quantitatives HPLC-MS/MS ont été réalisées. Les spectres de pleine masse (MS1) ont été acquis en mode ions négatifs haute résolution. Les aires de pic des chromatogrammes d'ions extraits pour chaque composé et point de temps ont été enregistrées. La tendance au fil du temps du 4-OHE2 (m/z 287) et de ses produits de clivage (m/z 305 et 323) est indiquée. ( a ) Bioconversion en 2 heures. (b) détail de la bioconversion de 20 min. Les données sont rapportées en surface (%) exprimant l'abondance relative des composés. Pour chaque composé, la surface de pic la plus élevée enregistrée a été fixée à 100 % de surface. Les échantillons ont été analysés en triple et les données ont été rapportées comme la moyenne des zones mesurées.

Le taux de bioconversion effectué à l'aide de cellules exprimant PP00124 était significativement plus lent que celui effectué avec l'enzyme purifiée (décrit ci-dessus). Cependant, PP00124 kcat/KM a permis une conversion complète du 4-OHE2 en 15 min en utilisant 3,5 unités2,3-DHBP dans 5 OD600. Il convient de noter qu'à notre connaissance, aucun exemple de biodégradation de cellules entières 4-OHE2 n'a été signalé jusqu'à présent. Li et ses collaborateurs ont montré une dégradation complète de E2 à l'aide d'un consortium microbien, après 3 jours d'incubation à 20 mg/L35.

Les ERCD suscitent l'attention pour leur utilisation potentielle dans la bioconversion des œstrogènes et des composés de type œstrogène. L'identification et la caractérisation de nouvelles activités enzymatiques sont de la plus haute importance pour faire la lumière sur les voies biochimiques développées par les cellules bactériennes pour dégrader ces molécules, qui pourraient être nocives pour la santé humaine. De plus, les ERCD pourraient également être mis en œuvre pour des applications de biosynthèse, en exploitant le clivage de l'anneau spécifique au site effectué par ces enzymes36,37. Leur spécificité de substrat pourrait être affinée pour la biosynthèse de produits chimiques fins.

Une analyse de bioprospection publiée précédemment sur Novosphingobium sp. Le génome de PP1Y a révélé une abondance remarquable de RCD permettant probablement à la souche PP1Y de métaboliser des mélanges complexes de catéchols issus de l'oxydation simultanée de plusieurs hydrocarbures aromatiques mono- et polycycliques, qui sont les substrats de croissance préférés de cette souche29,30.

Ce travail décrit une caractérisation cinétique de quatre ERCD précédemment isolés de Novosphingobium sp. PP1Y30. Leur spécificité de substrat a été étudiée et la biodégradation complète de 4-OHE2 a été obtenue en utilisant la protéine PP00124, avec des cellules entières recombinantes ou des lysats cellulaires.

Les paramètres cinétiques sur CAT, 3-MC, 4-MC et 2,3-DHBP des 4 ERCD ont été déterminés. Les données obtenues ont confirmé l'analyse de modélisation/amarrage d'homologie précédemment effectuée pour les enzymes dans D'Argenio et al. (30 et Figure supplémentaire S7). En effet, la protéine PP00193 avait l'efficacité la plus élevée pour la dégradation des composés monoaromatiques, montrant des valeurs de kcat/KM allant de 115 à 64 s−1 µM−1. Ces valeurs semblaient être comparables ou même supérieures à celles décrites pour des enzymes similaires de Pseudomonas putida mt-2 et Burkholderia sp. LB40038,39,40. La protéine PP00124 a montré une activité comparable sur tous les substrats que nous avons testés, mais avec une efficacité supérieure vis-à-vis du 2,3-DHBP. Globalement, même si les valeurs de kcat/KM des protéines PP00124 et PP00193 vis-à-vis de ce substrat n'étaient pas supérieures à celles décrites pour d'autres biphényl dioxygénases (comme celles de Sphingomonas sp. RW1 et Burkholderia sp. LB400), ces protéines de la souche PP1Y sont dotées avec la capacité de cliver plusieurs catéchols 3- et/ou 4-substitués, ce qui n'a pas été décrit pour d'autres enzymes déjà caractérisées dans la littérature40,41. A l'inverse, la protéine PP26077 avait une très faible activité sur ces substrats et comme attendu, elle semble avoir une plus grande affinité pour les molécules avec un substituant perpendiculaire au cycle aromatique, comme dans le 2,3-DHBP.

En ce qui concerne le clivage du 4-OHE2, PP00124 s'est avéré être le meilleur catalyseur. L'analyse HPLC-MS/MS a mis en évidence la bioconversion complète du substrat après 15 minutes de réaction. Aucune conversion de 2-OHE2 n'a été observée, suggérant ainsi une spécificité étroite de l'enzyme pour les structures de cycles A substitués en 2,3. Le clivage proximal par l'estradiol du cycle catécholique substitué en 3 ou 4 pour former le 2-hydroxymuconate semialdéhyde avec l'insertion de deux atomes de dioxygène a été observé, comme prévu pour le mécanisme de réaction des ERCD, par la génération d'un produit de 323,187 m/z (287 + 36 = 323 m/z ions)34,38. Les résultats ont cependant montré la génération également d'un composé de 305,176 m/z, probablement dérivé d'une cyclisation intramoléculaire spontanée, avec élimination d'une molécule d'eau. Sur la figure 5, une représentation de la structure hypothétique du produit de cyclisation est montrée. Les deux produits semblaient être générés en même temps et rester en équilibre dans le temps au cours de la réaction (Fig. 6). L'hypothèse pourrait être avancée que le produit de cyclisation est généré à partir du produit de méta-clivage semi-aldéhydique par une attaque nucléophile et une déshydratation et la formation d'un cycle hétérocyclique en position A (Fig. 5). D'autres travaux ont décrit la formation d'un composé hétérocyclique similaire, l'acide pyridinestrone, par une réaction abiotique spontanée en présence d'un donneur d'azote dans le milieu24. Par conséquent, la génération d'un produit secondaire similaire, tel qu'un produit de cyclisation, est conforme aux données précédemment rapportées. Même si des analyses supplémentaires seraient nécessaires pour la caractérisation complète du mécanisme de réaction, nos données suggèrent que PP00124 de Novosphingobium sp. PP1Y comme biocatalyseur efficace pour la biodégradation du 4-OHE2. Au meilleur de notre connaissance, nous décrivons ici l'isolement et l'identification de Novosphingobium sp. PP1Y du premier ERCD capable de dégrader directement le 4-OHE2 via méta clivage et probablement impliqué dans la voie i) 4,5 seco. Même si la biodégradation du 4-OHE2 a déjà été signalée et identifiée comme une possible voie de dégradation naturelle chez Rhodococcus sp. ED6 et Sphingomonas sp. ED8 par Kurisu et al.19, à notre connaissance PP00124 de Novosphingobium sp. PP1Y est le premier ERCD caractérisé à cliver ce substrat. A l'inverse, plusieurs travaux récents décrivent la caractérisation d'enzymes microbiennes impliquées dans les voies de dégradation ii), iv) et iv.i) (Fig. 1) impliquant le clivage du noyau œstrogénique de 4-OHE1. Cependant, dans ces exemples, une déshydrogénation initiale du cycle D sur E2 et une conversion dans E1 est toujours la première étape (Fig. 1)24,26,27,28.

Enfin, dans ce travail, des expériences de bioconversion de cellules entières ont mis en évidence certains avantages intéressants de l'utilisation de cellules entières recombinantes, par rapport aux bactéries natives, comme biocatalyseurs. Plusieurs travaux ont rapporté la biodégradation des œstrogènes en utilisant différentes souches environnementales ou consortiums35. Même si cette approche pourrait être très bénéfique à des fins de bioremédiation, nous soulignons ici les avantages de l'utilisation de souches recombinantes pour améliorer la biodégradation de composés spécifiques. En fait, les cellules entières d'E. coli dans lesquelles l'expression recombinante de PP00124 a été induite ont pu dégrader efficacement le 4-OHE2 avec une efficacité élevée et en peu de temps, suggérant ainsi que le protocole de bioconversion des cellules entières pourrait être envisagé comme une approche efficace pour éviter les étapes chronophages et coûteuses de la purification des protéines. De plus, une approche similaire pourrait être émise pour la dégradation de différents composés récalcitrants qui sont encore mal métabolisés à partir de souches et de consortiums environnementaux de type sauvage.

Des cultures bactériennes, des purifications de plasmides et des transformations ont été réalisées selon Sambrook et al.42. La concentration en protéines a été mesurée avec le Bio-Rad Protein Assay en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme standard. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE) a été réalisée en utilisant des techniques standard et colorée au bleu brillant de Coomassie G-250. Les étalons 4-OHE2 et 2-OHE2 ont été achetés auprès de Cayman Chemicals. La croissance bactérienne a été suivie en mesurant la densité optique à 600 nm, DO/mL, appelée DO600. Le milieu riche en LB (milieu Luria Bertani) a été préparé comme décrit dans Sambrook et al.42.

Le plasmide pET22b(+) contenant les orfs codant pour les protéines PP28735, PP26077, PP00124 et PP00193 a été utilisé pour transformer des cellules compétentes E. coli BL21(DE3) selon Sambrook et al.42. Les colonies ont été inoculées dans un tube Falcon stérile de 50 mL contenant 12,5 mL de milieu LB additionné de 100 µg/mL d'ampicilline (amp). Les cultures ont été incubées à 37 ° C sous agitation constante jusqu'à ~ 0,7 OD600. Le préinoculum a été dilué à 1:50 dans 500 mL de LB/amp et incubé sous agitation constante à 37 °C jusqu'à DO600 de 0,6 à 0,7. L'expression a été induite en ajoutant 0,1 mM Fe(SO4)2(NH4)2 et IPTG entre 0,025 et 0,4 mM. La croissance a été poursuivie à 28 ° C ou 37 ° C pendant 2 ou 4 h supplémentaires (Figure supplémentaire S2). Les cellules ont ensuite été collectées par centrifugation (5524 × g pendant 15 min à 4 ° C) et les culots cellulaires ont été stockés à - 80 ° C jusqu'à leur utilisation. La pâte cellulaire obtenue à partir d'expériences d'expression à grande échelle a d'abord été mise en suspension dans un tampon de lyse (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 % d'éthanol, 30 % de glycérol, 5 mM de DTT et 0,1 mM de Fe(SO4)2(NH4)2) à un concentration finale de 50 à 100 DO600, puis interrompue par sonication (20 fois pour un cycle de 15″ allumé et 55″ éteint, sur glace). Les fractions solubles et insolubles des cultures induites ont été séparées par centrifugation à 22 100 × g pendant 30 min à 4 ° C et le surnageant a été collecté et filtré à travers une membrane PVDF Millipore de 0, 45 μm.

Les protéines PP26077, PP00124 et PP00193 ont été purifiées par lots sur une résine échangeuse d'anions Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotech). Les échantillons ont été incubés 1 h avec la résine sous agitation constante à 4 ° C, et les protéines non liées ont été éliminées par centrifugation et trois lavages ultérieurs dans un tampon de lyse. L'élution a été réalisée par une méthode par étapes dans un tampon de lyse contenant 0,2, 0,4, 0,6 et 0,8 M de NaCl. La résine a été incubée 3 fois avec chaque solution pendant 10 min sous agitation constante à 4°C. Les fractions ont été recueillies par centrifugation et stockées à - 80 ° C sous atmosphère d'azote. La pureté des échantillons a été évaluée par SDS-PAGE. La présence d'ERCD recombinants actifs a été détectée en réalisant le test enzymatique sur le 2,3-DHBP, comme décrit ci-dessous. De plus, toutes les manipulations ont été effectuées sous un flux d'azote constant pour éviter une oxydation excessive du fer.

La protéine PP28735 a été purifiée par chromatographie sur colonne de Q Sepharose FF. L'élution des protéines a été réalisée par un gradient linéaire de 0 à 0,5 M de NaCl dans du tampon de lyse à un débit de 15 mL/h. La présence de l'ERCD recombinant actif a été détectée en réalisant le dosage enzymatique sur le 2,3-DHBP. Les fractions pertinentes ont été analysées par SDS-PAGE, regroupées, purgées à l'azote et stockées à - 80 ° C jusqu'à utilisation.

La teneur en fer total a été déterminée par colorimétrie par complexation avec le Ferene S43 (3-(2-pyridyl)-5,6-bis [acide 2-(5-furylsulfonique)]-1,2,4-triazine, sel disodique), un agent chélatant spécifique du Fe(II), qui donne lieu à la formation d'un complexe coloré dont l'absorption est mesurée à une longueur d'onde de 593 nm (ε593nm = 34,32 mM-1 cm-1). Pour déterminer la quantité totale de Fe [Fe (II) + Fe (III)], le dosage a été effectué également en présence de vitamine C (concentration finale 6 mM) pour réduire Fe (III) en Fe (II). La quantité de Fe (III) a été calculée en soustrayant la quantité de Fe (II) (mesurée en l'absence de vitamine C) de la quantité totale de Fe (mesurée en présence de vitamine C). Les courbes d'étalonnage pour Fe (II) et Fe (III) ont été obtenues en testant des quantités connues (5 à 20 nmol) de Fe(NH4)2(SO4)2 et FeCl3, respectivement. L'étape chromatographique nécessitant la présence de Fe(II) et de DTT dans le tampon d'élution, il a été nécessaire d'éliminer ces réactifs. A cet effet, une chromatographie d'exclusion moléculaire basse pression a été réalisée sur une colonne pré-garnie PD-10 de Pharmacia (taille de colonne : 0,8 cm x 5 cm avec un volume total de résine égal à 9,1 mL). L'élution a été réalisée à température ambiante dans un tampon Tris/HCl 50 mM pH 7,5, 10 % Glycérol, 0,2 M NaCl.

L'activité des ERCD a été déterminée à 25 ° C en mesurant leur activité spécifique (SA) à l'aide de CAT, 3-MC, 4-MC et 2,3-DHBP. Des solutions mères de substrats ont été préparées à 100 mM dans de l'eau pour CAT, 3MC, 4MC et dans du diméthylformaldéhyde (DMF) pour le 2,3-DHBP. Leur concentration a été mesurée par spectrophotométrie dans HCl 10 mM. Les échantillons ont été dosés à 25 °C dans un volume total de 1 ml de Tris/HCl 50 mM pH 7,5 contenant le substrat à une concentration finale de 1 mM. Les réactions ont été démarrées en ajoutant des quantités variables de cellules recombinantes entières (0,03 à 0,3 DO600), de fractions solubles de lysats cellulaires (0,03 à 0,3 DO600) ou de protéines purifiées (1 à 50 µg) et contrôlées par spectrophotométrie dans le temps pendant 3 min après la formation de les produits semi-aldéhydes cis-muconiques correspondants. L'absorbance a été enregistrée au λmax de chaque produit de substrat (tableau supplémentaire S2) toutes les 5 s. Le λmax et les coefficients d'extinction (ε) utilisés pour calculer la quantité de chaque produit obtenu ont été rapportés dans le tableau supplémentaire S2. Une unité d'enzyme a été définie comme la quantité d'enzyme qui libère une µmole de semialdéhyde cis-muconique par minute à 25 °C.

Des solutions mères de substrats ont été préparées 100 mM dans de l'éthanol. Leur concentration a été mesurée par spectrophotométrie dans HCl 10 mM en enregistrant l'absorbance à leur λmax correspondant à 276 nm et 286 nm pour 4-OHE2 et 2-OHE2, respectivement. ε de 3-MC et 4-MC (tableau supplémentaire S2) ont été utilisés pour 4-OHE2 et 2-OHE2, respectivement. Les tests d'activité ont été effectués dans un tampon Tris/HCl 50 mM pH 7,5, à 25 °C, avec des quantités variables de cellules recombinantes entières contenant des ERCD (0,03 à 0,3 DO600), des fractions solubles de lysats cellulaires ou des protéines purifiées (1–50 µg , 30–400 mU2,3-DHBP), en présence de 100 µM et 200 µM de 4-OHE2 et 2-OHE2, respectivement, qui représentent leurs limites de solubilité dans des tampons aqueux.

Des expériences temporelles de conversion de 4-OHE2 (100 µM) et de 2-OHE2 (200 µM) ont été réalisées sur un spectrophotomètre UV-Vis Varian Cary 100. Les réactions ont été démarrées en ajoutant les ERCD purifiés (1 à 50 µg) et la formation des produits a été contrôlée à pH 7,5 par le programme Scanning Kinetics dans une gamme de longueurs d'onde de 230 à 500 nm. La conversion du 4-OHE2 (λmax 285 nm) en semialdéhyde (λmax 298 nm) a été suivie par l'enregistrement des spectres d'absorption pendant 4 à 8 min, à 25 °C. A la fin du clivage de 4OHE2, pour convertir le semialdéhyde en forme dianionique jaune (λmax 417 nm, à pH alcalin), du NaOH (concentration finale 100 mM) a été ajouté et le spectre a été enregistré.

De plus, pour simplifier l'identification du substrat 4-OHE2 et de son produit par des analyses HPLC, la réaction contenant le semialdéhyde obtenu après 10 min d'incubation comme décrit ci-dessus, a été additionnée d'acide formique à 1 % et le spectre a été enregistré. Des valeurs λmax de 280 et 305 nm ont été trouvées pour le 4-OHE2 et son semialdéhyde, respectivement à pH acide.

Pour permettre la détermination de l'activité spécifique et des constantes cinétiques et pour quantifier la production de semi-aldéhyde par les ERCD à pH 7,5 (sur le temps d'incubation de la réaction) et à pH 12 (en fin de réaction), le ε pour le produit semi-aldéhydique 4-OHE2 à pH 7,5 et pH 12 ont été déterminés expérimentalement. En bref, la conversion totale de différentes concentrations de substrat d'estradiol (20 µM, 40 µM, 60 µM, 80 µM et 100 µM) a été réalisée en utilisant 400 mU2,3DHBP d'ERCD PP00124 dans un tampon Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. Les spectres ont été enregistrés par le programme Scanning Kinetics comme décrit ci-dessus et les coefficients d'extinction ont été déterminés (ε298 nm à pH 7,5 = 9,1 mM−1 cm−1; ε417 nm à pH 12 = 21,78 mM−1 cm−1) à la longueurs d'onde maximales. Une unité d'activité enzymatique a été définie comme la quantité d'enzyme qui libère une µmole de semialdéhyde par minute à 25 °C.

Les paramètres cinétiques ont été obtenus dans un tampon Tris/HCl 50 mM pH 7,5 en utilisant entre 1 et 50 µg de protéines purifiées et CAT, 3-MC, 4-MC et 2,3-DHBP comme substrats dans la gamme 0,5 µM–16 mM. Le 4-OHE2 a été utilisé à des concentrations finales allant de 0,5 à 100 µM (limite de solubilité dans l'eau). Les réactions ont été suivies pendant 3 min à 25 °C à 375 nm (CAT ; ε375nm = 33 mM-1 cm-1), 388 nm (3-MC ; ε388nm = 13,8 mM-1 cm-1), 382 nm (4- MC ; ε382nm = 28,1 mM−1 cm−1), 434 nm (2,3-DHBP ; ε434nm = 13,2 mM−1 cm−1) et 298 nm (4-OHE2 ; ε298nm = 9,1 mM−1 cm−1) . Les coefficients d'extinction utilisés ont été répertoriés dans le tableau supplémentaire S2. Tous les paramètres cinétiques ont été déterminés par une courbe de régression non linéaire à l'aide de GraphPad Prism 7.

La conversion enzymatique de 4-OHE2 et 2-OHE2 a été réalisée en utilisant l'enzyme PP00124. Les réactions ont été menées comme indiqué dans le paragraphe précédent. En bref, le test a été effectué dans 1 mL de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7,5 à 25 °C, en présence de 100 µM et 200 µM de 4-OHE2 et 2-OHE2, respectivement. Une aliquote (0,5 ml) des mélanges réactionnels a été recueillie avant l'ajout de l'enzyme, et une concentration finale de 1 % d'acide formique a été ajoutée. Les échantillons ont été dilués 100 fois, centrifugés à 22 100 × g pendant 5 min et passés en HPLC comme contrôle négatif (réactions à blanc). Ensuite, du lysat de cellules PP00124 a été ajouté aux échantillons pour initier des réactions. La formation du produit a été suivie par spectrophotométrie sur une durée totale de 15 min, entre 230 et 500 nm, en enregistrant les spectres toutes les 5 s. Ensuite, les réactions ont été arrêtées en ajoutant de l'acide formique à 1 %. Les spectres des semi-aldéhydes ont été enregistrés à pH acide et les échantillons ont été dilués 100 fois, centrifugés à 22 100 × g pendant 5 min et analysés par HPLC.

Une CLHP à pompe binaire Waters 1525 avec un détecteur à réseau de photodiodes (Waters 2996) équipé d'une colonne d'ultrasphères C18 (Beckman Coulter 4,6 mm × 25 cm) a été utilisée. Deux cents microlitres de chaque échantillon ont été injectés. Une élution en gradient linéaire a été réalisée à un débit de 1 mL/min, en utilisant une phase mobile composée de 0,1 % d'acide formique dans l'eau (solvant A) et de 0,1 % d'acide formique dans le méthanol (solvant B). L'élution du 4-OHE2, du 2-OHE2 et des produits correspondants a été réalisée en utilisant le gradient suivant : élution isocratique à 10% de solvant B pendant 3 min, de 10 à 50% de solvant B en 3 min, de 50 à 75% de solvant B en 15 min, de 75 à 90 % de solvant B en 1 min, élution isocratique à 90 % de solvant B pendant 1 min, de 90 à 10 % de solvant B en 1 min, élution isocratique à 10 % de solvant B pendant 3 min. Les spectres du solvant d'élution ont été enregistrés avec le détecteur à barrette de photodiodes entre 230 et 400 nm. Des chromatogrammes ont été générés en surveillant l'absorbance à 280 nm, puisque les substrats et le produit affichent l'absorption à cette longueur d'onde.

Enfin, des aliquotes des mélanges de réaction à blanc et à point final ont également été collectées pour l'analyse LC-MS/MS. Les aliquotes ont été centrifugées à 22 100 × g pendant 30 s. Les surnageants ont été recueillis et de l'acide formique a été ajouté à une concentration finale de 1 % pour arrêter la réaction ; les échantillons ont ensuite été stockés à - 20 ° C pendant la nuit. Ensuite, une extraction liquide-liquide avec de l'acétate d'éthyle a été effectuée pour purifier le 4-OHE2 et les produits de réaction. Cinq volumes d'acétate d'éthyle ont été ajoutés aux échantillons et vortexés pendant 20 s. Les échantillons ont été centrifugés à 22 100 × g pendant 10 min et la phase organique a été recueillie. La phase aqueuse a ensuite été soumise à une deuxième extraction liquide-liquide avec le même protocole. Toutes les phases organiques ont été séchées sous vide et mises en suspension dans 60 μL de MeOH à 50 % pour analyse LC-MS/MS.

L'expression recombinante de la protéine PP00124 a été induite comme décrit précédemment. Des cultures de 250 millilitres de E. coli BL21(DE3) transformées avec le plasmide vide pET22b(+) ont également été cultivées comme témoin négatif. Après 2 h d'induction, les cellules ont été recueillies par centrifugation et mises en suspension à 5 DO600 dans un milieu minimal (50 mM de phosphate de potassium, pH 7,0) additionné de 0,4 % de glucose et de 1 mM de Fe(NH4)2(SO4)2. Enfin, 100 μM de 4-OHE2 ont été ajoutés au milieu et les cellules ont été incubées à 37 ° C sous agitation constante. Des aliquotes de 500 μL ont été prélevées aux moments suivants : 0, 1, 2, 3,5, 5, 7,5, 10 15-, 30-, 60- et 120 min. Les aliquotes ont été centrifugées à 22 100 × g pendant 30 s. Les surnageants ont été recueillis et de l'acide formique a été ajouté à une concentration finale de 1 % pour arrêter la réaction ; les échantillons ont ensuite été stockés à - 20 ° C pendant la nuit. Ensuite, une extraction liquide-liquide avec de l'acétate d'éthyle a été effectuée pour purifier le 4-OHE2 et les produits de réaction obtenus, en suivant la même procédure décrite dans le paragraphe précédent ; Cinq volumes d'acétate d'éthyle ont été ajoutés aux échantillons et vortexés pendant 20 s. Les échantillons ont été centrifugés à 22 100 × g pendant 10 min et la phase organique a été recueillie. La phase aqueuse a ensuite été soumise à une deuxième extraction liquide-liquide avec le même protocole. Toutes les phases organiques ont été séchées sous vide et mises en suspension dans 60 μL de MeOH à 50 % pour analyse LC-MS/MS.

Des analyses quali-quantitatives LC-MS/MS des mélanges réactionnels issus de différentes expériences de bioconversion ont été réalisées sur un spectromètre de masse LTQ-Orbitrap ESI (Thermo-Fisher Scientific) couplé à un système Accela UHPLC (Thermo-Fisher Scientific). La séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne Kinetex C18 (150 × 2 mm, 2,6 μm) (Phenomenex) en utilisant une solution aqueuse d'acide formique à 0,1 % (A) et de méthanol (B) comme phases mobiles, un gradient linéaire de 5 à 30 % de B en 10 min et un débit de 200 μL/min. Les spectres de masse complète (MS1) ont été acquis en mode ions négatifs haute résolution, sur la plage m/z de 125 à 500. Les spectres MS/MS ont été acquis pour l'ion le plus intense détecté dans les spectres MS1 (mode de balayage dépendant), par en -piège la fragmentation.

L'abondance relative du 4-OHE2 et des produits de réaction a été estimée en générant un chromatogramme d'ions extraits pour chaque composé (m/z 287,2 pour le 4-OHE2, pour 323,2 pour le produit de méta-clivage du 4-OHE2 et 305,2 pour le produit de cyclisation du 4-OHE2 (hypothétique) .

Pour chaque composé, la zone de pic la plus élevée enregistrée a été supposée être une zone de 100 %. Le pourcentage de surface aux autres points dans le temps a été calculé par rapport à la surface du pic le plus élevé. Les abondances relatives obtenues aux différents moments ont été tracées en fonction du temps.

Les échantillons ont été analysés en triple et les données ont été rapportées comme la moyenne des zones mesurées.

Les séquences de protéines ERCDs sont disponibles sur la base de données UniProt. Les numéros d'accès sont les suivants : F6IHX1, F6ID78, F6IHP2 et F6IHN4 pour les protéines PP28735, PP26077, PP00124 et PP00193, respectivement.

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FM et VC ont conceptualisé le travail et réalisé la plupart des travaux expérimentaux. FDP et BC ont effectué des analyses HPLC et HPLC–MS/MS. AB a effectué des analyses de protéines. VC, EN, VI et FDP ont révisé les expériences et contribué à l'interprétation des données critiques et revu les travaux. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Valeria Cafaro.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Mensitieri, F., Bosso, A., Dal Piaz, F. et al. Bioconversion du 4-hydroxyestradiol par des dioxygénases à clivage du cycle extradiol de Novosphingobium sp. PP1Y. Sci Rep 13, 1835 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28908-2

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Reçu : 07 juillet 2022

Accepté : 27 janvier 2023

Publié: 01 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-28908-2

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